DB21-T3256-2020-非洲豬瘟病毒等溫擴增快速檢測方法-遼寧省

ICS11.220DB21B41遼寧省地方標準DB21/T3256—2020非洲豬瘟病毒等溫擴增快速檢測方法Loop-mediatedIsothermalAmplification（LAMP）forRapidDetectionforAfricanSwineFeverVirus遼寧省市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB21/XXXXX—XXXX前言本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準由遼寧省農業(yè)農村廳提出并歸口管理。本標準起草單位：遼寧省農業(yè)發(fā)展服務中心、中國科學院微生物研究所、洛陽萊普生信息科技有限公司、遼寧佰瑞生物科技有限公司。本標準主要起草人：楊作豐、周晨陽、李秀梅、王宏燕、楊利敏、董娜、劉文軍、張皓淳、姚偉、劉洋、劉近、吳洪濤、任雪建、趙培、李蓉、章春燕、呂園園、陳騰。本標準發(fā)布實施后，任何單位和個人如有問題和意見建議，均可以通過來電和來函等方式進行反饋，我們將及時答復并認真處理，根據實際情況依法進行評估及復審。歸口管理部門通訊地址：遼寧省農業(yè)農村廳（沈陽市和平區(qū)太原北街2號），聯(lián)系電話標準起草單位通訊地址：遼寧省動物及產品檢疫中心（沈陽市沈河區(qū)萬柳塘路105號甲），聯(lián)系電話IDB21/T3256—2020非洲豬瘟病毒等溫擴增快速檢測方法1范圍本標準規(guī)定了非洲豬瘟病毒等溫擴增快速檢測方法的技術要求。本標準適用于非洲豬瘟疫病的診斷、監(jiān)測及流行病學調查，適用于豬血液、脾臟、淋巴結、腎臟等組織樣品中非洲豬瘟病毒核酸的快速檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實驗室生物安全通用要求3原理非洲豬瘟病毒是一種DNA病毒，該檢測方法利用6條特異性引物和具有鏈置換能力的DNA聚合酶，在等溫環(huán)境下1h內完成擴增，用于非洲豬瘟病毒的核酸檢測。45注：本技術規(guī)范中使用的試劑，除另有說明外，所有實驗使用的試劑等級均為不含DNA或DNase的分析純或生化試劑；1DB21/T3256—20206操作步驟6.1樣品的采集、前處理、存放與運輸6.1.1采樣注意事項采集樣品及樣品前處理過程中應戴一次性手套，樣本間不得交叉污染。6.1.2采樣工具15ml離心管和1.5ml離心管經121±1℃高壓滅菌20min；剪刀、鑷子經160℃干熱滅菌2h，無菌管（真空采血管）。6.1.3組織病料的采集與前處理采集疑似非洲豬瘟病毒感染豬的肺臟、肝臟、腎臟、脾臟等組織樣品，用無菌的剪刀和鑷子剪取待檢樣品約10g于組織勻漿器或研缽中充分勻漿或研磨，加入0.3ml～0.5ml組織懸液混勻，60℃，30min滅活后，將懸液轉入無菌Eppendorf管中，4℃條件下5000r/min離心10min，編號備用。6.1.4全血及血清樣本的采集與前處理使用含有抗凝血劑（EDTA-紫色蓋）的無菌管（真空采血管）從耳靜脈或前腔靜脈采集血液3ml～5ml，60℃，30min滅活后，可直接檢測；若檢測血清，可靜置全血樣本待血清析出后，直接吸取至無菌Eppendorf管中，60℃，30min滅活后，編號備用。采集或處理的樣品在2～8℃條件下保存應不超過24h；若需長期保存，應放置-70℃冰箱，但應避免反復凍融（凍融不超過3次）。采集的樣品密封后，采用保溫壺或保溫桶加冰密封，在8h之內運送到實驗室檢測。按照《獸醫(yī)實驗室生物安全技術管理規(guī)范》進行樣品的生物安全標識。取10μl前處理過的樣本加入無菌1.5ml離心管，加入10μl樣品處理劑，混勻，94℃裂解2min，吸取22μlASFV-R-Mix和1μlBstenzyme加入同一個PCR管，吸取2μl步驟6.2處理的7使用前用陰、陽性對照進行該檢測方法評價，若陽性對照CT值≤40，陰性對照CT值＞40，則檢測結2DB21/T3256—20207.2結果判定若CT值≤40，樣品應判定為非洲豬瘟病毒核酸陽性；若CT值＞40，樣品應判定為非洲豬瘟病毒核酸陰性8實驗室生物安全要求按照GB19489實驗室生物安全通用要求執(zhí)行。3DB21/T3256—2020AA附錄A（規(guī)范性附錄）試劑配制A.1樣品處理劑的制備量取80mlPBS（0.01mol/L，pH值7.4），加入10μlNP40（乙基苯基聚乙二醇），無菌純化水定容至100ml，定量分裝，500μl/管，-20℃保存。A.2ASFV-R-Mix的制備A.2.1引物合成根據非洲豬瘟病毒p72基因片段的保守結構域設計3對引物，包括1對內引物（FIP與BIP）、1對外引物（F3與B3）和1對環(huán)引物（LF與LB），均由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列為：FIP：BIP：F3：B3：LF：LB：5'-TAACGCCACTATGCAGCCCACGGAAGAGCTGAATCTCTATCCT-3'5'-CAACATGTGCGAACTTGTGCCACATACCTGGAACGTCTCC-3'5'-ATAGGTAATGCGATCGGATACA-3'5'-CCAACAATAACCGCCACGC-3'5'-TCGCCACGCAAAGATAAGC-3'5'-AGCCTCGGTGTTGATGCGGATT-3'A.2.2取3對引物（FIP、BIP、F3、B3、LF和LB）干粉，按引物說明書分別加入適量無菌純化水，溶解混勻，得到各引物溶液，置-20℃保存。稱取2.4gTris，0.37g氯化鉀，0.12g硫酸鎂，100μl吐溫-20，7.029g甜菜堿，溶于80ml純化水，依次加入終濃度為1.4mmol/LdNTPs溶液、0.2μmol/L外引物溶液、1.6μmol/L內引物溶液、0.8μmol/L環(huán)引物溶液，加入無菌純化水定容至100ml，經過0.22μm濾器過濾除菌，分裝至2ml藍蓋可立凍存管中，1.1ml/管，-20℃保存。用于制備本試劑盒的Bstenzyme為商品化DNA聚合酶，按使用說明書用純化水稀釋至4×10/L，分6裝至0.5ml白蓋可立凍存管中，100/μl管，-20℃保存。用于制備本試劑盒的D-I礦物