《化妝品原料及產(chǎn)品中膠原蛋白含量的測定 圓二色光譜法》（征求意見稿）

化妝品原料及產(chǎn)品中膠原蛋白含量的測定圓二色光譜法本文件規(guī)定了使用圓二色光譜法測定化妝品原料及產(chǎn)品中膠原蛋白含量的方法。本文件適用于以動(dòng)物皮膚、骨骼等組織為原料，經(jīng)脫脂、酶法處理和精制等工藝獲得的以膠原蛋白為主要成分的化妝品原料及產(chǎn)品。注：有三螺旋結(jié)構(gòu)的重組膠原蛋白的檢測可以參考本文件。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T8170數(shù)值修約規(guī)則與極限數(shù)值的表示和判定GB/T27417合格評定化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南YY/TXXX組織工程醫(yī)療器械膠原蛋白JY/T0572圓二色光譜分析方法通則《中華人民共和國藥典》2020版四部3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1膠原蛋白一類含有至少28種在遺傳學(xué)上不同類型的分泌蛋白質(zhì)家族，主要擔(dān)任機(jī)體的結(jié)構(gòu)支撐功能，具有獨(dú)特的由三條多肽鏈（被稱為α鏈）組成的三螺旋結(jié)構(gòu)，并具有一定的生物學(xué)功能。3.2三螺旋結(jié)構(gòu)構(gòu)成膠原蛋白的三條多肽鏈以右手螺旋的形式構(gòu)成螺旋結(jié)構(gòu)，其中每一條肽鏈均為左手螺旋構(gòu)4原理利用膠原分子中具有光學(xué)活性的基團(tuán)對平面圓偏振光吸收的差異，可以測定溶液狀態(tài)下膠原的構(gòu)象。由于天然膠原具有三螺旋結(jié)構(gòu)，膠原的圓二色光譜（CD光譜）圖在221nm左右的波長處有正峰，在195nm左右的波長處有負(fù)峰，正吸收峰是膠原三螺旋構(gòu)型的圓二色譜典型特征，可以作為膠原三螺旋結(jié)構(gòu)有無的定性判定指標(biāo)。加上負(fù)峰位置，說明膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)完整性。通過采用不同濃度具有完整三螺旋結(jié)構(gòu)的膠原對照，制備系列不同三螺旋結(jié)構(gòu)含量的標(biāo)準(zhǔn)樣品，測定其221nm處的峰高，獲得定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于供試品膠原蛋白相對含量的計(jì)算。5材料5試劑和材料5.1冰醋酸，色譜純；5.2膠原蛋白對照品（建議使用I型膠原蛋白國家有證標(biāo)準(zhǔn)樣品）；5.3比色皿，選擇干凈、無裂紋、劃痕和斑點(diǎn)、透光率高的比色皿；5.4氮?dú)?，按儀器要求選擇純度≤99.99%的氮?dú)膺M(jìn)行吹掃。6儀器和設(shè)備6.1分析天平，十萬分之一；6.2離心機(jī)，轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)速10000r/min；6.3圓二色光譜儀。7檢測方法7.1待測樣品制備稱取5mg膠原蛋白供試品，加入0.5%醋酸溶液，置于10mL容量瓶中，定容至10mL，混合均勻，配制成濃度為0.5mg/mL膠原溶液，10000r/min離心5min，取上清液備用。注：液體樣品參考終體積濃度為0.5mg/mL膠原溶液制備。7.2膠原蛋白對照品梯度溶液制備稱取5mg膠原蛋白對照品，加入0.5%醋酸溶液，置于10ml容量瓶中，定容至10ml，搖晃均勻，配制成濃度為0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL的膠原梯度溶液。7.3檢測條件取配制后的膠原蛋白對照品/供試品溶液，加入石英比色皿，置于CD光譜儀上進(jìn)行檢測，使用0.5%醋酸溶液作為參比。供試品均平行測定三次，取平均值。樣品池光徑：1mm；掃描范圍：180nm～260nm；掃描波長：0.1nm；掃描速度：120nm/min。7.4準(zhǔn)確度和精密度要求線性R值≥0.95；精密度：用相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，RSD≤1%。7.5標(biāo)準(zhǔn)曲線制作測定膠原蛋白對照品梯度溶液在221nm處的峰高，以峰高為縱坐標(biāo)，膠原蛋白濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出回歸方程和相關(guān)系數(shù)（1用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對樣品進(jìn)行定量。Y=ac+b,R2(1)式中：C——膠原蛋白濃度；Y——221nm處的峰高；a——常數(shù)；R2——相關(guān)系數(shù)。7.6數(shù)據(jù)處理用儀器自帶軟件導(dǎo)出帶有實(shí)驗(yàn)記錄數(shù)據(jù)的Excel文件，并用Origin軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)做圖形化處理，得到橫坐標(biāo)為221nm處對應(yīng)的縱坐標(biāo)數(shù)值（峰高）。8實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析8.1定性分析a)在221nm～222nm出現(xiàn)正峰，在195nm～200nm出現(xiàn)負(fù)峰，且絕對值的比值處于0.09～0.15之間,則判定供試品有三螺旋結(jié)構(gòu)。b)在221nm處未檢測出正峰，表明供試品沒有三螺旋結(jié)構(gòu)。8.2定量分析將按7.1步驟制備的待測樣品溶液在7.3條件下測試后，將樣品在221nm處的峰高的代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(1)進(jìn)行計(jì)算，即得到供試品中膠原蛋白的濃度。供試品中膠原蛋白含量按式（2）進(jìn)行計(jì)算。(1)式中：X——試樣中膠原蛋白的百分含量，%；