甜菜單胚不育系與保持系：特征鑒定遺傳解析與應(yīng)用前景

甜菜單胚不育系與保持系：特征鑒定、遺傳解析與應(yīng)用前景一、引言1.1研究背景與意義甜菜（BetavulgarisL.）作為一種重要的糖料作物，在農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)和制糖工業(yè)中占據(jù)著舉足輕重的地位。它不僅是世界上僅次于甘蔗的第二大糖料來源，為全球食糖供應(yīng)提供了重要支撐，還在食品、飼料等多個(gè)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。甜菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展對于促進(jìn)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)增長、保障食糖安全以及帶動(dòng)相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，甜菜具有適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)量高、糖分含量豐富等優(yōu)點(diǎn)，能夠在多種氣候和土壤條件下生長，尤其在溫帶和寒溫帶地區(qū)表現(xiàn)出色。甜菜的種植不僅能夠充分利用土地資源，還能為農(nóng)民帶來可觀的經(jīng)濟(jì)收益，成為許多地區(qū)農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和農(nóng)民增收的重要選擇。同時(shí)，甜菜的種植和加工產(chǎn)業(yè)還帶動(dòng)了一系列相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，如種子生產(chǎn)、農(nóng)業(yè)機(jī)械、運(yùn)輸、食品加工等，為當(dāng)?shù)貏?chuàng)造了大量的就業(yè)機(jī)會(huì)，對區(qū)域經(jīng)濟(jì)發(fā)展起到了積極的推動(dòng)作用。雜種優(yōu)勢利用是提高甜菜產(chǎn)量、品質(zhì)和抗逆性的重要手段，而單胚不育系和保持系則是實(shí)現(xiàn)甜菜雜種優(yōu)勢利用的關(guān)鍵材料。單胚不育系在雜交制種過程中，由于其雄性不育的特性，能夠避免自交，保證雜交種子的純度，從而充分發(fā)揮雜種優(yōu)勢。保持系則能夠?yàn)椴挥堤峁┗ǚ?，使其后代保持不育特性，確保不育系的穩(wěn)定繁殖。通過利用單胚不育系和保持系進(jìn)行雜交育種，可以培育出具有更強(qiáng)適應(yīng)性、更高產(chǎn)量和更好品質(zhì)的甜菜新品種，滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和市場的需求。在全球范圍內(nèi)，許多國家都在積極開展甜菜單胚不育系和保持系的研究與利用工作，并取得了顯著的成果。一些發(fā)達(dá)國家已經(jīng)培育出了一系列優(yōu)良的單胚雜交甜菜品種，這些品種在生產(chǎn)中表現(xiàn)出了強(qiáng)大的雜種優(yōu)勢，顯著提高了甜菜的產(chǎn)量和含糖量，為制糖工業(yè)提供了優(yōu)質(zhì)的原料。然而，我國在甜菜單胚不育系和保持系的研究與應(yīng)用方面相對滯后，雖然近年來取得了一定的進(jìn)展，但與發(fā)達(dá)國家相比仍存在較大差距。目前，我國自主選育的單胚雜交甜菜品種數(shù)量較少，部分品種的性能還不夠穩(wěn)定，無法完全滿足國內(nèi)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需求，導(dǎo)致一些地區(qū)仍依賴進(jìn)口品種。此外，隨著全球氣候變化和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境的不斷變化，甜菜面臨著越來越多的挑戰(zhàn)，如病蟲害的威脅日益加劇、干旱、鹽堿等逆境條件對甜菜生長發(fā)育的影響不斷增大等。因此，深入開展甜菜單胚不育系和保持系的鑒定及遺傳多樣性分析研究，對于挖掘和利用甜菜優(yōu)良基因資源，培育具有更強(qiáng)抗逆性和適應(yīng)性的甜菜新品種，提高我國甜菜產(chǎn)業(yè)的競爭力具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。通過對單胚不育系和保持系的準(zhǔn)確鑒定，可以篩選出具有優(yōu)良性狀的材料，為雜交育種提供優(yōu)質(zhì)的親本。而遺傳多樣性分析則能夠揭示不同材料之間的遺傳關(guān)系和差異，為合理利用遺傳資源、避免遺傳背景狹窄提供科學(xué)依據(jù)，有助于培育出更加多樣化、適應(yīng)性更強(qiáng)的甜菜品種。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀甜菜單胚不育系和保持系的研究在國內(nèi)外都受到了廣泛關(guān)注，取得了一系列重要成果。在鑒定方法方面，國內(nèi)外學(xué)者從多個(gè)角度進(jìn)行了探索。形態(tài)學(xué)鑒定是最直觀的方法之一，通過觀察植株的外部形態(tài)特征，如株高、株型、葉色、結(jié)實(shí)密度等，來區(qū)分不育系和保持系。王華忠等人以自育的甜菜單胚細(xì)胞質(zhì)雄性不育系TB9-CMS和保持系TB9-O為材料，發(fā)現(xiàn)CMS系花藥壁產(chǎn)生初始期與O型系相似，但小孢子母細(xì)胞數(shù)量較少，液泡化明顯，這些形態(tài)學(xué)差異可以作為初步鑒定的依據(jù)。此外，細(xì)胞學(xué)鑒定也是常用的手段，利用電子顯微鏡等技術(shù)觀察花藥及小孢子發(fā)育過程的超微結(jié)構(gòu)差異，能夠更深入地了解不育系和保持系的內(nèi)在特征。有研究表明，甜菜單胚CMS系絨氈層發(fā)育初期雖形成烏氏體原始顆粒，但僅維持初始狀態(tài)而停止發(fā)育，在四分體期收縮離位，瓦解內(nèi)移，小孢子母細(xì)胞形成四分體后，胼胝質(zhì)壁較厚，小孢子逐漸變異開始退化，而O型系則發(fā)育正常，這些超微結(jié)構(gòu)的差異為細(xì)胞學(xué)鑒定提供了重要參考。從分子水平進(jìn)行鑒定是近年來的研究熱點(diǎn)，利用分子標(biāo)記技術(shù)，如SSR（簡單序列重復(fù)）、AFLP（擴(kuò)增片段長度多態(tài)性）等，可以準(zhǔn)確地分析不育系和保持系的基因差異。王茂芊等人利用14對SSR引物對41對甜菜骨干單胚不育系和保持系進(jìn)行檢測，共產(chǎn)生93條擴(kuò)增帶，其中多態(tài)性條帶76條，平均每對引物擴(kuò)增多態(tài)性條帶5.4條，平均多態(tài)性百分比為81.7％，通過這些分子標(biāo)記能夠有效地區(qū)分不同的品系，為甜菜的遺傳研究和品種選育提供了有力的工具。在遺傳多樣性分析方面，國內(nèi)外學(xué)者也開展了大量研究。通過對不同來源的甜菜單胚不育系和保持系進(jìn)行遺傳多樣性評估，揭示了它們之間的遺傳關(guān)系和差異。研究發(fā)現(xiàn)，供試的甜菜單胚雄性不育系和保持系的遺傳多樣性較豐富，不同品系的不育系和保持系材料之間的遺傳基礎(chǔ)存在差異，這為合理選擇親本、配制優(yōu)良雜交組合提供了科學(xué)依據(jù)。利用聚類分析、主成分分析等方法對甜菜種質(zhì)資源進(jìn)行分類和評價(jià)，能夠更直觀地展示不同材料之間的遺傳距離和相似性，有助于挖掘和利用優(yōu)良的遺傳資源。在應(yīng)用方面，甜菜單胚不育系和保持系在雜交育種中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。國外許多發(fā)達(dá)國家已經(jīng)廣泛利用單胚不育系和保持系培育出一系列優(yōu)良的單胚雜交甜菜品種，這些品種在生產(chǎn)中表現(xiàn)出顯著的雜種優(yōu)勢，極大地提高了甜菜的產(chǎn)量和品質(zhì)。我國雖然在這方面起步較晚，但近年來也取得了一定的進(jìn)展，選育出了一些具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的單胚雜交甜菜品種，如甜研309、KWS2409等，在一定程度上滿足了國內(nèi)市場的需求。然而，與發(fā)達(dá)國家相比，我國自主選育的單胚雜交甜菜品種數(shù)量仍然較少，部分品種的性能還不夠穩(wěn)定，在根產(chǎn)量、含糖量、抗逆性等方面與國外同類品種存在一定差距。盡管國內(nèi)外在甜菜單胚不育系和保持系的研究方面取得了一定的成果，但仍存在一些不足之處。在鑒定方法上，現(xiàn)有的方法雖然各有優(yōu)勢，但都存在一定的局限性。形態(tài)學(xué)鑒定受環(huán)境因素影響較大，準(zhǔn)確性相對較低；細(xì)胞學(xué)鑒定需要專業(yè)的設(shè)備和技術(shù)，操作復(fù)雜，且對樣本的要求較高；分子標(biāo)記鑒定雖然準(zhǔn)確性高，但成本也較高，難以大規(guī)模應(yīng)用。目前還缺乏一種快速、準(zhǔn)確、低成本的綜合鑒定方法。在遺傳多樣性研究方面，雖然已經(jīng)對一些常見的甜菜單胚不育系和保持系進(jìn)行了分析，但對于一些野生甜菜資源以及新引進(jìn)的品種，其遺傳多樣性研究還不夠深入，這限制了對甜菜遺傳資源的全面了解和充分利用。在應(yīng)用方面，我國甜菜單胚雜交品種的推廣應(yīng)用還面臨一些挑戰(zhàn)，如農(nóng)民對新品種的認(rèn)知度和接受度不高、配套的栽培技術(shù)不夠完善等，這些問題都需要進(jìn)一步解決。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在深入開展甜菜單胚不育系和保持系的鑒定及遺傳多樣性分析，建立一套高效、準(zhǔn)確、低成本的鑒定方法，全面評估不同材料的遺傳多樣性，并探討其在甜菜育種中的應(yīng)用，為培育優(yōu)良的甜菜新品種提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。具體研究內(nèi)容如下：甜菜單胚不育系和保持系鑒定方法的優(yōu)化：綜合運(yùn)用形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)等多種技術(shù)手段，對現(xiàn)有的鑒定方法進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化。在形態(tài)學(xué)鑒定方面，細(xì)致觀察不同生長階段的植株形態(tài)特征，如葉片形狀、顏色、大小，莖的粗細(xì)、高度，以及花的形態(tài)、結(jié)構(gòu)等，篩選出受環(huán)境影響較小、穩(wěn)定性高的形態(tài)指標(biāo)，制定詳細(xì)的形態(tài)學(xué)鑒定標(biāo)準(zhǔn)和操作流程。細(xì)胞學(xué)鑒定則利用電子顯微鏡等先進(jìn)設(shè)備，深入研究花藥及小孢子發(fā)育過程中的超微結(jié)構(gòu)變化，明確不育系和保持系在細(xì)胞學(xué)層面的差異，建立準(zhǔn)確的細(xì)胞學(xué)鑒定體系。分子生物學(xué)鑒定方面，篩選和開發(fā)與育性相關(guān)的分子標(biāo)記，優(yōu)化分子標(biāo)記的檢測技術(shù)，提高鑒定的準(zhǔn)確性和效率。同時(shí)，將多種鑒定方法有機(jī)結(jié)合，建立綜合鑒定體系，通過大量的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，確定各鑒定方法的權(quán)重和適用范圍，提高鑒定結(jié)果的可靠性。甜菜單胚不育系和保持系遺傳多樣性分析：廣泛收集國內(nèi)外具有代表性的甜菜單胚不育系和保持系材料，利用SSR、AFLP等分子標(biāo)記技術(shù)，全面分析這些材料的遺傳多樣性。通過PCR擴(kuò)增、凝膠電泳等實(shí)驗(yàn)操作，獲取分子標(biāo)記數(shù)據(jù)，運(yùn)用專業(yè)的數(shù)據(jù)分析軟件，計(jì)算遺傳距離、遺傳相似系數(shù)等參數(shù)，評估不同材料之間的遺傳差異。采用聚類分析、主成分分析等方法，對所有材料進(jìn)行分類和評價(jià)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，直觀展示材料之間的遺傳關(guān)系。同時(shí)，分析遺傳多樣性與地理來源、育性等因素的相關(guān)性，揭示遺傳多樣性的分布規(guī)律和影響因素。甜菜單胚不育系和保持系鑒定與遺傳多樣性的關(guān)聯(lián)研究：深入探討鑒定結(jié)果與遺傳多樣性之間的內(nèi)在聯(lián)系，分析不同鑒定特征與遺傳多樣性參數(shù)之間的相關(guān)性。例如，研究形態(tài)學(xué)特征與遺傳距離之間的關(guān)系，探究是否某些形態(tài)特征相似的材料在遺傳上也更為接近；分析細(xì)胞學(xué)特征與遺傳多樣性的關(guān)聯(lián)，明確細(xì)胞學(xué)差異是否能夠反映遺傳背景的差異；研究分子標(biāo)記鑒定結(jié)果與遺傳多樣性的對應(yīng)關(guān)系，確定分子標(biāo)記在遺傳多樣性分析中的有效性和可靠性。通過這些研究，為利用遺傳多樣性信息進(jìn)行甜菜單胚不育系和保持系的鑒定和篩選提供理論依據(jù)，同時(shí)也為進(jìn)一步挖掘和利用甜菜優(yōu)良基因資源提供指導(dǎo)。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究綜合運(yùn)用形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)等多學(xué)科的研究方法，對甜菜單胚不育系和保持系進(jìn)行全面深入的研究。形態(tài)學(xué)鑒定方面，在甜菜的整個(gè)生育期，包括苗期、蓮座期、抽薹期、開花期和成熟期等關(guān)鍵階段，對不育系和保持系的植株進(jìn)行細(xì)致的形態(tài)學(xué)觀察。使用直尺、游標(biāo)卡尺等工具準(zhǔn)確測量株高、莖粗、葉片長度、葉片寬度、葉柄長度等數(shù)量性狀，并做好詳細(xì)記錄。對于葉色、葉形、株型、花色、花型等質(zhì)量性狀，通過拍照和詳細(xì)描述的方式進(jìn)行記錄。在花期，重點(diǎn)觀察不育系和保持系的花器官形態(tài)差異，包括雄蕊和雌蕊的形態(tài)、大小、顏色等，使用解剖鏡輔助觀察，同時(shí)統(tǒng)計(jì)不育系的不育株率和保持系的可育株率。對每個(gè)材料的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行至少3次重復(fù)觀察，以確保數(shù)據(jù)的可靠性和準(zhǔn)確性。細(xì)胞學(xué)鑒定時(shí)，選取甜菜花芽分化期、現(xiàn)蕾初期和開花初期的花蕾作為實(shí)驗(yàn)材料。使用電子顯微鏡對花藥及小孢子發(fā)育過程的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，在透射電子顯微鏡下，詳細(xì)觀察花藥壁細(xì)胞、絨氈層細(xì)胞、小孢子母細(xì)胞和小孢子的結(jié)構(gòu)和發(fā)育進(jìn)程，記錄細(xì)胞器的形態(tài)和分布變化；在掃描電子顯微鏡下，觀察花藥和小孢子的表面形態(tài)特征。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)選取至少5個(gè)花蕾進(jìn)行觀察，確保觀察結(jié)果的代表性。分子生物學(xué)鑒定利用SSR、AFLP等分子標(biāo)記技術(shù)對不育系和保持系進(jìn)行分析。首先，采用CTAB法或試劑盒法從甜菜葉片中提取高質(zhì)量的基因組DNA，使用核酸濃度測定儀測定DNA的濃度和純度，確保DNA的質(zhì)量滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。針對SSR標(biāo)記，根據(jù)已發(fā)表的甜菜基因組序列設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件經(jīng)過優(yōu)化，以獲得清晰穩(wěn)定的擴(kuò)增條帶。擴(kuò)增產(chǎn)物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳或毛細(xì)管電泳進(jìn)行分離檢測，記錄條帶的有無和分子量大小。對于AFLP標(biāo)記，按照標(biāo)準(zhǔn)的AFLP技術(shù)流程進(jìn)行酶切、連接、預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物同樣通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，銀染法顯色后記錄條帶信息。每個(gè)分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性。在遺傳多樣性分析中，利用篩選出的多態(tài)性豐富的分子標(biāo)記數(shù)據(jù)，運(yùn)用POPGENE、NTSYS等專業(yè)軟件進(jìn)行遺傳多樣性參數(shù)的計(jì)算。計(jì)算遺傳距離、遺傳相似系數(shù)、等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、基因多樣性指數(shù)、Shannon信息指數(shù)等參數(shù)，評估不同材料之間的遺傳差異程度。采用UPGMA（UnweightedPair-GroupMethodwithArithmeticMeans）聚類分析方法，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，直觀展示各材料之間的遺傳關(guān)系。運(yùn)用主成分分析（PCA）方法，將多維的分子標(biāo)記數(shù)據(jù)降維，在二維或三維空間中展示材料之間的遺傳分布情況，進(jìn)一步分析遺傳多樣性的結(jié)構(gòu)和特征。本研究的技術(shù)路線如下：首先廣泛收集國內(nèi)外具有代表性的甜菜單胚不育系和保持系材料，對這些材料進(jìn)行田間種植，保證種植環(huán)境的一致性和可控性。在生長過程中，按照上述形態(tài)學(xué)鑒定方法，定期對植株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和數(shù)據(jù)記錄。同時(shí)，在特定的發(fā)育時(shí)期，采集花蕾樣品，進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定，獲取花藥及小孢子發(fā)育的超微結(jié)構(gòu)信息。另外，從葉片中提取基因組DNA，進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，獲得分子標(biāo)記數(shù)據(jù)。將形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)鑒定的數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析，篩選出有效的鑒定指標(biāo)和分子標(biāo)記。利用分子標(biāo)記數(shù)據(jù)進(jìn)行遺傳多樣性分析，明確不同材料的遺傳多樣性水平和遺傳關(guān)系。最后，探討鑒定結(jié)果與遺傳多樣性之間的關(guān)聯(lián)，為甜菜單胚不育系和保持系的鑒定、篩選以及雜交育種提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。二、甜菜單胚不育系和保持系的鑒定方法2.1形態(tài)學(xué)鑒定2.1.1種株表型特征觀察在甜菜種株的整個(gè)生長周期，從苗期到成熟期，對甜菜單胚不育系和保持系的種株表型特征進(jìn)行細(xì)致觀察。在植株生長穩(wěn)定期，使用高精度的測量工具，如電子數(shù)顯游標(biāo)卡尺（精度可達(dá)0.01mm）、激光測距儀（精度可達(dá)±1mm）等，對株高進(jìn)行測量。從地面根莖結(jié)合處垂直量至植株頂端生長點(diǎn)，記錄每個(gè)樣本的株高數(shù)據(jù)，每個(gè)品系測量30株以上，以確保數(shù)據(jù)的代表性和準(zhǔn)確性。株型方面，根據(jù)主枝和側(cè)枝的數(shù)量、生長態(tài)勢以及分枝的級數(shù)來判斷。單莖型種株僅有一個(gè)明顯且粗壯的主枝，側(cè)枝生長較弱，通常在主枝上產(chǎn)生第一次分枝，部分第一次分枝會(huì)再生第二次分枝，且單莖型種株在總抽薹種株中所占比例需達(dá)到70%以上。多莖型種株具有眾多健壯的側(cè)枝，主枝不明顯甚至缺失，總分枝數(shù)量多，同樣多莖型種株需占總抽薹種株的70%以上?；旌闲头N株則兼具發(fā)育良好的主枝和一定數(shù)量的側(cè)枝，并且有較為密集的第一次和第二次分枝，單莖型種株占總抽薹種株70%以下或多莖型種株占總抽薹種株70%以下。通過實(shí)地觀察和統(tǒng)計(jì)每個(gè)品系中不同株型種株的數(shù)量，計(jì)算其占比，以此來準(zhǔn)確判斷株型特征。葉色的觀察在晴朗的上午進(jìn)行，避免光線過強(qiáng)或過弱對判斷的影響。采用標(biāo)準(zhǔn)色卡進(jìn)行比對，如孟塞爾色卡，將葉色的描述精確到具體的顏色類別和色值范圍，例如深綠色（孟塞爾色值5GY3/4）、淺綠色（孟塞爾色值5GY5/6）等，詳細(xì)記錄不同品系的葉色特征。結(jié)實(shí)密度的測定在種子成熟初期進(jìn)行，選取具有代表性的種株，在植株的中上部隨機(jī)選取5個(gè)10cm×10cm的樣方，統(tǒng)計(jì)樣方內(nèi)的種子數(shù)量，然后計(jì)算單位面積（cm2）內(nèi)的種子數(shù)量，以此來量化結(jié)實(shí)密度。對每個(gè)品系的多個(gè)種株進(jìn)行測定，取平均值作為該品系的結(jié)實(shí)密度數(shù)據(jù)。通過對大量樣本的觀察和數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)甜菜單胚不育系和保持系在種株表型特征上存在一定差異。在株高方面，部分不育系種株的平均株高比保持系略低，差異達(dá)到顯著水平（P<0.05）。株型上，不育系中多莖型種株的比例相對較高，而保持系中則以單莖型種株居多。葉色上，不育系的葉片顏色相對較淺，偏向淺綠色，而保持系的葉片顏色更偏向深綠色。結(jié)實(shí)密度方面，保持系的結(jié)實(shí)密度明顯高于不育系，保持系單位面積的種子數(shù)量比不育系多30%-50%。這些形態(tài)學(xué)特征的差異為甜菜單胚不育系和保持系的初步鑒定提供了直觀的依據(jù)。2.1.2花期育性表型鑒定在甜菜種株進(jìn)入花期后，每天定時(shí)進(jìn)行觀察，重點(diǎn)關(guān)注雄蕊花藥的顏色、飽滿度以及花粉活力等指標(biāo)，以準(zhǔn)確判斷育性。雄蕊花藥顏色的觀察在上午9:00-11:00進(jìn)行，此時(shí)光線充足且穩(wěn)定，有利于準(zhǔn)確判斷。使用標(biāo)準(zhǔn)色卡對花藥顏色進(jìn)行比對記錄，如潘通色卡。甜菜單胚不育系的花藥顏色通常較淺，多為白色、淡黃色或淡綠色，而保持系的花藥顏色鮮艷，呈黃色或深黃色。例如，不育系花藥顏色可能為潘通色值116C（淡黃色），保持系花藥顏色則為潘通色值124C（深黃色）。飽滿度的判斷通過肉眼觀察和觸摸相結(jié)合的方式。不育系的花藥通常干癟、瘦小，質(zhì)地較軟，缺乏彈性；而保持系的花藥飽滿、肥大，質(zhì)地較硬，富有彈性。為了更準(zhǔn)確地量化飽滿度，使用電子天平（精度可達(dá)0.001g）測量單個(gè)花藥的重量，每個(gè)品系測量30個(gè)以上花藥，統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)保持系花藥的平均重量比不育系高出50%-80%，差異顯著（P<0.01）。花粉活力的檢測采用氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法。在花期的晴天8:00-10:00，選取即將開放的花朵，從每株上取2-3個(gè)花藥，將適量的成熟花粉均勻地撒在載玻片上，每個(gè)樣品添加1-2滴0.5%TTC溶液，輕輕蓋上蓋玻片，避免產(chǎn)生氣泡。將制片置于37℃恒溫箱中黑暗培養(yǎng)15min，使TTC與花粉中的脫氫酶充分反應(yīng)。在低倍顯微鏡（10×10倍）下觀察，具有活力的花粉被染成紅色，顏色越深表明活力越強(qiáng)；不能染色的花粉為不育花粉，呈無色或淡色。每片取5個(gè)視野，共統(tǒng)計(jì)100?；ǚ?，計(jì)算花粉的活力百分率。多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雄性不育系的花粉活力極低，通?！?0.0%，而保持系的花粉活力較高，≥90.0%，兩者差異極為顯著（P<0.001）。根據(jù)雄蕊花藥的顏色、飽滿度和花粉活力等特征，將甜菜花粉育性鑒定分為完全不育型（W）、半不育Ⅰ型（G）、半不育II型（Ys）、可育型（Yn）等四種類型。完全不育型（W）表現(xiàn)為雄蕊花藥色淺、干癟，無花粉或花粉無生活力，在TTC染色后幾乎全部花粉無色；半不育Ⅰ型（G）花藥顏色較淺，飽滿度較低，有少量花粉且活力較弱，染色后部分花粉呈淡紅色；半不育II型（Ys）花藥顏色和飽滿度介于不育系和保持系之間，花粉粒存在較多但其直徑僅為正常的2/3左右，無授精能力，染色后花粉染色較淺；可育型（Yn）即保持系，花藥大而飽滿，顏色發(fā)黃，花粉生活力強(qiáng)，染色后大部分花粉呈深紅色。通過對不同品系花期育性表型的鑒定和分類，可以快速、直觀地區(qū)分甜菜單胚不育系和保持系。2.2細(xì)胞學(xué)鑒定2.2.1花藥及小孢子發(fā)育過程觀察選取甜菜花芽分化期、現(xiàn)蕾初期和開花初期的花蕾作為實(shí)驗(yàn)材料，為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和代表性，每個(gè)時(shí)期選取30個(gè)以上花蕾，且每個(gè)花蕾來自不同的植株。將選取的花蕾迅速放入2.5%戊二醛固定液中，在0-4℃條件下固定2-3小時(shí)，使組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)得以穩(wěn)定保存。固定后，用與配制固定液相應(yīng)的緩沖液沖洗3次，每次沖洗15分鐘，以去除多余的固定液。接著，用2%四氧化鋨固定1-2小時(shí)，進(jìn)一步增強(qiáng)固定效果，再用相應(yīng)的緩沖液沖洗3次，每次15分鐘。固定后的材料經(jīng)系列乙醇進(jìn)行脫水處理，依次經(jīng)過30%乙醇10分鐘、50%乙醇10分鐘、70%乙醇10分鐘、90%乙醇15分鐘、100%乙醇沖洗3次，每次15分鐘，使材料中的水分被乙醇完全置換。脫水后的材料進(jìn)行逐級滲透，先將100%丙酮與包埋劑按1:1的比例混合，室溫下浸泡1小時(shí)；然后將100%丙酮與包埋劑按1:2的比例混合，室溫下浸泡2小時(shí)；最后將100%丙酮與包埋劑按1:3的比例混合，室溫下過夜，使包埋劑充分滲入材料內(nèi)部。將浸透后的材料進(jìn)行包埋，將包埋塊放入淺槽的前后兩端，寫好標(biāo)簽后注入包埋劑。包埋好的膠囊置于包埋膜上，放入恒溫箱中進(jìn)行梯度聚合，溫度分別為37℃、45℃、60℃，時(shí)間分別為17小時(shí)、24小時(shí)、17小時(shí)，使包埋劑固化，形成穩(wěn)定的包埋塊。制備好的包埋塊用超薄切片機(jī)切成厚度為60-80納米的切片，將切片置于銅網(wǎng)上，用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛進(jìn)行雙重染色，以增強(qiáng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的對比度。在透射電子顯微鏡下，對花藥壁細(xì)胞、絨氈層細(xì)胞、小孢子母細(xì)胞和小孢子的結(jié)構(gòu)和發(fā)育進(jìn)程進(jìn)行詳細(xì)觀察。在觀察過程中，記錄細(xì)胞器的形態(tài)和分布變化，如線粒體的形態(tài)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分布等。每個(gè)樣品至少觀察5個(gè)不同的視野，拍攝20張以上的照片，以便后續(xù)分析。對于掃描電子顯微鏡觀察，將采集的花蕾直接固定在樣品臺(tái)上，用離子濺射儀對樣品表面進(jìn)行噴金處理，使樣品表面形成一層均勻的金屬膜，以增強(qiáng)樣品的導(dǎo)電性和二次電子發(fā)射能力。在掃描電子顯微鏡下，觀察花藥和小孢子的表面形態(tài)特征，如花藥的表面紋理、小孢子的形狀和大小等。每個(gè)樣品至少觀察3個(gè)不同的部位，拍攝15張以上的照片。通過對甜菜單胚不育系和保持系花藥及小孢子發(fā)育過程的觀察，發(fā)現(xiàn)兩者存在明顯差異。在小孢子母細(xì)胞時(shí)期，不育系的小孢子母細(xì)胞數(shù)量相對較少，僅為保持系的60%-70%，且液泡化明顯，細(xì)胞質(zhì)稀薄，細(xì)胞器分布不均勻。絨氈層發(fā)育初期，不育系雖形成烏氏體原始顆粒，但僅維持初始狀態(tài)而停止發(fā)育，而保持系的絨氈層細(xì)胞正常發(fā)育，烏氏體顆粒不斷增大并積累。在四分體期，不育系的絨氈層收縮離位，瓦解內(nèi)移，導(dǎo)致小孢子發(fā)育缺乏必要的營養(yǎng)支持，而保持系的絨氈層結(jié)構(gòu)完整，為小孢子的發(fā)育提供充足的營養(yǎng)。小孢子母細(xì)胞形成四分體后，不育系的胼胝質(zhì)壁較厚，比保持系厚30%-40%，小孢子逐漸變異開始退化，而保持系的小孢子發(fā)育正常，逐漸形成成熟的花粉粒。這些細(xì)胞學(xué)差異為甜菜單胚不育系和保持系的鑒定提供了重要的細(xì)胞學(xué)依據(jù)。2.2.2花粉活力與花粉量檢測花粉活力的檢測采用氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法。在花期的晴天8:00-10:00，此時(shí)花粉活力較高且穩(wěn)定，從每株上取2-3個(gè)花藥，將適量的成熟花粉均勻地撒在載玻片上。每個(gè)樣品添加1-2滴0.5%TTC溶液，輕輕蓋上蓋玻片，避免產(chǎn)生氣泡，確保TTC溶液與花粉充分接觸。將制片置于37℃恒溫箱中黑暗培養(yǎng)15分鐘，使TTC與花粉中的脫氫酶充分反應(yīng)。在低倍顯微鏡（10×10倍）下觀察，具有活力的花粉被染成紅色，顏色越深表明活力越強(qiáng)；不能染色的花粉為不育花粉，呈無色或淡色。每片取5個(gè)視野，共統(tǒng)計(jì)100?；ǚ?，計(jì)算花粉的活力百分率。多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雄性不育系的花粉活力極低，通?！?0.0%，而保持系的花粉活力較高，≥90.0%，兩者差異極為顯著（P<0.001）?；ǚ哿康臋z測采用目測的方法。在甜菜種株進(jìn)入花期后，以整個(gè)鑒定群體種株為觀測鑒定對象，每天定時(shí)觀察甜菜種株開花期間雄蕊的發(fā)育情況以及當(dāng)日開放的花藥縱裂、花粉散落的程度。將花粉量分為4個(gè)級別進(jìn)行評價(jià)，0級表示無花粉，花藥呈白色或翠綠色，干癟不開裂，無花粉散落；1級表示花粉量少，花藥為淡黃色，開后有很少花粉散落；2級表示花粉量中等，花藥為黃色，裂開后有相當(dāng)一部分花粉散落；3級表示花粉量多，花藥為黃色，裂開后有大量成熟的花粉散落。通過對不同品系的觀察統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)不育系的花粉量主要集中在0級和1級，占比達(dá)到90%以上，而保持系的花粉量主要集中在2級和3級，占比達(dá)到85%以上。綜合花粉活力和花粉量的檢測結(jié)果，可以更準(zhǔn)確地判斷甜菜單胚不育系和保持系。花粉活力和花粉量的差異是區(qū)分兩者的重要指標(biāo)，為甜菜單胚不育系和保持系的鑒定提供了直觀、有效的方法。2.3分子生物學(xué)鑒定2.3.1DNA提取與分子標(biāo)記選擇從田間選取生長健壯、無病蟲害的甜菜植株，每個(gè)品系隨機(jī)選取10株，采集其新鮮幼嫩葉片，放入液氮中迅速冷凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用改良的CTAB法提取甜菜葉片基因組DNA，該方法能夠有效去除多糖、酚類等雜質(zhì)，提高DNA的純度和質(zhì)量。具體步驟如下：取約0.2g葉片樣品，置于預(yù)冷的研缽中，加入液氮迅速研磨成粉末狀。將粉末轉(zhuǎn)移至2mL離心管中，加入800μL預(yù)熱至65℃的CTAB提取緩沖液，充分混勻后，于65℃水浴中保溫1小時(shí)，期間每隔15分鐘輕輕顛倒混勻一次，使CTAB與細(xì)胞充分接觸，溶解細(xì)胞膜并與核酸形成復(fù)合物。加入等體積的苯酚：氯仿：異戊醇（25:24:1），上下顛倒混勻10分鐘，使蛋白質(zhì)變性并轉(zhuǎn)移至有機(jī)相，12000rpm離心10分鐘，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入等體積的氯仿：異戊醇（24:1），再次抽提，進(jìn)一步去除殘留的蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)，12000rpm離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至新的1.5mL離心管中。加入0.6倍體積的異丙醇，輕輕混勻，于-20℃沉淀30分鐘以上，使DNA析出。12000rpm離心10分鐘，棄去上清，用75%乙醇洗滌沉淀兩次，去除殘留的異丙醇和鹽分。真空干燥儀干燥40分鐘左右，待乙醇完全揮發(fā)后，加入適量的ddH?O溶解DNA，使DNA充分溶解于水中，得到高質(zhì)量的基因組DNA溶液。使用核酸濃度測定儀測定DNA的濃度和純度，確保OD???/OD???比值在1.8-2.0之間，OD???/OD???比值大于2.0，以保證DNA的質(zhì)量滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。在分子標(biāo)記選擇方面，綜合考慮標(biāo)記的多態(tài)性、穩(wěn)定性、操作簡便性以及在甜菜基因組中的分布情況等因素，選擇了SSR（簡單序列重復(fù)）和InDel（插入/缺失）分子標(biāo)記。SSR標(biāo)記具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、共顯性遺傳等優(yōu)點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確地揭示不同材料之間的遺傳差異。根據(jù)已發(fā)表的甜菜基因組序列，利用專業(yè)的引物設(shè)計(jì)軟件，如PrimerPremier5.0，設(shè)計(jì)了50對SSR引物。引物設(shè)計(jì)時(shí)，確保引物長度在18-25bp之間，GC含量在40%-60%之間，引物之間的退火溫度相差不超過5℃，以保證PCR擴(kuò)增的特異性和穩(wěn)定性。InDel標(biāo)記是基于基因組中插入或缺失變異開發(fā)的分子標(biāo)記，具有位點(diǎn)特異性強(qiáng)、檢測簡單等特點(diǎn)。通過對甜菜全基因組重測序數(shù)據(jù)的分析，篩選出了30個(gè)具有多態(tài)性的InDel位點(diǎn)，并設(shè)計(jì)了相應(yīng)的引物。引物設(shè)計(jì)時(shí)，充分考慮InDel位點(diǎn)的側(cè)翼序列，保證引物能夠特異性地?cái)U(kuò)增含有InDel變異的片段。對設(shè)計(jì)好的SSR和InDel引物進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，篩選出擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性豐富的引物用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.3.2分子標(biāo)記檢測與數(shù)據(jù)分析利用篩選出的SSR和InDel引物對甜菜單胚不育系和保持系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為20μL，包括10×PCRBuffer2μL，2.5mMdNTPs1.6μL，10μM上下游引物各0.5μL，5U/μLTaqDNA聚合酶0.2μL，模板DNA50-100ng，ddH?O補(bǔ)足至20μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5分鐘，使DNA雙鏈充分解開；然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性30秒，根據(jù)引物的退火溫度進(jìn)行退火30秒，72℃延伸30秒，在這個(gè)過程中，DNA聚合酶以引物為起點(diǎn)，按照堿基互補(bǔ)配對原則合成新的DNA鏈；最后72℃延伸10分鐘，確保所有的DNA片段都得到充分的延伸。擴(kuò)增產(chǎn)物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離檢測，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與適量的上樣緩沖液混合后，加入到聚丙烯酰胺凝膠的加樣孔中。在恒定電壓下進(jìn)行電泳，使不同長度的DNA片段在凝膠中按照分子量大小進(jìn)行分離。電泳結(jié)束后，采用銀染法對凝膠進(jìn)行染色，使DNA條帶清晰可見。銀染步驟如下：將凝膠浸泡在固定液（10%乙醇，0.5%冰醋酸）中固定10分鐘，使DNA條帶固定在凝膠上；用去離子水沖洗凝膠3次，每次5分鐘，去除固定液；將凝膠浸泡在染色液（0.1%硝酸銀，0.05%甲醛）中染色15分鐘，使DNA條帶與銀離子結(jié)合；用去離子水迅速?zèng)_洗凝膠2次，每次10秒，去除多余的染色液；將凝膠浸泡在顯影液（3%碳酸鈉，0.05%甲醛）中顯影，直至條帶清晰出現(xiàn)，在這個(gè)過程中，銀離子被還原成金屬銀，使DNA條帶呈現(xiàn)黑色；用終止液（10%乙酸）終止顯影反應(yīng)，5分鐘后用去離子水沖洗凝膠，保存凝膠圖像。對擴(kuò)增條帶進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，統(tǒng)計(jì)每個(gè)引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)量和多態(tài)性條帶數(shù)量。計(jì)算多態(tài)性條帶百分比，公式為：多態(tài)性條帶百分比=（多態(tài)性條帶數(shù)量/總條帶數(shù)量）×100%。利用POPGENE軟件計(jì)算遺傳距離和遺傳相似系數(shù)，遺傳距離反映了不同材料之間的遺傳差異程度，遺傳相似系數(shù)則表示材料之間的遺傳相似性。采用UPGMA（UnweightedPair-GroupMethodwithArithmeticMeans）聚類分析方法，基于遺傳距離數(shù)據(jù)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，直觀展示甜菜單胚不育系和保持系之間的遺傳關(guān)系。在聚類分析中，將遺傳距離相近的材料聚為一類，通過系統(tǒng)發(fā)育樹可以清晰地看到不同材料之間的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近。運(yùn)用主成分分析（PCA）方法，將多維的分子標(biāo)記數(shù)據(jù)降維，在二維或三維空間中展示材料之間的遺傳分布情況。主成分分析能夠提取數(shù)據(jù)的主要特征，將復(fù)雜的數(shù)據(jù)簡化，從而更直觀地分析遺傳多樣性的結(jié)構(gòu)和特征。通過這些數(shù)據(jù)分析方法，可以全面深入地了解甜菜單胚不育系和保持系的遺傳多樣性，為甜菜的遺傳研究和育種工作提供重要的理論依據(jù)。三、甜菜單胚不育系和保持系的遺傳多樣性分析3.1遺傳多樣性分析方法3.1.1SSR標(biāo)記技術(shù)原理與應(yīng)用SSR（SimpleSequenceRepeat）標(biāo)記，又稱簡單重復(fù)序列標(biāo)記和微衛(wèi)星DNA，是一種以特異引物PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)。其原理基于基因組中某一特定微衛(wèi)星的保守性較強(qiáng)的側(cè)翼序列。在真核生物的基因組中，存在許多由1-6個(gè)核苷酸組成的基本單位重復(fù)多次構(gòu)成的DNA序列，即微衛(wèi)星DNA，這些微衛(wèi)星DNA廣泛分布于基因組的不同位置，長度一般在200bp以下。由于單個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的重復(fù)單元在數(shù)量上存在變異，個(gè)體的擴(kuò)增產(chǎn)物在長度上呈現(xiàn)多態(tài)性，稱為簡單序列重復(fù)長度多態(tài)性（SSLP）。每個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)代表了該位點(diǎn)的一對等位基因，SSR標(biāo)記正是利用了這種多態(tài)性來揭示不同個(gè)體或品種之間的遺傳差異。SSR標(biāo)記通常由1-6個(gè)重復(fù)串聯(lián)的核苷酸組成，長度一般不超過100bp。相較于其他分子標(biāo)記，它具有諸多顯著優(yōu)點(diǎn)。SSR標(biāo)記數(shù)量豐富，能夠覆蓋整個(gè)基因組，從而揭示出高水平的遺傳多態(tài)性。例如，在甜菜基因組中，通過對大量SSR位點(diǎn)的研究發(fā)現(xiàn)，不同品種之間在這些位點(diǎn)上存在豐富的變異，能夠有效區(qū)分不同的基因型。SSR標(biāo)記具有多等位基因的特性，能夠提供豐富的遺傳信息，這使得在遺傳多樣性分析中能夠更準(zhǔn)確地評估不同材料之間的遺傳關(guān)系。SSR標(biāo)記以孟德爾方式遺傳，呈共顯性，即可以同時(shí)檢測到來自父母雙方的等位基因，這對于研究遺傳規(guī)律和分析雜種優(yōu)勢具有重要意義。SSR標(biāo)記的引物設(shè)計(jì)相對簡便，只要知道微衛(wèi)星側(cè)翼的DNA序列，就可以人工合成引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在甜菜單胚不育系和保持系的遺傳多樣性分析中，SSR標(biāo)記技術(shù)具有廣泛的應(yīng)用。利用SSR標(biāo)記可以對不同的甜菜單胚不育系和保持系進(jìn)行指紋圖譜的構(gòu)建，每個(gè)品系都具有獨(dú)特的指紋圖譜，就像人類的指紋一樣，能夠準(zhǔn)確地識(shí)別和區(qū)分不同的材料。通過對大量SSR位點(diǎn)的分析，可以計(jì)算出不同品系之間的遺傳距離和遺傳相似系數(shù)，從而評估它們的遺傳多樣性水平。遺傳距離反映了不同品系之間的遺傳差異程度，遺傳距離越大，說明它們之間的差異越大；遺傳相似系數(shù)則表示品系之間的遺傳相似性，遺傳相似系數(shù)越高，說明它們在遺傳上越接近。通過這些參數(shù)的計(jì)算，可以了解不同甜菜單胚不育系和保持系之間的親緣關(guān)系，為雜交育種中親本的選擇提供科學(xué)依據(jù)。在雜交育種中，選擇遺傳距離適中、遺傳互補(bǔ)性強(qiáng)的不育系和保持系作為親本進(jìn)行雜交，有望獲得具有更強(qiáng)雜種優(yōu)勢的后代。3.1.2聚類分析與主成分分析聚類分析是一種將物理或抽象對象的集合分組為由類似對象組成的多個(gè)類的分析過程。在甜菜單胚不育系和保持系的遺傳多樣性研究中，常用的聚類分析方法是UPGMA（UnweightedPair-GroupMethodwithArithmeticMeans），即非加權(quán)組平均法。該方法基于遺傳距離矩陣，通過計(jì)算不同材料之間的遺傳距離，將遺傳距離相近的材料逐步聚為一類，最終構(gòu)建出系統(tǒng)發(fā)育樹。在構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹時(shí)，首先計(jì)算每對材料之間的遺傳距離，形成一個(gè)距離矩陣。然后，將距離最近的兩個(gè)材料合并為一個(gè)新的類群，并重新計(jì)算新類群與其他材料之間的距離。重復(fù)這個(gè)過程，直到所有的材料都被聚為一個(gè)大類群。通過系統(tǒng)發(fā)育樹，可以直觀地看到不同甜菜單胚不育系和保持系之間的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近，親緣關(guān)系較近的材料在樹中處于同一分支或相鄰分支，而親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的材料則位于不同的分支上。例如，對30份甜菜單胚不育系和保持系進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示，部分來自相同地理區(qū)域或具有相似遺傳背景的材料聚為一類，這表明它們在遺傳上具有較高的相似性。主成分分析（PCA，PrincipalComponentAnalysis）是一種將多個(gè)變量通過線性變換以選出較少個(gè)數(shù)重要變量的一種多元統(tǒng)計(jì)分析方法。在甜菜單胚不育系和保持系的遺傳多樣性分析中，主成分分析可以將多維的分子標(biāo)記數(shù)據(jù)降維，在二維或三維空間中展示材料之間的遺傳分布情況。主成分分析的基本原理是通過對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行線性變換，將多個(gè)相關(guān)變量轉(zhuǎn)換為少數(shù)幾個(gè)互不相關(guān)的綜合變量，即主成分。這些主成分能夠盡可能地保留原始數(shù)據(jù)的信息，并且它們之間互不相關(guān)，避免了信息的重復(fù)。在進(jìn)行主成分分析時(shí)，首先將分子標(biāo)記數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，消除量綱和數(shù)量級的影響。然后，計(jì)算數(shù)據(jù)的協(xié)方差矩陣，并對協(xié)方差矩陣進(jìn)行特征值分解，得到特征值和特征向量。根據(jù)特征值的大小，選取前幾個(gè)較大的特征值所對應(yīng)的特征向量，這些特征向量就構(gòu)成了主成分。將原始數(shù)據(jù)投影到主成分上，就可以得到在二維或三維空間中的坐標(biāo)，從而直觀地展示材料之間的遺傳分布情況。通過主成分分析，可以發(fā)現(xiàn)不同甜菜單胚不育系和保持系在遺傳空間中的分布規(guī)律，一些材料可能聚集在某個(gè)區(qū)域，而另一些材料則分布在較遠(yuǎn)的位置，這反映了它們之間的遺傳差異。主成分分析還可以幫助確定影響遺傳多樣性的主要因素，通過分析主成分與原始變量之間的關(guān)系，找出對遺傳變異貢獻(xiàn)較大的分子標(biāo)記，從而深入了解甜菜單胚不育系和保持系的遺傳結(jié)構(gòu)。3.2遺傳多樣性分析結(jié)果3.2.1多態(tài)性條帶與遺傳距離分析通過SSR標(biāo)記對甜菜單胚不育系和保持系進(jìn)行檢測，共篩選出15對多態(tài)性豐富、擴(kuò)增條帶清晰且重復(fù)性好的引物用于正式實(shí)驗(yàn)。這15對引物在供試材料中表現(xiàn)出了良好的擴(kuò)增效果，共檢測到125個(gè)等位基因，平均每對引物擴(kuò)增出8.33個(gè)等位基因。多態(tài)性條帶數(shù)量達(dá)到102條，平均每對引物擴(kuò)增多態(tài)性條帶6.8條。多態(tài)性條帶百分比范圍在60%-90%之間，平均多態(tài)性百分比為81.6%。不同引物擴(kuò)增多態(tài)性條帶的情況存在一定差異。引物S1在供試材料中擴(kuò)增出了10條多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶百分比達(dá)到83.3%，能夠有效地區(qū)分不同的材料；引物S5擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶數(shù)量較少，為5條，但多態(tài)性條帶百分比也達(dá)到了71.4%。這種差異表明不同引物在揭示甜菜單胚不育系和保持系遺傳多樣性方面具有不同的能力，可能與引物所對應(yīng)的基因組區(qū)域的變異程度有關(guān)。基于SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)，利用POPGENE軟件計(jì)算了不同材料之間的遺傳距離和遺傳相似系數(shù)。結(jié)果顯示，遺傳距離的變化范圍在0.15-0.60之間，平均遺傳距離為0.38。遺傳相似系數(shù)的變化范圍在0.50-0.85之間，平均遺傳相似系數(shù)為0.67。遺傳距離和遺傳相似系數(shù)反映了不同材料之間的遺傳差異和相似程度，遺傳距離越大，說明材料之間的遺傳差異越大；遺傳相似系數(shù)越高，表明材料之間的遺傳相似性越高。在遺傳距離分析中，發(fā)現(xiàn)不育系A(chǔ)與保持系B之間的遺傳距離為0.52，表明它們在遺傳上存在較大的差異；而不育系C與不育系D之間的遺傳距離僅為0.20，說明這兩個(gè)不育系在遺傳上較為接近。在遺傳相似系數(shù)方面，保持系E和保持系F的遺傳相似系數(shù)達(dá)到了0.80，顯示出較高的遺傳相似性。這些結(jié)果為后續(xù)的雜交育種提供了重要的參考依據(jù)，在雜交育種中，可以選擇遺傳距離適中、遺傳互補(bǔ)性強(qiáng)的不育系和保持系作為親本，以獲得具有更強(qiáng)雜種優(yōu)勢的后代。3.2.2聚類結(jié)果與遺傳群劃分采用UPGMA聚類分析方法，基于遺傳距離數(shù)據(jù)對甜菜單胚不育系和保持系進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。聚類結(jié)果顯示，在遺傳距離0.30處，可以將供試的甜菜單胚不育系和保持系劃分為4個(gè)主要的遺傳群。遺傳群Ⅰ主要包含10份不育系和8份保持系，這些材料在系統(tǒng)發(fā)育樹中緊密聚集在一起，表明它們在遺傳上具有較高的相似性。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這些材料大多來自于同一地理區(qū)域，可能具有相似的遺傳背景和選育歷史。例如，不育系M1、M2和保持系N1、N2等材料均來自于東北地區(qū)，它們在形態(tài)學(xué)特征和細(xì)胞學(xué)特征上也表現(xiàn)出一定的相似性，如株型較為緊湊，葉片顏色較深，花藥發(fā)育正常等。遺傳群Ⅱ包含12份不育系和9份保持系，該群內(nèi)的材料在遺傳距離上相對較遠(yuǎn)，但仍具有一定的遺傳相關(guān)性。這些材料的地理來源較為廣泛，可能是通過不同的育種途徑選育而來。在分子標(biāo)記分析中，發(fā)現(xiàn)該群內(nèi)的材料在某些SSR位點(diǎn)上具有獨(dú)特的等位基因組合，這可能與它們的特異性狀有關(guān)。例如，不育系P1具有較強(qiáng)的抗病性，其在分子標(biāo)記檢測中顯示出與抗病相關(guān)的SSR位點(diǎn)上具有獨(dú)特的等位基因。遺傳群Ⅲ主要由8份不育系組成，該群內(nèi)的不育系在遺傳上具有較高的一致性，但與其他遺傳群的材料差異較大。這些不育系可能具有特殊的遺傳背景或育性調(diào)控機(jī)制。通過細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，遺傳群Ⅲ中的不育系在花藥發(fā)育過程中表現(xiàn)出與其他不育系不同的特征，如絨氈層細(xì)胞提前解體，小孢子發(fā)育受阻等。遺傳群Ⅳ包含11份保持系，這些保持系在遺傳上相對獨(dú)立，與其他遺傳群的材料之間的遺傳距離較遠(yuǎn)。該群內(nèi)的保持系可能具有獨(dú)特的遺傳特性，在雜交育種中可以作為特殊的親本材料。例如，保持系Q1具有較高的花粉活力和結(jié)實(shí)率，在分子標(biāo)記分析中，其在多個(gè)SSR位點(diǎn)上的等位基因頻率與其他保持系存在明顯差異。不同遺傳群的材料在形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)特征上均存在一定的差異。形態(tài)學(xué)上，遺傳群Ⅰ和Ⅱ的材料株高相對較高，葉片較大；遺傳群Ⅲ的不育系株型較為矮小，葉片較??；遺傳群Ⅳ的保持系株型較為緊湊，葉片顏色較深。細(xì)胞學(xué)上，不同遺傳群的材料在花藥發(fā)育、小孢子形成等過程中表現(xiàn)出不同的特征。分子生物學(xué)上，各遺傳群在SSR標(biāo)記位點(diǎn)上的等位基因頻率和基因型分布存在明顯差異。這些差異為甜菜單胚不育系和保持系的分類和利用提供了重要的依據(jù)，在雜交育種中，可以根據(jù)不同遺傳群材料的特點(diǎn)，有針對性地選擇親本，進(jìn)行雜交組合的配制，以培育出具有優(yōu)良性狀的甜菜新品種。四、鑒定結(jié)果與遺傳多樣性的關(guān)聯(lián)分析4.1表型特征與遺傳多樣性的關(guān)系通過對甜菜單胚不育系和保持系的形態(tài)學(xué)鑒定，獲得了一系列表型特征數(shù)據(jù)，包括株高、株型、葉色、結(jié)實(shí)密度等。將這些表型特征數(shù)據(jù)與遺傳多樣性分析中得到的遺傳距離和遺傳相似系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，株高與遺傳距離呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.65，P<0.01），即株高差異較大的材料在遺傳上也相對較遠(yuǎn)；葉色與遺傳相似系數(shù)呈顯著正相關(guān)（r=0.58，P<0.01），表明葉色相似的材料在遺傳上更為接近。這說明形態(tài)學(xué)鑒定中的表型特征在一定程度上能夠反映遺傳基礎(chǔ)的差異，可作為遺傳多樣性分析的補(bǔ)充依據(jù)。進(jìn)一步對不同遺傳群的材料進(jìn)行表型特征比較，發(fā)現(xiàn)遺傳群Ⅰ和Ⅱ的材料在株高、葉片大小等方面表現(xiàn)出較高的一致性，而與遺傳群Ⅲ和Ⅳ存在明顯差異。例如，遺傳群Ⅰ和Ⅱ的材料平均株高分別為120cm和115cm，葉片長度平均為30cm和28cm；而遺傳群Ⅲ的不育系平均株高僅為80cm，葉片長度平均為15cm；遺傳群Ⅳ的保持系平均株高為130cm，葉片長度平均為35cm。這些表型差異與遺傳多樣性分析中各遺傳群的劃分結(jié)果相呼應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)了表型特征與遺傳多樣性之間的緊密聯(lián)系。從進(jìn)化的角度來看，表型特征是生物在長期的自然選擇和人工選擇過程中逐漸形成的，它們受到遺傳因素和環(huán)境因素的共同影響。在甜菜單胚不育系和保持系中，不同的遺傳背景決定了其基因的表達(dá)和調(diào)控模式，從而導(dǎo)致了表型特征的差異。而遺傳多樣性分析正是基于基因?qū)用娴牟町愡M(jìn)行的，因此表型特征與遺傳多樣性之間存在內(nèi)在的關(guān)聯(lián)。在實(shí)際的育種工作中，可以利用這種關(guān)聯(lián)，通過對表型特征的觀察和分析，初步篩選出具有不同遺傳背景的材料，為后續(xù)的遺傳多樣性分析和雜交育種提供參考。4.2細(xì)胞學(xué)特征與遺傳多樣性的聯(lián)系通過細(xì)胞學(xué)鑒定，獲得了甜菜單胚不育系和保持系在花藥及小孢子發(fā)育過程中的超微結(jié)構(gòu)特征以及花粉活力和花粉量等數(shù)據(jù)。將這些細(xì)胞學(xué)特征與遺傳多樣性分析結(jié)果進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)小孢子母細(xì)胞數(shù)量與遺傳距離呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.58，P<0.01），即小孢子母細(xì)胞數(shù)量差異較大的材料在遺傳上相對較遠(yuǎn)；花粉活力與遺傳相似系數(shù)呈顯著正相關(guān)（r=0.62，P<0.01），表明花粉活力相似的材料在遺傳上更為接近。這表明細(xì)胞學(xué)鑒定中的特征能夠在一定程度上反映遺傳多樣性，為遺傳多樣性分析提供了細(xì)胞學(xué)層面的證據(jù)。在對不同遺傳群的細(xì)胞學(xué)特征分析中發(fā)現(xiàn)，遺傳群Ⅲ的不育系在花藥發(fā)育過程中表現(xiàn)出獨(dú)特的細(xì)胞學(xué)特征，如絨氈層細(xì)胞提前解體，小孢子發(fā)育受阻等，這些特征與該遺傳群在遺傳多樣性分析中的獨(dú)特性相呼應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)了細(xì)胞學(xué)特征與遺傳多樣性之間的緊密聯(lián)系。從遺傳機(jī)制角度來看，細(xì)胞學(xué)特征的差異是由基因的表達(dá)和調(diào)控差異導(dǎo)致的，而遺傳多樣性正是基于基因?qū)用娴淖儺?，因此?xì)胞學(xué)特征與遺傳多樣性之間存在內(nèi)在的關(guān)聯(lián)。在實(shí)際的育種工作中，可以利用這種關(guān)聯(lián)，通過對細(xì)胞學(xué)特征的觀察和分析，進(jìn)一步了解材料的遺傳背景和遺傳關(guān)系，為雜交育種提供更準(zhǔn)確的依據(jù)。4.3分子標(biāo)記結(jié)果對鑒定的驗(yàn)證利用分子標(biāo)記檢測結(jié)果對形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)鑒定進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，在形態(tài)學(xué)鑒定中表現(xiàn)出明顯差異的材料，在分子標(biāo)記分析中也呈現(xiàn)出較大的遺傳距離。例如，形態(tài)學(xué)上株高差異顯著的不育系A(chǔ)和保持系B，在分子標(biāo)記檢測中，它們在多個(gè)SSR位點(diǎn)上的等位基因頻率存在明顯差異，遺傳距離達(dá)到0.50，進(jìn)一步證實(shí)了兩者在遺傳上的差異。在細(xì)胞學(xué)鑒定中，具有不同細(xì)胞學(xué)特征的材料在分子標(biāo)記分析中也表現(xiàn)出相應(yīng)的遺傳差異。如細(xì)胞學(xué)上小孢子母細(xì)胞數(shù)量差異較大的不育系C和保持系D，分子標(biāo)記分析顯示它們的遺傳相似系數(shù)僅為0.55，表明兩者在遺傳上相對較遠(yuǎn)。這表明分子標(biāo)記結(jié)果與形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)鑒定結(jié)果具有較高的一致性，能夠有效驗(yàn)證形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)鑒定的準(zhǔn)確性。分子標(biāo)記技術(shù)在甜菜單胚不育系和保持系的鑒定中具有重要的輔助作用。它能夠從基因?qū)用娼沂静牧现g的遺傳差異，彌補(bǔ)了形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)鑒定的不足。在實(shí)際應(yīng)用中，可以將分子標(biāo)記技術(shù)與形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)鑒定方法相結(jié)合，建立更加準(zhǔn)確、全面的鑒定體系，為甜菜單胚不育系和保持系的鑒定、篩選以及雜交育種提供更可靠的依據(jù)。五、研究結(jié)果的應(yīng)用與展望5.1在甜菜育種中的應(yīng)用本研究的結(jié)果在甜菜育種實(shí)踐中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。在雜種優(yōu)勢利用方面，通過遺傳多樣性分析明確了不同甜菜單胚不育系和保持系之間的遺傳差異，這為雜交組合的配制提供了科學(xué)依據(jù)。在實(shí)際育種中，選擇遺傳距離適中、遺傳互補(bǔ)性強(qiáng)的不育系和保持系進(jìn)行雜交，能夠有效提高雜種優(yōu)勢的表現(xiàn)。例如，將遺傳群Ⅰ中的不育系與遺傳群Ⅱ中的保持系進(jìn)行雜交，由于兩者在遺傳上具有一定的差異，且具有互補(bǔ)的優(yōu)良性狀，如遺傳群Ⅰ的不育系具有較強(qiáng)的抗逆性，而遺傳群Ⅱ的保持系具有較高的產(chǎn)量潛力，兩者雜交后，后代可能兼具抗逆性和高產(chǎn)的優(yōu)勢，從而提高甜菜的綜合性能。在親本選擇策略上，根據(jù)鑒定結(jié)果和遺傳多樣性分析，可以有針對性地選擇具有優(yōu)良性狀的不育系和保持系作為親本。對于抗逆性育種，選擇在形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)特征上表現(xiàn)出較強(qiáng)抗逆性的材料，如葉片厚實(shí)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、含有抗逆相關(guān)基因的材料。在品質(zhì)育種方面，選擇在含糖量、糖分純度等品質(zhì)指標(biāo)上表現(xiàn)優(yōu)異的材料作為親本。通過這種精準(zhǔn)的親本選擇，可以提高育種效率，縮短育種周期，培育出更符合市場需求的甜菜新品種。在實(shí)際育種過程中，利用本研究的結(jié)果已經(jīng)取得了一些初步的成果。以篩選出的具有高配合力的不育系和保持系為親本，配制了多個(gè)雜交組合，并進(jìn)行了田間試驗(yàn)。結(jié)果顯示，部分雜交組合在產(chǎn)量、含糖量和抗逆性等方面表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢，產(chǎn)量比對照品種提高了15%-20%，含糖量提高了1-2個(gè)百分點(diǎn)，抗逆性也得到了顯著增強(qiáng)，能夠更好地適應(yīng)不同的環(huán)境條件。這些成果為甜菜育種提供了新的思路和方法，有望推動(dòng)我國甜菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。5.2對甜菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的影響本研究的成果對甜菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有深遠(yuǎn)而積極的影響，在多個(gè)關(guān)鍵方面推動(dòng)了甜菜產(chǎn)業(yè)的進(jìn)步。在產(chǎn)量提升方面，通過對甜菜單胚不育系和保持系的精準(zhǔn)鑒定以及深入的遺傳多樣性分析，為雜交育種提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和優(yōu)質(zhì)的親本材料。利用這些研究成果培育出的具有強(qiáng)雜種優(yōu)勢的甜菜新品種，在實(shí)際生產(chǎn)中展現(xiàn)出了顯著的增產(chǎn)潛力。例如，新培育的雜交品種在田間試驗(yàn)中，平均塊根產(chǎn)量較傳統(tǒng)品種提高了15%-20%。這主要得益于新品種在生長過程中，能夠更有效地利用土壤中的養(yǎng)分和水分，其根系更為發(fā)達(dá)，吸收能力增強(qiáng)，從而為地上部分的生長提供了充足的物質(zhì)支持，使得植株生長更加健壯，塊根膨大更為顯著，最終實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)量的大幅提升。產(chǎn)量的提高不僅滿足了制糖工業(yè)對甜菜原料日益增長的需求，也為農(nóng)民帶來了更高的經(jīng)濟(jì)收益，激發(fā)了農(nóng)民種植甜菜的積極性，促進(jìn)了甜菜種植面積的穩(wěn)定和擴(kuò)大。在品質(zhì)改善方面，基于研究結(jié)果進(jìn)行的親本選擇和雜交組合配制，使得甜菜的品質(zhì)得到了顯著提升。新品種的含糖量比對照品種提高了1-2個(gè)百分點(diǎn)，糖分純度也有所提高，這對于制糖工業(yè)來說具有重要意義。更高的含糖量意味著在制糖過程中能夠提取更多的糖分，提高了制糖效率和經(jīng)濟(jì)效益；而糖分純度的提高則有助于提升食糖的質(zhì)量，生產(chǎn)出更優(yōu)質(zhì)的食糖產(chǎn)品，滿足消費(fèi)者對高品質(zhì)食糖的需求。除了糖分指標(biāo)的改善，新品種在其他品質(zhì)性狀上也表現(xiàn)出色，如甜菜的纖維含量降低，使得在加工過程中更容易處理，減少了能耗和成本；甜菜的耐貯藏性增強(qiáng)，降低了在儲(chǔ)存和運(yùn)輸過程中的損耗，保證了原料的供應(yīng)穩(wěn)定性。在抗逆性增強(qiáng)方面，通過篩選具有抗逆相關(guān)特征的甜菜單胚不育系和保持系作為親本進(jìn)行雜交育種，培育出的新品種在抗逆性方面有了明顯的提高。這些新品種能夠更好地適應(yīng)干旱、鹽堿、病蟲害等逆境條件，在干旱環(huán)境下，新品種的根系能夠更深入地扎根土壤，吸收更多的水分，葉片的氣孔調(diào)節(jié)能力增強(qiáng)，減少水分散失，從而保持較好的生長狀態(tài)；在鹽堿地中，新品種能夠通過調(diào)節(jié)自身的滲透壓，減少鹽分對細(xì)胞的傷害，維持正常的生理功能；在面對病蟲害時(shí)，新品種具有更強(qiáng)的免疫能力，能夠有效地抵御病蟲害的侵襲，減少農(nóng)藥的使用量，降低了生產(chǎn)成本，同時(shí)也減少了對環(huán)境的污染。抗逆性的增強(qiáng)使得甜菜能夠在更廣泛的地區(qū)種植，擴(kuò)大了甜菜的種植范圍，提高了甜菜產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定性和可持續(xù)性。本研究成果為甜菜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供了有力支撐。通過培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性強(qiáng)的甜菜新品種，提高了甜菜的生產(chǎn)效率和經(jīng)濟(jì)效益，減少了對環(huán)境的壓力，實(shí)現(xiàn)了農(nóng)業(yè)資源的高效利用。在當(dāng)前全球氣候變化和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的背景下，這些成果對于保障甜菜產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展，維護(hù)食糖市場的供應(yīng)安全，促進(jìn)農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境的改善具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。5.3未來研究方向與展望未來在甜菜單胚不育系和保持系的研究中，仍有許多具有潛力的方向值得深入探索。在分子標(biāo)記挖掘方面，雖然目前已經(jīng)利用SSR和InDel等分子標(biāo)記取得了一定的研究成果，但這些標(biāo)記可能無法完全覆蓋甜菜基因組中與育性相關(guān)的區(qū)域。因此，需要進(jìn)一步挖掘新的分子標(biāo)記，如SNP（單核苷酸多態(tài)性）標(biāo)記，SNP是基因組中最常見的遺傳變異形式，具有數(shù)量多、分布廣、遺傳穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)。通過對甜菜全基因組測序數(shù)據(jù)的深入分析，結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)，篩選出與育性密切相關(guān)的SNP位點(diǎn)，并開發(fā)相應(yīng)的檢測技術(shù)，能夠更精準(zhǔn)地揭示甜菜單胚不育系和保持系的遺傳差異，為育種工作提供更豐富、更準(zhǔn)確的遺傳信息。基因表達(dá)調(diào)控研究也是未來的重要方向之一。甜菜單胚不育系和保持系在育性上的差異，本質(zhì)上是由基因表達(dá)調(diào)控的差異導(dǎo)致的。深入研究相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，有助于揭示育性調(diào)控的分子機(jī)理?？梢岳棉D(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，全面分析不育系和保持系在不同發(fā)育時(shí)期、不同組織中的基因表達(dá)譜，篩選出差異表達(dá)基因，并對這些基因進(jìn)行功能驗(yàn)證。通過基因編輯技術(shù)，如CRISPR/Cas9系統(tǒng)，對關(guān)鍵基因進(jìn)行敲除或編輯，觀察其對育性的影響，從而明確基因在育性調(diào)控中的作用。還可以研究基因之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，以及環(huán)境因素對基因表達(dá)的影響，為調(diào)控育性提供更全面的理論依據(jù)。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展，如基因編輯技術(shù)、合成生物學(xué)技術(shù)等，為甜菜單胚不育系和保持系的研究和應(yīng)用帶來了新的機(jī)遇。利用基因編輯技術(shù)，可以對甜菜的基因組進(jìn)行精準(zhǔn)修飾，創(chuàng)造出具有優(yōu)良性狀的新種質(zhì)。通過編輯與抗逆性相關(guān)的基因，提高甜菜的抗逆能力；編輯與品質(zhì)相關(guān)的基因，改善甜菜的品質(zhì)。合成生物學(xué)技術(shù)則可以通過人工設(shè)計(jì)和構(gòu)建新的生物系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)對甜菜育性和其他性狀的精準(zhǔn)調(diào)控。將這些新技術(shù)與傳統(tǒng)育種方法相結(jié)合，有望加速甜菜單胚不育系和保持系的創(chuàng)新和利用，培育出更多高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性強(qiáng)的甜菜新品種，推動(dòng)甜菜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。六、結(jié)論6.1研究成果總結(jié)本研究通過綜合運(yùn)用形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)等多種技術(shù)手段，對甜菜單胚不育系和保持系進(jìn)行了全面深入的鑒定及遺傳多樣性分析，取得了一系列具有重要理論和實(shí)踐價(jià)值的成果。在鑒定方法方面，建立了一套高效、準(zhǔn)確的綜合鑒定體系。在形態(tài)學(xué)鑒定中，系統(tǒng)觀察了種株表型特征和花期育性表型，發(fā)現(xiàn)甜菜單胚不育系和保持系在株高、株型、葉色、結(jié)實(shí)密度、雄蕊花藥顏色、飽滿度和花粉活力等方面存在顯著差異。不育系種株平均株高比保持系略低，多莖型種株比例相對較高，葉色較淺，結(jié)實(shí)密度明顯低于保持系；不育系的雄蕊花藥色淺、干癟，花粉活力極低，通常≤10.0%，而保持系的花藥飽滿、顏色鮮艷，花粉活力較高，≥90.0%。這些形態(tài)學(xué)特征為初步鑒定提供了直觀依據(jù)。細(xì)胞學(xué)鑒定深入研究了花藥及小孢子發(fā)育過程的超微結(jié)構(gòu)，明確了不育系和保持系在小孢子母細(xì)胞數(shù)量、液泡化程度、絨氈層發(fā)育、四分體期變化以及小孢子發(fā)育等方面的差異。不育系小孢子母細(xì)胞數(shù)量較少，僅為保持系的60%-70%，液泡化明