固定化酶和細胞課件

固定化酶和細胞

酶應用過程中的一些不足酶的穩(wěn)定性較差：除了某些耐高溫的酶，如α-澱粉酶、Taq酶等；和胃蛋白酶等可以耐受較低的pH條件以外，大多數(shù)的酶在高溫、強酸、強鹼和重金屬離子等外界因素影響下，都容易變性失活。酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中與底物反應，這樣酶在反應系統(tǒng)中，與底物和產(chǎn)物混在一起，反應結束後，即使酶仍有很高的活力，也難於回收利用。這種一次性使用酶的方式，不僅使生產(chǎn)成本提高，而且難於連續(xù)化生產(chǎn)。產(chǎn)物的分離純化較困難：酶反應後成為雜質(zhì)與產(chǎn)物混在一起，無疑給產(chǎn)物的進一步的分離純化帶來一定的困難。固定化技術5.1什麼是固定化酶？水溶性酶水不溶性載體水不溶性酶（固定化酶）固定化技術化學偶聯(lián)酶固定化間歇可溶交聯(lián)包埋吸附間歇連續(xù)酶的固定化技術和固定化酶固定化酶：經(jīng)提取和分離純化後的酶固定化菌體(死細胞)：含酶菌體或菌體碎片固定化細胞：在一定的空間範圍內(nèi)進行生命活動的細胞優(yōu)點：不溶於水，易於與產(chǎn)物分離；可反復使用；可連續(xù)化生產(chǎn)；穩(wěn)定性好。缺點： 固定化過程中往往會引起酶的失活本章目錄固定化酶的研究從50年代開始，1953年德國的Grubhofer和Schleith採用聚氨基苯乙烯樹脂為載體與羧肽酶、澱粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等結合，製成固定化酶。60年代後期，固定化技術迅速發(fā)展起來。1969年，日本的千煙一郎首次在工業(yè)上生產(chǎn)應用固定化氨基醯化酶從DL-氨基酸連續(xù)生產(chǎn)L-氨基酸，實現(xiàn)了酶應用史上的一大變革。在1971年召開的第一次國際酶工程學術會議上，確定固定化酶的統(tǒng)一英文名稱為Immobilizedenzyme。5.2固定化酶的研究歷史隨著固定化技術的發(fā)展，出現(xiàn)固定化菌體。1973年，日本首次在工業(yè)上應用固定化大腸桿菌菌體中的天門冬氨酸酶，由反丁烯二酸連續(xù)生產(chǎn)L-天門冬氨酸。在固定化酶和固定化菌體的基礎上，70年代後期出現(xiàn)了固定化細胞技術。1976年，法國首次用固定化酵母細胞生產(chǎn)啤酒和酒精，1978年日本用固定化枯草桿菌生產(chǎn)澱粉酶，開始了用固定化細胞生產(chǎn)酶的先例。1982年，日本首次研究用固定化原生質(zhì)體生產(chǎn)谷氨酸，取得進展。固定化原生質(zhì)體由於解除了細胞壁的障礙，更有利於胞內(nèi)物質(zhì)的分泌，這為胞內(nèi)酶生產(chǎn)技術路線的變革提供了新的方向。本章目錄5.3酶固定化技術活性中心：保護酶的催化作用，並使酶的活性中心的氨基酸基團固有的高級結構不受到損害，在製備固定化酶時，需要在非常嚴密的條件下進行。功能基團：如游離的氨基、羧基、半胱氨酸的巰基、組氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、絲氨酸和蘇氨酸的羥基等，當這些功能基團位於酶的活性中心時，要求不參與酶的固定化結合酶的高級結構：要避免用高溫、強酸、強鹼等處理，而且有機溶劑、高濃度的鹽也會使酶變性、失活，因此，操作應儘量在非常溫和的條件下進行。固定化酶操作的注意事項1、吸附法

利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上，而使酶固定化的方法。常用的固體吸附劑有活性炭、氧化鋁、矽藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、矽膠、羥基磷灰石等。操作簡便，條件溫和，不會引起酶變性失活，載體廉價易得，而且可反復使用。由於靠物理吸附作用，結合力較弱，酶與載體結合不牢固而容易脫落，所以使用受到一定的限制。2、包埋法

將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法。包埋法使用的多孔載體主要有：瓊脂、瓊脂糖、海藻酸鈉、角叉菜膠、明膠、聚丙烯醯胺、光交聯(lián)樹脂、聚醯胺、火棉膠等。根據(jù)載體材料和方法的不同，可分為：凝膠包埋法：將酶或含酶菌體包埋在各種凝膠內(nèi)部的微孔中，製成一定形狀的固定化酶或固定化含酶菌體。大多數(shù)為球狀或片狀，也可按需要製成其他形狀。常用的凝膠有瓊脂凝膠、海藻酸鈣凝膠、角叉菜膠、明膠等天然凝膠以及聚丙烯醯胺凝膠、光交聯(lián)樹脂等合成凝膠。半透膜包埋法：將酶包埋在由各種高分子聚合物製成的小球內(nèi)，製成固定化酶。常用於製備固定化酶的半透膜有聚醯胺膜、火棉膠膜等首先被採用包埋法的是：固定化胰蛋白酶木瓜蛋白酶

－澱粉酶Enzyme+N,N-甲叉雙丙烯醯胺，丙烯醯胺，引發(fā)劑海藻酸鈣包埋法裝置將水溶性的海藻酸鈉配成水溶液，並把酶或細胞分散在其中，然後將其滴入凝固浴中（常用CaCl2溶液），使海藻酸鈉中的Na+，部分被Ca2+所取代而形成由多價離子交聯(lián)的離子網(wǎng)路凝膠。顆粒大小可即時監(jiān)控脂質(zhì)體包裹3、結合法

選擇適宜的載體，使之通過共價鍵或離子鍵與酶結合在一起的固定化方法。根據(jù)酶與載體結合的化學鍵不同，可分為：離子鍵結合法：通過離子鍵使酶與載體結合的固定化方法稱為離子鍵結合法。離子鍵結合法所使用的載體是某些不溶於水的離子交換劑。常用的有DEAE-纖維素、TEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠等。共價鍵結合法：通過共價鍵將酶與載體結合的固定化方法稱為共價鍵結合法。共價鍵結合法所採用的載體主要有：纖維素、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、甲殼質(zhì)、氨基酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物等。酶分子中可以形成共價鍵的基團主要有：氨基、羧基、巰基、羥基、酚基和咪唑基等。要使載體與酶形成共價鍵，必須首先使載體活化，第一個離子結合法固定化酶：

DEAE-Cellulose

固定化過氧化氫酶第一個工業(yè)化的固定化酶：

DEAE-SephadexA-50

固定化氨基醯化酶4、交聯(lián)法借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，製成網(wǎng)狀結構的固定化酶的方法。戊二醛有兩個醛基，這兩個醛基都可與酶或蛋白質(zhì)的游離氨基反應，形成席夫（Schiff）堿，而使酶或菌體蛋白交聯(lián)，製成固定化酶或固定化菌體。交聯(lián)法制備的固定化酶或固定化菌體結合牢固，可以長時間使用。但由於交聯(lián)反應條件較激烈，酶分子的多個基團被交聯(lián)，致使酶活力損失較大，而且製備成的固定化酶或固定化菌體的顆粒較小，給使用帶來不便。為此，可將交聯(lián)法與吸附法或包埋法聯(lián)合使用，以取長補短。常用的雙功能試劑有戊二醛、己二胺、順丁烯二酸酐、雙偶氮苯等。其中應用最廣泛的是戊二醛。酶分子之間共價交聯(lián)和與水不溶性載體共價偶聯(lián)酶分子；（a）酶分子之間用雙功能基團的化學交聯(lián)試劑相互交聯(lián)成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶聯(lián)到水不溶性載體上形成水不溶性的固定化酶本章目錄5.4固定化酶的特性：將酶或含酶菌體固定化製成固定化酶或固定化菌體以後，由於受到載體等的影響，酶的特性可能會有些變化。固定化酶的穩(wěn)定性一般比游離酶的穩(wěn)定性好。固定化酶的最適作用溫度一般與游離酶差不多，活化能也變化不大。酶經(jīng)過固定化後，其作用的最適pH值往往會發(fā)生一些變化。這一點在使用固定化酶時，必須引起注意。影響固定化酶最適pH值的因素主要有兩個，一個是載體的帶電性質(zhì)，另一個是酶催化反應產(chǎn)物的性質(zhì)。固定化酶的底物特異性與游離酶比較可能有些不同，其變化與底物分子量的大小有一定關係。固定化酶底物特異性的改變，是由於載體的空間位阻作用引起的。本章目錄乙醯-DL—AlaL—Ala+乙酸 乙醯-D—AlaAminoacylase

氨基醯化酶5.5固定化酶的應用世界上第一種工業(yè)化生產(chǎn)的固定化酶。1969年，日本田邊制藥公司將從米麯黴中提取分離得到的氨基醯化酶，用DEAE-葡聚糖凝膠為載體通過離子鍵結合法制成固定化酶，將L-乙醯氨基酸水解生成L-氨基酸，用來拆分DL-乙醯氨基酸，連續(xù)生產(chǎn)L-氨基酸。剩餘的D-乙醯氨基酸經(jīng)過消旋化，生成DL-乙醯氨基酸，再進行拆分。生產(chǎn)成本僅為用游離酶生產(chǎn)成本的60％左右。泵儲罐反應產(chǎn)物離心機消旋反應器固定化酶柱子晶體L-AlaL-AlaA-D-AlaA-L-AlaA-D-Ala高果糖漿的生產(chǎn)世界上生產(chǎn)規(guī)模最大的一種固定化酶。將培養(yǎng)好的含葡萄糖異構酶的放線菌細胞用60～65℃熱處理15min，該酶就固定在菌體上，製成固定化酶，催化葡萄糖異構化生成果糖，用於連續(xù)生產(chǎn)果葡糖漿。青黴素醯化酶轉(zhuǎn)化流程圖酶感測器酶感測器是由固定化酶與傳感元件兩部分組成的，其中酶是與適當?shù)妮d體結合形成的不溶於水的固定化酶膜。最常用的酶感測器是酶電極，即將固定化酶膜與轉(zhuǎn)換電極做在一起，當酶膜與被測物發(fā)生催化反應而生成電極活性物質(zhì)後，電極測定活性物質(zhì)並將其轉(zhuǎn)換為電信號輸出。酶電極酶電極是由固定化酶與各種電極密切結合的傳感裝置。1962年Clark和Lyons提出模型，1967年Updike和Hicks首先製造出酶電極並把它用於葡萄糖的定量分析。酶電極一般可根據(jù)電極檢測物理量的不同分為電流型和電壓型，前者一般有氧電極、H2O2電極等，後者有NH3、CO2、H2電極等。較典型的一種酶電極為葡萄糖酶電極。葡萄糖＋醌＋H2O 葡萄糖酸＋氫醌葡萄糖氧化酶氫醌 醌＋2H＋＋2e－Pt鉑電極葡萄糖酶電極結構示意圖

葡萄糖酶電極的敏感膜是葡萄糖氧化酶（GOD），它被固定在聚乙烯醯胺凝膠上。在酶膜的作用下葡萄糖發(fā)生氧化反應，消耗掉氧而生成葡萄糖酸和過氧化氫。通過用電極測量被消耗的氧或生成的過氧化氫就可瞭解葡萄糖濃度。

手掌型葡萄糖(glucose)分析儀脲電極Urea+2H2O 2NH4++2HCO3-脲酶產(chǎn)生的2NH4+為陽離子電極感應。此外還有： 氨基酸電極 醇電極 尿酸電極 乳酸電極 青黴素電極 亞硝酸離子電極：菠菜亞硝酸還原酶產(chǎn)生NH3一些常見的酶電極底物酶電極5′－腺苷酸5′－腺苷酸脫氨酶NH4+乙醇，醇乙醇脫氫酶Pt過氧化物過氧化氫酶Pt(O2)磷酸葡萄硫酸酯酶+葡萄糖氧化酶Pt(O2)D-氨基酸D－氨基酸氧化酶NH4+L-氨基酸L－氨基酸氧化酶NH3蔗糖蔗糖酶+葡萄糖氧化酶Pt(H2O