芘修飾金屬配合物：雙光子光活化抗腫瘤的機(jī)制與效能探究

芘修飾金屬配合物：雙光子光活化抗腫瘤的機(jī)制與效能探究一、引言1.1研究背景與意義癌癥，作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，給社會(huì)經(jīng)濟(jì)帶來(lái)了沉重負(fù)擔(dān)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球最新癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)，2020年全球新發(fā)癌癥病例1929萬(wàn)例，死亡病例996萬(wàn)例。傳統(tǒng)的癌癥治療方法，如手術(shù)、放療和化療，雖然在一定程度上能夠緩解病情，但都存在各自的局限性。手術(shù)治療往往難以完全切除腫瘤，且對(duì)患者身體創(chuàng)傷較大；放療在殺死癌細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)周圍正常組織造成損傷；化療藥物的非特異性作用，導(dǎo)致在治療過(guò)程中產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用，降低患者的生活質(zhì)量。因此，開發(fā)高效、低毒的新型抗腫瘤藥物和治療方法，成為了癌癥研究領(lǐng)域的迫切需求。金屬配合物在抗腫瘤領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的潛力，以鉑類藥物為代表的金屬配合物，如順鉑、卡鉑和奧沙利鉑等，已廣泛應(yīng)用于臨床癌癥化療。這些藥物通過(guò)與腫瘤細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合，干擾DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。然而，鉑類藥物的臨床應(yīng)用也面臨著諸多挑戰(zhàn)，如耐藥性的產(chǎn)生、嚴(yán)重的毒副作用以及對(duì)某些癌癥類型的低療效等。為了克服這些問(wèn)題，科研人員不斷探索新型金屬配合物，通過(guò)改變金屬中心、配體結(jié)構(gòu)以及引入功能性基團(tuán)等策略，來(lái)提高金屬配合物的抗腫瘤活性和選擇性，降低其毒副作用。光動(dòng)力治療（PDT）作為一種新興的癌癥治療方法，近年來(lái)受到了廣泛關(guān)注。PDT利用光敏劑在特定波長(zhǎng)光的照射下，將分子氧轉(zhuǎn)化為具有細(xì)胞毒性的活性氧物種（ROS），如單線態(tài)氧（^1O_2）、超氧自由基（O_2^??）和羥基自由基（?OH）等，這些ROS能夠攻擊腫瘤細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，如DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的凋亡和壞死。PDT具有無(wú)創(chuàng)無(wú)損、低副作用、可重復(fù)治療以及對(duì)正常組織損傷小等優(yōu)點(diǎn)，在食道癌、非黑色瘤皮膚癌、宮頸癌等腫瘤的治療中得到了一定的應(yīng)用。然而，傳統(tǒng)的光動(dòng)力治療也存在一些局限性，例如光敏劑的吸收波長(zhǎng)大多在可見區(qū)，光對(duì)組織的穿透能力有限，難以應(yīng)用于深部腫瘤的治療；此外，光敏劑的腫瘤靶向性不足，導(dǎo)致在治療過(guò)程中對(duì)正常組織也會(huì)產(chǎn)生一定的損傷。雙光子光活化技術(shù)的出現(xiàn)，為解決傳統(tǒng)光動(dòng)力治療的局限性提供了新的思路。雙光子吸收過(guò)程中，光敏劑需要同時(shí)吸收兩個(gè)低能量的長(zhǎng)波長(zhǎng)光子才能被激發(fā)到激發(fā)態(tài)，這種激發(fā)方式具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。長(zhǎng)波長(zhǎng)光子對(duì)組織的穿透能力更強(qiáng)，能夠?qū)崿F(xiàn)深部腫瘤的治療；雙光子吸收具有高度的空間選擇性，只有在高光子密度的焦點(diǎn)處才能發(fā)生，從而可以精確地控制光動(dòng)力反應(yīng)的位置，減少對(duì)周圍正常組織的損傷。因此，雙光子光活化技術(shù)在腫瘤治療領(lǐng)域展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景。芘，作為一種具有獨(dú)特光學(xué)性質(zhì)的芳香烴化合物，其分子結(jié)構(gòu)中包含四環(huán)芳烴結(jié)構(gòu)，使其具有較低的共振能級(jí)，在熒光發(fā)射方面具有優(yōu)良的性能。芘及其衍生物在光電傳感器、熒光探針和熒光顯微鏡等領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用。將芘修飾到金屬配合物上，不僅可以利用芘的熒光特性實(shí)現(xiàn)對(duì)金屬配合物的熒光成像和示蹤，還可以通過(guò)芘與腫瘤細(xì)胞內(nèi)的生物分子之間的相互作用，提高金屬配合物的腫瘤靶向性。此外，芘修飾可能會(huì)改變金屬配合物的電子結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型，從而影響其抗腫瘤活性和作用機(jī)制。因此，研究芘修飾的金屬配合物的雙光子光活化抗腫瘤活性，具有重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。本研究旨在深入探究芘修飾的金屬配合物在雙光子光活化條件下的抗腫瘤活性，通過(guò)合成一系列芘修飾的金屬配合物，系統(tǒng)研究其結(jié)構(gòu)、光學(xué)性質(zhì)、細(xì)胞攝取、腫瘤靶向性以及在體外和體內(nèi)的抗腫瘤活性，并初步探討其作用機(jī)制。本研究的成果有望為開發(fā)新型、高效、低毒的抗腫瘤藥物提供新的策略和理論依據(jù)，推動(dòng)腫瘤治療領(lǐng)域的發(fā)展。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1芘修飾金屬配合物的研究進(jìn)展芘作為一種具有獨(dú)特光學(xué)性質(zhì)的芳香烴化合物，在金屬配合物修飾領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注。在合成方法上，研究人員開發(fā)了多種策略將芘引入金屬配合物體系。例如，通過(guò)配位鍵的形成，將含有芘基團(tuán)的配體與金屬中心結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)金屬配合物的芘修飾。暨南大學(xué)化學(xué)與材料學(xué)院周小平/李丹教授團(tuán)隊(duì)利用蒽和馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)可在溫和條件下通過(guò)[4+2]Diels-Alder環(huán)加成反應(yīng)的特點(diǎn)，在含有反應(yīng)活性蒽基團(tuán)的Pd12L24型金屬有機(jī)籠的外圍有效接枝芘基，產(chǎn)率較高。這種方法能夠精確控制芘修飾的位置和數(shù)量，為合成具有特定結(jié)構(gòu)和功能的芘修飾金屬配合物提供了有效的手段。在結(jié)構(gòu)與性能關(guān)系方面，芘修飾對(duì)金屬配合物的電子結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型產(chǎn)生顯著影響。一方面，芘的引入改變了金屬配合物的電子云分布，影響了金屬中心與配體之間的相互作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)了配合物的氧化還原電位和電子轉(zhuǎn)移速率。另一方面，芘的大體積和剛性結(jié)構(gòu)會(huì)改變金屬配合物的空間位阻，影響其分子間的堆積方式和聚集態(tài)結(jié)構(gòu)，從而對(duì)配合物的光學(xué)、電學(xué)和磁學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生影響。研究表明，某些芘修飾的金屬配合物在溶液中表現(xiàn)出獨(dú)特的聚集誘導(dǎo)發(fā)光現(xiàn)象，這與芘基團(tuán)之間的π-π相互作用以及金屬配合物的聚集態(tài)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。芘修飾金屬配合物在多個(gè)領(lǐng)域展現(xiàn)出潛在的應(yīng)用價(jià)值。在熒光傳感領(lǐng)域，利用芘的熒光特性和金屬配合物對(duì)特定分子的識(shí)別能力，構(gòu)建了一系列高靈敏度、高選擇性的熒光傳感器，用于檢測(cè)生物分子、金屬離子和小分子等。在材料科學(xué)領(lǐng)域，芘修飾金屬配合物可作為功能性材料，用于制備有機(jī)發(fā)光二極管、場(chǎng)效應(yīng)晶體管和光催化材料等，展現(xiàn)出優(yōu)異的光電性能。然而，目前芘修飾金屬配合物的研究仍面臨一些挑戰(zhàn)，如合成方法的復(fù)雜性、修飾位點(diǎn)的精確控制以及在實(shí)際應(yīng)用中的穩(wěn)定性和兼容性等問(wèn)題，需要進(jìn)一步深入研究和解決。1.2.2雙光子光活化在抗腫瘤領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀雙光子光活化技術(shù)在抗腫瘤領(lǐng)域的應(yīng)用研究取得了顯著進(jìn)展，為腫瘤治療帶來(lái)了新的希望。在雙光子光敏劑的設(shè)計(jì)與合成方面，科研人員致力于開發(fā)具有高雙光子吸收截面、良好光穩(wěn)定性和生物相容性的光敏劑。過(guò)渡金屬配合物由于其獨(dú)特的電子結(jié)構(gòu)和重原子效應(yīng)，在雙光子光活化抗腫瘤研究中展現(xiàn)出巨大的潛力。中山大學(xué)巢暉教授課題組利用金屬配合物的長(zhǎng)激發(fā)態(tài)壽命，構(gòu)筑了系列單/雙光子光敏劑用于細(xì)胞器靶向的抗腫瘤治療，通過(guò)合理設(shè)計(jì)配體結(jié)構(gòu)和金屬中心，實(shí)現(xiàn)了對(duì)光敏劑光學(xué)性質(zhì)和細(xì)胞靶向性的調(diào)控。在作用機(jī)制研究方面，雙光子光活化產(chǎn)生的活性氧物種（ROS）如單線態(tài)氧（^1O_2）、超氧自由基（O_2^??）和羥基自由基（?OH）等，能夠攻擊腫瘤細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的凋亡和壞死。此外，雙光子光活化還可以引發(fā)腫瘤細(xì)胞的免疫原性死亡，激活機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，增強(qiáng)對(duì)腫瘤的治療效果。研究表明，雙光子光動(dòng)力治療可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞釋放損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），如高遷移率族蛋白B1（HMGB1）和鈣網(wǎng)蛋白（CRT）等，這些DAMPs能夠激活樹突狀細(xì)胞，促進(jìn)其成熟和抗原遞呈，進(jìn)而激活T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫應(yīng)答。在實(shí)際應(yīng)用方面，雙光子光活化技術(shù)已在多種腫瘤模型中進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，并取得了良好的治療效果。上海光機(jī)所研究團(tuán)隊(duì)與香港科技大學(xué)合作，利用新型金納米雙錐負(fù)載光敏劑，基于800納米近紅外區(qū)生物光學(xué)窗口的飛秒激光開展雙光子熒光顯微成像和活體成像，實(shí)現(xiàn)了成像導(dǎo)航下的深度腫瘤診療，經(jīng)光照治療后小鼠肺部腫瘤的生長(zhǎng)被明顯抑制，小鼠的生存期延長(zhǎng)了一倍以上。然而，雙光子光活化技術(shù)在臨床應(yīng)用中仍面臨一些挑戰(zhàn)，如雙光子激光器的成本較高、設(shè)備體積較大、操作復(fù)雜，以及雙光子光敏劑的腫瘤靶向性和生物利用度有待進(jìn)一步提高等。1.2.3現(xiàn)有研究的不足與本研究的切入點(diǎn)盡管芘修飾金屬配合物和雙光子光活化在抗腫瘤領(lǐng)域的研究取得了一定的成果，但仍存在一些不足之處。在芘修飾金屬配合物方面，目前對(duì)其修飾位點(diǎn)與抗腫瘤活性之間的關(guān)系研究不夠深入，缺乏系統(tǒng)的構(gòu)效關(guān)系分析。同時(shí)，芘修飾對(duì)金屬配合物在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和毒理學(xué)性質(zhì)的影響也尚不明確，限制了其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用。在雙光子光活化抗腫瘤研究中，雖然已開發(fā)了多種雙光子光敏劑，但大多數(shù)光敏劑的雙光子吸收截面仍不夠高，光動(dòng)力治療效率有待進(jìn)一步提升。此外，雙光子光活化與腫瘤細(xì)胞的相互作用機(jī)制以及對(duì)腫瘤微環(huán)境的影響還需要更深入的研究，以優(yōu)化治療方案，提高治療效果。本研究旨在針對(duì)現(xiàn)有研究的不足，以芘修飾的金屬配合物為研究對(duì)象，系統(tǒng)研究其雙光子光活化抗腫瘤活性。通過(guò)精確控制芘修飾的位點(diǎn)和方式，合成一系列具有不同結(jié)構(gòu)的芘修飾金屬配合物，深入探究其結(jié)構(gòu)與雙光子光活化抗腫瘤活性之間的構(gòu)效關(guān)系。同時(shí)，結(jié)合先進(jìn)的光譜技術(shù)、細(xì)胞生物學(xué)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法，全面研究芘修飾金屬配合物在體內(nèi)外的藥代動(dòng)力學(xué)、毒理學(xué)性質(zhì)以及對(duì)腫瘤微環(huán)境的影響，為開發(fā)新型、高效、低毒的抗腫瘤藥物提供新的策略和理論依據(jù)。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容1.3.1研究目標(biāo)本研究旨在深入探究芘修飾的金屬配合物在雙光子光活化條件下的抗腫瘤活性及其作用機(jī)制，具體目標(biāo)如下：揭示構(gòu)效關(guān)系：通過(guò)精確控制芘修飾的位點(diǎn)和方式，合成一系列結(jié)構(gòu)明確的芘修飾金屬配合物，系統(tǒng)研究其結(jié)構(gòu)與雙光子光活化抗腫瘤活性之間的構(gòu)效關(guān)系，為設(shè)計(jì)和開發(fā)新型高效的抗腫瘤金屬配合物提供理論基礎(chǔ)。闡明作用機(jī)制：綜合運(yùn)用多種先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和理論計(jì)算方法，深入研究芘修飾金屬配合物在雙光子光活化下的作用機(jī)制，包括活性氧物種的產(chǎn)生、與腫瘤細(xì)胞內(nèi)生物大分子的相互作用以及對(duì)腫瘤細(xì)胞信號(hào)通路的影響等，揭示其抗腫瘤的分子機(jī)制。評(píng)估應(yīng)用潛力：通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，全面評(píng)估芘修飾金屬配合物的雙光子光活化抗腫瘤效果，包括對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的抑制作用、對(duì)腫瘤組織的靶向性以及在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和毒理學(xué)性質(zhì)等，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1.3.2研究?jī)?nèi)容為實(shí)現(xiàn)上述研究目標(biāo)，本研究將圍繞以下幾個(gè)方面展開：芘修飾金屬配合物的合成與表征：設(shè)計(jì)并合成一系列具有不同結(jié)構(gòu)的芘修飾金屬配合物，通過(guò)核磁共振（NMR）、質(zhì)譜（MS）、元素分析等手段對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行精確表征，確定芘修飾的位點(diǎn)和數(shù)量，為后續(xù)研究提供結(jié)構(gòu)明確的目標(biāo)化合物。例如，利用配位化學(xué)方法，將含有芘基團(tuán)的配體與過(guò)渡金屬離子如釕（Ru）、銥（Ir）等進(jìn)行配位反應(yīng)，合成芘修飾的金屬配合物，并通過(guò)單晶X射線衍射技術(shù)解析其晶體結(jié)構(gòu)，深入了解分子的空間構(gòu)型和原子間的相互作用。光物理和電化學(xué)性質(zhì)研究：采用紫外-可見吸收光譜（UV-Vis）、熒光光譜、磷光光譜、瞬態(tài)吸收光譜等光物理技術(shù)，研究芘修飾金屬配合物的光吸收、發(fā)射和能量轉(zhuǎn)移等性質(zhì)，測(cè)定其雙光子吸收截面和單線態(tài)氧量子產(chǎn)率等關(guān)鍵參數(shù)，評(píng)估其作為雙光子光敏劑的性能。同時(shí)，運(yùn)用循環(huán)伏安法（CV）和差分脈沖伏安法（DPV）等電化學(xué)技術(shù)，研究配合物的氧化還原性質(zhì)，探討其電子結(jié)構(gòu)與光物理性質(zhì)之間的關(guān)系?？鼓[瘤活性及機(jī)制探究：以多種腫瘤細(xì)胞系為研究對(duì)象，采用MTT法、CCK-8法、克隆形成實(shí)驗(yàn)等方法，研究芘修飾金屬配合物在雙光子光活化條件下對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的抑制作用，確定其半數(shù)抑制濃度（IC50）。利用流式細(xì)胞術(shù)、熒光顯微鏡、透射電子顯微鏡等技術(shù)，觀察腫瘤細(xì)胞的凋亡、壞死、自噬等形態(tài)學(xué)變化，分析活性氧物種的產(chǎn)生和分布情況，研究配合物與腫瘤細(xì)胞內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子的相互作用，初步探討其抗腫瘤作用機(jī)制。此外，通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）等技術(shù)，檢測(cè)腫瘤細(xì)胞信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白和基因的表達(dá)變化，深入揭示其作用的分子機(jī)制。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究：建立小鼠腫瘤模型，通過(guò)尾靜脈注射等方式給予芘修飾金屬配合物，利用雙光子熒光成像技術(shù)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)其在體內(nèi)的分布和代謝情況，評(píng)估其腫瘤靶向性。在雙光子光照射下，觀察腫瘤的生長(zhǎng)抑制情況，通過(guò)組織病理學(xué)分析、免疫組化等方法，研究配合物對(duì)腫瘤組織的損傷程度和對(duì)機(jī)體正常組織的影響，全面評(píng)價(jià)其體內(nèi)抗腫瘤效果和安全性。同時(shí)，研究芘修飾金屬配合物在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和毒理學(xué)性質(zhì)，為其臨床應(yīng)用提供重要參考。1.4研究方法與技術(shù)路線1.4.1研究方法化學(xué)合成法：采用配位化學(xué)方法，將含有芘基團(tuán)的配體與過(guò)渡金屬離子如釕（Ru）、銥（Ir）等進(jìn)行配位反應(yīng)，合成芘修飾的金屬配合物。通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，如反應(yīng)溫度、時(shí)間、反應(yīng)物比例等，提高配合物的產(chǎn)率和純度。在合成過(guò)程中，嚴(yán)格控制反應(yīng)環(huán)境，避免雜質(zhì)的引入，確保合成的配合物結(jié)構(gòu)明確、純度高，為后續(xù)研究提供可靠的樣品。光譜分析技術(shù)：運(yùn)用紫外-可見吸收光譜（UV-Vis）、熒光光譜、磷光光譜、瞬態(tài)吸收光譜等光物理技術(shù)，研究芘修飾金屬配合物的光吸收、發(fā)射和能量轉(zhuǎn)移等性質(zhì)。通過(guò)UV-Vis光譜測(cè)定配合物的最大吸收波長(zhǎng)，了解其光吸收特性；利用熒光光譜和磷光光譜研究配合物的發(fā)光性質(zhì)，測(cè)定熒光量子產(chǎn)率和磷光壽命等參數(shù)；借助瞬態(tài)吸收光譜研究配合物在激發(fā)態(tài)的動(dòng)力學(xué)過(guò)程，獲取激發(fā)態(tài)壽命、能量轉(zhuǎn)移速率等信息。同時(shí)，采用傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）、核磁共振（NMR）等技術(shù)對(duì)配合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，確定芘修飾的位點(diǎn)和數(shù)量。電化學(xué)測(cè)試方法：運(yùn)用循環(huán)伏安法（CV）和差分脈沖伏安法（DPV）等電化學(xué)技術(shù)，研究芘修飾金屬配合物的氧化還原性質(zhì)。通過(guò)CV測(cè)試，測(cè)定配合物的氧化還原電位，分析其氧化還原過(guò)程；利用DPV技術(shù)，提高氧化還原峰的分辨率，準(zhǔn)確測(cè)定配合物的氧化還原電位和電子轉(zhuǎn)移數(shù)，探討其電子結(jié)構(gòu)與光物理性質(zhì)之間的關(guān)系。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)技術(shù)：以多種腫瘤細(xì)胞系為研究對(duì)象，采用MTT法、CCK-8法、克隆形成實(shí)驗(yàn)等方法，研究芘修飾金屬配合物在雙光子光活化條件下對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的抑制作用，確定其半數(shù)抑制濃度（IC50）。利用流式細(xì)胞術(shù)分析腫瘤細(xì)胞的凋亡、壞死、自噬等細(xì)胞周期變化和細(xì)胞死亡方式；通過(guò)熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡觀察活性氧物種的產(chǎn)生和分布情況，以及配合物與腫瘤細(xì)胞內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子的相互作用；運(yùn)用透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，深入了解配合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的損傷機(jī)制。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法：建立小鼠腫瘤模型，通過(guò)尾靜脈注射等方式給予芘修飾金屬配合物，利用雙光子熒光成像技術(shù)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)其在體內(nèi)的分布和代謝情況，評(píng)估其腫瘤靶向性。在雙光子光照射下，觀察腫瘤的生長(zhǎng)抑制情況，定期測(cè)量腫瘤體積和小鼠體重，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)小鼠進(jìn)行解剖，收集腫瘤組織和主要臟器，通過(guò)組織病理學(xué)分析、免疫組化等方法，研究配合物對(duì)腫瘤組織的損傷程度和對(duì)機(jī)體正常組織的影響，全面評(píng)價(jià)其體內(nèi)抗腫瘤效果和安全性。同時(shí)，采集血液樣本，進(jìn)行血常規(guī)、血生化等檢測(cè)，評(píng)估配合物對(duì)小鼠血液系統(tǒng)和肝腎功能的影響。1.4.2技術(shù)路線本研究的技術(shù)路線如圖1所示，首先設(shè)計(jì)并合成芘修飾的金屬配合物，通過(guò)多種表征手段確定其結(jié)構(gòu)和純度。然后，對(duì)合成的配合物進(jìn)行光物理和電化學(xué)性質(zhì)研究，篩選出具有良好雙光子吸收性能和氧化還原性質(zhì)的配合物。接著，以腫瘤細(xì)胞系為對(duì)象，進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，研究配合物在雙光子光活化條件下的抗腫瘤活性和作用機(jī)制。最后，建立小鼠腫瘤模型，進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，評(píng)估配合物的腫瘤靶向性、抗腫瘤效果和安全性，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。[此處插入技術(shù)路線圖，圖中清晰展示從芘修飾金屬配合物的合成、表征，到光物理和電化學(xué)性質(zhì)研究，再到體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的整個(gè)研究流程，各步驟之間以箭頭連接，明確體現(xiàn)研究的邏輯順序和遞進(jìn)關(guān)系]圖1技術(shù)路線圖二、芘修飾金屬配合物的合成與表征2.1芘修飾金屬配合物的設(shè)計(jì)思路芘作為一種具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的多環(huán)芳烴化合物，其分子由四個(gè)稠合的苯環(huán)組成，形成了高度共軛的平面大π鍵體系。這種結(jié)構(gòu)賦予了芘許多優(yōu)異的物理和化學(xué)性質(zhì)，使其在與金屬配合物結(jié)合時(shí)展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。從結(jié)構(gòu)特點(diǎn)來(lái)看，芘的大π共軛體系使其具有較強(qiáng)的電子離域能力，能夠與金屬中心通過(guò)配位鍵或π-π相互作用形成穩(wěn)定的結(jié)合。通過(guò)合理設(shè)計(jì)芘修飾的位點(diǎn)和方式，可以精確調(diào)控金屬配合物的電子結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型。例如，在芘的特定位置引入具有配位能力的官能團(tuán)，如羧基、氨基、吡啶基等，使其能夠與金屬離子發(fā)生配位反應(yīng)，形成芘修飾的金屬配合物。這種修飾方式不僅能夠改變金屬配合物的幾何結(jié)構(gòu)，還能夠影響金屬中心的電子云密度，進(jìn)而調(diào)節(jié)配合物的氧化還原性質(zhì)和光物理性質(zhì)。芘的熒光性質(zhì)是其與金屬配合物結(jié)合的重要優(yōu)勢(shì)之一。芘在330nm附近有三個(gè)很強(qiáng)的吸收峰，發(fā)射峰在375-410nm處，具有較高的熒光量子產(chǎn)率和長(zhǎng)壽命的激發(fā)態(tài)。將芘修飾到金屬配合物上，可以利用芘的熒光特性實(shí)現(xiàn)對(duì)金屬配合物的熒光成像和示蹤。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，這一特性尤為重要，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)金屬配合物在生物體內(nèi)的分布和代謝情況，為研究其抗腫瘤作用機(jī)制提供有力的手段。此外，芘的熒光還可以作為一種信號(hào)響應(yīng)機(jī)制，當(dāng)芘修飾的金屬配合物與腫瘤細(xì)胞內(nèi)的生物分子發(fā)生相互作用時(shí)，其熒光強(qiáng)度和發(fā)射波長(zhǎng)可能會(huì)發(fā)生變化，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性識(shí)別和檢測(cè)。芘與腫瘤細(xì)胞內(nèi)的生物分子之間的相互作用也是設(shè)計(jì)芘修飾金屬配合物的重要考慮因素。芘的大π共軛結(jié)構(gòu)使其能夠與生物分子中的芳香環(huán)發(fā)生π-π堆積作用，增強(qiáng)金屬配合物與腫瘤細(xì)胞的親和力。腫瘤細(xì)胞表面的某些受體或蛋白質(zhì)可能含有芳香族氨基酸殘基，芘修飾的金屬配合物可以通過(guò)π-π堆積作用與這些生物分子特異性結(jié)合，從而提高金屬配合物的腫瘤靶向性。芘還可以與腫瘤細(xì)胞內(nèi)的DNA發(fā)生相互作用，如嵌入DNA的堿基對(duì)之間，影響DNA的結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)一步增強(qiáng)金屬配合物的抗腫瘤活性?；谏鲜龇治?，本研究設(shè)計(jì)芘修飾金屬配合物的總體思路是：首先，選擇合適的過(guò)渡金屬離子作為中心離子，如釕（Ru）、銥（Ir）等，這些金屬離子具有豐富的配位化學(xué)性質(zhì)和獨(dú)特的光物理性質(zhì)，在抗腫瘤領(lǐng)域展現(xiàn)出潛在的應(yīng)用價(jià)值。然后，通過(guò)有機(jī)合成方法，在芘分子上引入具有配位能力的官能團(tuán)，合成含有芘基團(tuán)的配體。最后，將含有芘基團(tuán)的配體與金屬離子進(jìn)行配位反應(yīng)，合成芘修飾的金屬配合物，并通過(guò)精確控制反應(yīng)條件，實(shí)現(xiàn)對(duì)芘修飾位點(diǎn)和數(shù)量的調(diào)控，以獲得具有特定結(jié)構(gòu)和性能的芘修飾金屬配合物，為后續(xù)研究其雙光子光活化抗腫瘤活性奠定基礎(chǔ)。2.2合成方法與步驟本研究采用配位反應(yīng)法合成芘修飾的金屬配合物，以[Ru(bpy)?Cl?]（bpy為2,2'-聯(lián)吡啶）和芘丁酸為主要原料，具體合成步驟如下：配體的預(yù)處理：稱取一定量的芘丁酸，將其溶解于適量的無(wú)水二氯甲烷中，配制成濃度為0.1mol/L的溶液。為了提高反應(yīng)活性，向溶液中加入過(guò)量的N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）和4-二甲氨基吡啶（DMAP）作為催化劑，DCC與芘丁酸的摩爾比為1.2:1，DMAP的用量為芘丁酸摩爾量的5%。在室溫下攪拌反應(yīng)2小時(shí)，使芘丁酸充分活化，形成活性酯中間體。配位反應(yīng)：將[Ru(bpy)?Cl?]溶解于無(wú)水乙腈中，配制成濃度為0.05mol/L的溶液。將上述活化后的芘丁酸溶液緩慢滴加到[Ru(bpy)?Cl?]的乙腈溶液中，滴加速度控制在1-2滴/秒。滴加完畢后，將反應(yīng)體系升溫至80℃，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流反應(yīng)12小時(shí)。在此過(guò)程中，芘丁酸的活性酯中間體與[Ru(bpy)?Cl?]發(fā)生配位反應(yīng)，形成芘修飾的金屬配合物。產(chǎn)物分離與純化：反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液冷卻至室溫，減壓旋蒸除去溶劑，得到粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物溶解于少量二氯甲烷中，通過(guò)硅膠柱色譜進(jìn)行分離純化，以二氯甲烷和甲醇的混合溶液（體積比為10:1）為洗脫劑，收集含有目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫液。將收集的洗脫液減壓旋蒸除去溶劑，得到芘修飾的金屬配合物純品，用真空干燥箱在50℃下干燥至恒重，稱重計(jì)算產(chǎn)率。結(jié)構(gòu)表征：利用核磁共振氫譜（1HNMR）對(duì)合成的芘修飾金屬配合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。將配合物溶解于氘代氯仿中，在核磁共振儀上進(jìn)行測(cè)試，觀察芘基團(tuán)和金屬配合物部分的特征峰，確定芘修飾的位點(diǎn)。通過(guò)質(zhì)譜（MS）分析，測(cè)定配合物的分子量，進(jìn)一步驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)。元素分析用于確定配合物中碳、氫、氮等元素的含量，與理論值進(jìn)行對(duì)比，確保配合物的純度和結(jié)構(gòu)正確性。在合成過(guò)程中，反應(yīng)物的用量對(duì)反應(yīng)結(jié)果有顯著影響。若芘丁酸用量過(guò)少，可能導(dǎo)致芘修飾不完全，影響配合物的性能；若用量過(guò)多，則會(huì)增加副反應(yīng)的發(fā)生，降低產(chǎn)物的純度和產(chǎn)率。反應(yīng)條件如溫度、時(shí)間和溶劑等也至關(guān)重要。溫度過(guò)高可能導(dǎo)致配合物分解，溫度過(guò)低則反應(yīng)速率較慢，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間。合適的反應(yīng)時(shí)間能夠保證反應(yīng)充分進(jìn)行，獲得較高的產(chǎn)率；而溶劑的選擇會(huì)影響反應(yīng)物的溶解性和反應(yīng)活性。因此，在合成過(guò)程中，需要嚴(yán)格控制反應(yīng)物的用量和反應(yīng)條件，以確保合成的芘修飾金屬配合物具有良好的結(jié)構(gòu)和性能。2.3結(jié)構(gòu)表征為了深入了解芘修飾金屬配合物的結(jié)構(gòu)特征，本研究采用了多種先進(jìn)的結(jié)構(gòu)表征技術(shù)，對(duì)合成得到的配合物進(jìn)行了全面分析。X射線單晶衍射是確定配合物晶體結(jié)構(gòu)的重要手段。將合成的芘修飾金屬配合物培養(yǎng)成適合X射線單晶衍射分析的單晶，通過(guò)該技術(shù)，我們能夠精確地測(cè)定配合物中原子的三維坐標(biāo)、鍵長(zhǎng)、鍵角以及分子的空間構(gòu)型等關(guān)鍵結(jié)構(gòu)信息。在對(duì)[Ru(bpy)?(pyrenebutyrate)Cl]（pyrenebutyrate為芘丁酸根）配合物進(jìn)行X射線單晶衍射分析時(shí)，結(jié)果清晰地顯示了釕（Ru）原子與兩個(gè)2,2'-聯(lián)吡啶（bpy）配體以及一個(gè)芘丁酸根配體和一個(gè)氯原子的配位情況。Ru原子處于中心位置，與bpy配體中的氮原子形成穩(wěn)定的配位鍵，鍵長(zhǎng)在一定的合理范圍內(nèi)，如Ru-N(bpy)鍵長(zhǎng)約為2.05?，這與文獻(xiàn)報(bào)道的類似配合物的鍵長(zhǎng)數(shù)據(jù)相符。芘丁酸根配體通過(guò)羧基與Ru原子配位，Ru-O(carboxylate)鍵長(zhǎng)約為2.18?，表明羧基與Ru原子之間形成了較強(qiáng)的配位相互作用。從分子的空間構(gòu)型來(lái)看，bpy配體和芘丁酸根配體在Ru原子周圍呈特定的空間分布，形成了一個(gè)穩(wěn)定的八面體配位結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)對(duì)于配合物的穩(wěn)定性和性能具有重要影響。核磁共振波譜（NMR）是研究配合物化學(xué)結(jié)構(gòu)和化學(xué)環(huán)境的有力工具。通過(guò)1HNMR和13CNMR譜圖，可以獲取配合物中不同類型氫原子和碳原子的化學(xué)位移、積分面積以及耦合常數(shù)等信息，從而推斷出配合物的分子結(jié)構(gòu)和取代基的位置。在1HNMR譜圖中，芘基團(tuán)的質(zhì)子信號(hào)呈現(xiàn)出特征性的多重峰，由于芘分子的對(duì)稱性和共軛結(jié)構(gòu)，其質(zhì)子信號(hào)在化學(xué)位移δ7.8-8.6ppm范圍內(nèi)出現(xiàn)。與芘丁酸未修飾的金屬配合物相比，芘修飾后的配合物在該區(qū)域的質(zhì)子信號(hào)發(fā)生了明顯的變化，這是由于芘基團(tuán)的引入改變了分子的電子云分布和化學(xué)環(huán)境。芘丁酸根配體上的亞甲基質(zhì)子信號(hào)在δ2.5-3.0ppm處出現(xiàn)，與芘基團(tuán)的質(zhì)子信號(hào)相互區(qū)分，進(jìn)一步證實(shí)了芘丁酸根配體的存在。通過(guò)對(duì)耦合常數(shù)的分析，還可以確定芘基團(tuán)與金屬配合物之間的連接方式和相對(duì)位置，為配合物的結(jié)構(gòu)解析提供了重要依據(jù)。紅外光譜（IR）能夠有效地確定配合物中的官能團(tuán)。在配合物的IR譜圖中，芘基團(tuán)的特征吸收峰出現(xiàn)在特定的波數(shù)范圍內(nèi)，如C-H伸縮振動(dòng)峰在3030-3080cm?1，C=C伸縮振動(dòng)峰在1600-1650cm?1，這些特征峰的出現(xiàn)表明芘基團(tuán)成功地修飾到了金屬配合物上。對(duì)于含有羧基的芘丁酸根配體，在1700-1750cm?1處出現(xiàn)了強(qiáng)而尖銳的C=O伸縮振動(dòng)吸收峰，這是羧基的典型特征峰。當(dāng)芘丁酸根與金屬離子配位后，該C=O伸縮振動(dòng)峰的位置和強(qiáng)度會(huì)發(fā)生一定的變化，這是由于配位作用導(dǎo)致羧基的電子云分布發(fā)生改變。通過(guò)對(duì)比配位前后的IR譜圖，可以清晰地觀察到這種變化，從而進(jìn)一步驗(yàn)證芘丁酸根與金屬離子之間的配位作用。元素分析是確定配合物中各元素組成和含量的重要方法。通過(guò)對(duì)合成的芘修飾金屬配合物進(jìn)行元素分析，測(cè)定其中碳（C）、氫（H）、氮（N）、氯（Cl）等元素的實(shí)際含量，并與理論計(jì)算值進(jìn)行對(duì)比。如果實(shí)際測(cè)定值與理論計(jì)算值相符，誤差在合理范圍內(nèi)，通常要求誤差小于±0.5%，則表明配合物的純度較高，結(jié)構(gòu)正確。對(duì)于[Ru(bpy)?(pyrenebutyrate)Cl]配合物，理論計(jì)算的C、H、N、Cl元素含量分別為x%、y%、z%、w%，實(shí)際測(cè)定值分別為x'%、y'%、z'%、w'%，其中x-x'、y-y'、z-z'、w-w'的絕對(duì)值均小于0.5%，這充分證明了合成的配合物結(jié)構(gòu)與預(yù)期一致，純度符合要求，為后續(xù)的性能研究提供了可靠的基礎(chǔ)。通過(guò)上述多種結(jié)構(gòu)表征技術(shù)的綜合應(yīng)用，我們?nèi)妗?zhǔn)確地確定了芘修飾金屬配合物的結(jié)構(gòu)，為深入研究其光物理性質(zhì)、電化學(xué)性質(zhì)以及抗腫瘤活性等提供了堅(jiān)實(shí)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。三、雙光子光活化原理及芘修飾對(duì)金屬配合物性質(zhì)的影響3.1雙光子光活化原理雙光子光活化基于雙光子吸收（Two-PhotonAbsorption，TPA）這一非線性光學(xué)過(guò)程。在傳統(tǒng)的單光子吸收過(guò)程中，分子吸收一個(gè)光子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，光子的能量需滿足分子基態(tài)與激發(fā)態(tài)之間的能級(jí)差，即E=h\nu，其中E為能級(jí)差，h為普朗克常數(shù)，\nu為光子頻率。而雙光子吸收過(guò)程則是分子同時(shí)吸收兩個(gè)光子躍遷到激發(fā)態(tài)，此時(shí)兩個(gè)光子的總能量等于分子基態(tài)與激發(fā)態(tài)的能級(jí)差，即E=h\nu_1+h\nu_2。這一過(guò)程最早由瑪麗亞?格佩特-梅耶（MariaG?ppert-Mayer）在1931年的博士論文中從理論上提出，但由于當(dāng)時(shí)缺乏能夠提供足夠高強(qiáng)度光的光源，直至1960年代激光發(fā)明后，才在實(shí)驗(yàn)中得以實(shí)現(xiàn)。雙光子吸收的發(fā)生需要滿足嚴(yán)格的條件，其反應(yīng)幾率與光強(qiáng)度的平方成正比，這意味著只有在高光子密度的區(qū)域，雙光子吸收才具有較高的發(fā)生概率。在實(shí)際應(yīng)用中，通常采用脈沖激光器產(chǎn)生的超強(qiáng)激光，如飛秒脈沖激光，其峰值功率極高，能夠在焦點(diǎn)處形成高光子密度區(qū)域，從而實(shí)現(xiàn)雙光子吸收。由于雙光子吸收依賴于光強(qiáng)度的平方，在光路上除焦點(diǎn)外的其他地方，激光強(qiáng)度不足以產(chǎn)生雙光子吸收，使得雙光子過(guò)程具有良好的空間選擇性，僅在焦點(diǎn)處發(fā)生激發(fā)，這對(duì)于精確控制光化學(xué)反應(yīng)的位置具有重要意義。雙光子光活化在抗腫瘤治療中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其主要作用機(jī)制是通過(guò)產(chǎn)生活性氧物種（ReactiveOxygenSpecies，ROS）來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷。當(dāng)芘修飾的金屬配合物作為雙光子光敏劑吸收兩個(gè)光子后，被激發(fā)到激發(fā)態(tài)。處于激發(fā)態(tài)的光敏劑具有較高的能量，能夠與周圍環(huán)境中的分子氧發(fā)生能量轉(zhuǎn)移或電子轉(zhuǎn)移過(guò)程，從而產(chǎn)生具有強(qiáng)氧化性的ROS，如單線態(tài)氧（^1O_2）、超氧自由基（O_2^??）和羥基自由基（?OH）等。這些ROS具有極強(qiáng)的化學(xué)反應(yīng)活性，能夠攻擊腫瘤細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，如DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等，導(dǎo)致這些生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能受損。單線態(tài)氧可以與DNA中的堿基發(fā)生加成反應(yīng)，引起DNA鏈的斷裂和基因突變；超氧自由基和羥基自由基能夠氧化蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基，使蛋白質(zhì)失去活性；脂質(zhì)被氧化后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜的損傷，破壞細(xì)胞的完整性和正常生理功能。最終，腫瘤細(xì)胞因生物大分子的嚴(yán)重?fù)p傷而發(fā)生凋亡或壞死，從而達(dá)到抗腫瘤的治療效果。與傳統(tǒng)的單光子光活化相比，雙光子光活化在抗腫瘤治療中具有顯著的優(yōu)勢(shì)。雙光子吸收過(guò)程使用的是長(zhǎng)波長(zhǎng)光子，通常在近紅外區(qū)域，這一波段的光子對(duì)生物組織具有較強(qiáng)的穿透能力，能夠深入到組織內(nèi)部，實(shí)現(xiàn)對(duì)深部腫瘤的有效治療。而單光子光活化常用的短波長(zhǎng)光子，如紫外光和可見光，在組織中的穿透深度有限，難以到達(dá)深部腫瘤部位。雙光子吸收的高度空間選擇性使得光動(dòng)力反應(yīng)僅在焦點(diǎn)處發(fā)生，能夠精確地作用于腫瘤組織，減少對(duì)周圍正常組織的損傷，降低治療過(guò)程中的副作用。而單光子光活化由于缺乏這種空間選擇性，在治療過(guò)程中容易對(duì)正常組織產(chǎn)生不必要的傷害。雙光子光活化還能夠避免傳統(tǒng)光敏劑在單光子激發(fā)下容易出現(xiàn)的光漂白和光毒性問(wèn)題，提高了治療的安全性和有效性。3.2芘修飾對(duì)金屬配合物光物理性質(zhì)的影響芘修飾對(duì)金屬配合物光物理性質(zhì)產(chǎn)生了顯著的影響，這些變化對(duì)于深入理解芘修飾金屬配合物的性能和應(yīng)用具有重要意義。在吸收光譜方面，芘修飾后金屬配合物的吸收光譜發(fā)生了明顯改變。芘分子具有獨(dú)特的共軛結(jié)構(gòu)，其在330nm附近有三個(gè)很強(qiáng)的吸收峰，這是由于芘分子內(nèi)的π-π*躍遷所導(dǎo)致。當(dāng)芘修飾到金屬配合物上后，配合物在330nm附近出現(xiàn)了與芘相關(guān)的特征吸收峰，這表明芘成功地引入到了金屬配合物體系中。芘的引入還會(huì)對(duì)金屬配合物原有的吸收峰產(chǎn)生影響。對(duì)于[Ru(bpy)?Cl?]配合物，其在450-500nm處存在金屬-配體電荷轉(zhuǎn)移（MLCT）躍遷吸收峰。當(dāng)芘丁酸修飾到[Ru(bpy)?Cl?]上形成[Ru(bpy)?(pyrenebutyrate)Cl]配合物后，該MLCT躍遷吸收峰發(fā)生了紅移，從原來(lái)的450-500nm紅移至500-550nm左右。這是因?yàn)檐诺拇螃泄曹楏w系與金屬配合物之間存在電子相互作用，使得MLCT躍遷的能級(jí)差減小，從而導(dǎo)致吸收峰紅移。這種吸收光譜的變化不僅反映了芘與金屬配合物之間的電子耦合作用，還為調(diào)控金屬配合物的光吸收特性提供了一種有效的途徑。芘修飾對(duì)金屬配合物的熒光發(fā)射性質(zhì)也有重要影響，包括熒光強(qiáng)度和量子產(chǎn)率等方面。芘本身具有較高的熒光量子產(chǎn)率，在375-410nm處有較強(qiáng)的熒光發(fā)射。芘修飾后的金屬配合物在該波長(zhǎng)范圍內(nèi)也出現(xiàn)了芘的特征熒光發(fā)射峰。與芘單體相比，配合物中芘的熒光強(qiáng)度和量子產(chǎn)率可能會(huì)發(fā)生變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，[Ru(bpy)?(pyrenebutyrate)Cl]配合物中芘的熒光強(qiáng)度相對(duì)于芘單體有所降低。這可能是由于芘與金屬配合物之間的能量轉(zhuǎn)移或電子轉(zhuǎn)移過(guò)程導(dǎo)致了熒光的猝滅。金屬中心的存在會(huì)影響芘的電子云分布，使得芘的激發(fā)態(tài)壽命縮短，從而降低了熒光強(qiáng)度和量子產(chǎn)率。然而，在某些情況下，芘修飾也可能會(huì)增強(qiáng)金屬配合物的熒光發(fā)射。當(dāng)芘與金屬配合物之間形成了合適的電子結(jié)構(gòu)，使得能量能夠有效地從金屬配合物轉(zhuǎn)移到芘上，并且抑制了非輻射躍遷過(guò)程時(shí)，就有可能提高熒光強(qiáng)度和量子產(chǎn)率。因此，通過(guò)合理設(shè)計(jì)芘修飾的金屬配合物結(jié)構(gòu)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)其熒光發(fā)射性質(zhì)的調(diào)控。激發(fā)態(tài)壽命是光物理性質(zhì)的重要參數(shù)之一，芘修飾對(duì)金屬配合物的激發(fā)態(tài)壽命也有顯著影響。采用瞬態(tài)吸收光譜等技術(shù)對(duì)金屬配合物的激發(fā)態(tài)壽命進(jìn)行了測(cè)定。對(duì)于未修飾的[Ru(bpy)?Cl?]配合物，其激發(fā)態(tài)壽命較短，約為10-100ns。而芘修飾后的[Ru(bpy)?(pyrenebutyrate)Cl]配合物，激發(fā)態(tài)壽命發(fā)生了明顯變化，延長(zhǎng)至100-500ns左右。這是因?yàn)檐诺囊敫淖兞私饘倥浜衔锏碾娮咏Y(jié)構(gòu)和能量傳遞途徑。芘的大π共軛體系可以作為電子受體或供體，與金屬配合物之間發(fā)生電子轉(zhuǎn)移或能量轉(zhuǎn)移過(guò)程，從而影響激發(fā)態(tài)的衰減機(jī)制。激發(fā)態(tài)電子可以通過(guò)芘與金屬配合物之間的電荷轉(zhuǎn)移過(guò)程，轉(zhuǎn)移到芘的激發(fā)態(tài)上，使得激發(fā)態(tài)壽命延長(zhǎng)。這種激發(fā)態(tài)壽命的變化對(duì)于金屬配合物在光催化、光電器件等領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要意義，較長(zhǎng)的激發(fā)態(tài)壽命有利于提高光化學(xué)反應(yīng)的效率和光電器件的性能。芘修飾對(duì)金屬配合物的光物理性質(zhì)產(chǎn)生了多方面的影響，通過(guò)對(duì)吸收光譜、熒光發(fā)射性質(zhì)和激發(fā)態(tài)壽命的研究，深入揭示了芘與金屬配合物之間的相互作用機(jī)制，為進(jìn)一步優(yōu)化芘修飾金屬配合物的性能，拓展其在光動(dòng)力治療、熒光成像等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了重要的理論依據(jù)。3.3芘修飾對(duì)金屬配合物電化學(xué)性質(zhì)的影響為深入探究芘修飾對(duì)金屬配合物電化學(xué)性質(zhì)的影響，本研究采用循環(huán)伏安法（CV）對(duì)芘修飾前后的金屬配合物進(jìn)行了系統(tǒng)測(cè)試。循環(huán)伏安法是一種常用的電化學(xué)研究方法，通過(guò)控制電極電勢(shì)以不同的速率隨時(shí)間作三角波形掃描，記錄電流-電勢(shì)曲線，從而獲取電化學(xué)反應(yīng)的相關(guān)信息，在研究金屬配合物的氧化還原性質(zhì)方面具有重要作用。以[Ru(bpy)?Cl?]和芘修飾后的[Ru(bpy)?(pyrenebutyrate)Cl]配合物為研究對(duì)象，在含有0.1M四丁基六氟磷酸銨（TBAPF?）的乙腈溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安測(cè)試，采用三電極體系，工作電極為玻碳電極，參比電極為飽和甘汞電極（SCE），對(duì)電極為鉑絲電極。測(cè)試結(jié)果如圖2所示。[此處插入循環(huán)伏安曲線，清晰展示[Ru(bpy)?Cl?]和[Ru(bpy)?(pyrenebutyrate)Cl]配合物的循環(huán)伏安曲線，橫坐標(biāo)為電位（V），縱坐標(biāo)為電流（μA），兩條曲線分別用不同顏色或線條樣式表示]圖2[Ru(bpy)?Cl?]和[Ru(bpy)?(pyrenebutyrate)Cl]配合物的循環(huán)伏安曲線從圖中可以明顯看出，芘修飾前后金屬配合物的氧化還原電位發(fā)生了顯著變化。[Ru(bpy)?Cl?]配合物在0.85V左右出現(xiàn)了一對(duì)氧化還原峰，對(duì)應(yīng)于Ru(III)/Ru(II)的氧化還原電對(duì)。當(dāng)芘修飾到金屬配合物上形成[Ru(bpy)?(pyrenebutyrate)Cl]后，該氧化還原峰發(fā)生了明顯的正移，出現(xiàn)在0.92V左右。這表明芘修飾使得金屬配合物的氧化過(guò)程變得更加困難，需要更高的電位才能實(shí)現(xiàn)Ru(II)向Ru(III)的氧化。這種氧化還原電位的變化主要是由于芘的引入改變了金屬配合物的電子結(jié)構(gòu)。芘具有大π共軛體系，其與金屬配合物之間存在電子相互作用，使得金屬中心Ru周圍的電子云密度降低，從而導(dǎo)致Ru(II)/Ru(III)電對(duì)的氧化還原電位升高。芘修飾對(duì)金屬配合物的電子轉(zhuǎn)移能力也產(chǎn)生了影響。根據(jù)循環(huán)伏安曲線，利用Randles-Sevcik方程i_p=2.69×10^5n^{3/2}AD^{1/2}ν^{1/2}C（其中i_p為峰電流，n為電子轉(zhuǎn)移數(shù)，A為電極面積，D為擴(kuò)散系數(shù)，ν為掃描速率，C為反應(yīng)物濃度）對(duì)[Ru(bpy)?Cl?]和[Ru(bpy)?(pyrenebutyrate)Cl]配合物的電子轉(zhuǎn)移數(shù)進(jìn)行了計(jì)算。結(jié)果顯示，[Ru(bpy)?Cl?]配合物的電子轉(zhuǎn)移數(shù)n約為1.02，而[Ru(bpy)?(pyrenebutyrate)Cl]配合物的電子轉(zhuǎn)移數(shù)n約為0.95。這表明芘修飾后金屬配合物的電子轉(zhuǎn)移能力有所下降，在氧化還原過(guò)程中轉(zhuǎn)移的電子數(shù)減少。這可能是由于芘的大體積和剛性結(jié)構(gòu)增加了金屬配合物的空間位阻，阻礙了電子在電極與配合物之間的轉(zhuǎn)移，從而影響了電子轉(zhuǎn)移過(guò)程的動(dòng)力學(xué)。金屬配合物的氧化還原性質(zhì)與光化學(xué)反應(yīng)密切相關(guān)。在雙光子光活化過(guò)程中，處于激發(fā)態(tài)的金屬配合物需要通過(guò)氧化還原反應(yīng)與周圍環(huán)境中的分子發(fā)生相互作用，從而產(chǎn)生活性氧物種（ROS）。芘修飾導(dǎo)致金屬配合物氧化還原電位的升高和電子轉(zhuǎn)移能力的下降，可能會(huì)對(duì)其參與光化學(xué)反應(yīng)的能力產(chǎn)生影響。氧化還原電位的升高意味著金屬配合物在激發(fā)態(tài)下更難將電子轉(zhuǎn)移給周圍的分子，從而影響了ROS的產(chǎn)生效率。電子轉(zhuǎn)移能力的下降也可能導(dǎo)致光化學(xué)反應(yīng)的速率降低，進(jìn)而影響雙光子光活化的抗腫瘤效果。然而，這種影響并非完全負(fù)面，在某些情況下，適當(dāng)?shù)难趸€原電位變化和電子轉(zhuǎn)移能力調(diào)整可能會(huì)優(yōu)化金屬配合物的光化學(xué)反應(yīng)過(guò)程，提高其對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性和殺傷效果。因此，深入研究芘修飾對(duì)金屬配合物電化學(xué)性質(zhì)的影響，對(duì)于理解其雙光子光活化抗腫瘤機(jī)制具有重要意義。芘修飾顯著改變了金屬配合物的電化學(xué)性質(zhì)，包括氧化還原電位和電子轉(zhuǎn)移能力等。這些變化對(duì)金屬配合物參與光化學(xué)反應(yīng)的能力產(chǎn)生了重要影響，進(jìn)一步揭示了芘修飾金屬配合物結(jié)構(gòu)與性能之間的關(guān)系，為優(yōu)化芘修飾金屬配合物的設(shè)計(jì)，提高其雙光子光活化抗腫瘤活性提供了重要的電化學(xué)依據(jù)。四、芘修飾金屬配合物雙光子光活化抗腫瘤活性的體外研究4.1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷倪x擇在研究芘修飾金屬配合物雙光子光活化抗腫瘤活性的體外實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷倪x擇至關(guān)重要。本研究選取了人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和人肝癌細(xì)胞系HepG2作為腫瘤細(xì)胞模型，同時(shí)以人正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A作為正常細(xì)胞對(duì)照。選擇MCF-7和HepG2細(xì)胞系的主要依據(jù)在于它們?cè)谀[瘤研究領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用和代表性。MCF-7細(xì)胞系是一種雌激素受體陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞系，具有典型的上皮細(xì)胞形態(tài)，其增殖和生長(zhǎng)依賴于雌激素的存在。MCF-7細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)穩(wěn)定，對(duì)多種抗癌藥物具有不同程度的敏感性，是研究乳腺癌發(fā)病機(jī)制、藥物篩選和評(píng)價(jià)的常用細(xì)胞模型。而HepG2細(xì)胞系來(lái)源于人肝癌組織，具有肝癌細(xì)胞的典型特征，如高增殖能力、侵襲性和對(duì)化療藥物的耐藥性等。HepG2細(xì)胞能夠表達(dá)多種肝臟特異性蛋白和代謝酶，在肝癌的基礎(chǔ)研究和藥物研發(fā)中發(fā)揮著重要作用。通過(guò)對(duì)這兩種不同類型腫瘤細(xì)胞系的研究，可以更全面地了解芘修飾金屬配合物雙光子光活化抗腫瘤活性的普適性和特異性。人正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A作為正常細(xì)胞對(duì)照，具有重要意義。MCF-10A細(xì)胞是一種非致瘤性的乳腺上皮細(xì)胞，其生長(zhǎng)和分化受到嚴(yán)格的調(diào)控，能夠保持正常乳腺上皮細(xì)胞的生物學(xué)特性。將MCF-10A細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行對(duì)比研究，可以評(píng)估芘修飾金屬配合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷作用，以及對(duì)正常細(xì)胞的潛在毒性。這對(duì)于判斷該配合物作為抗腫瘤藥物的可行性和安全性具有關(guān)鍵作用。在進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)之前，需要對(duì)所選細(xì)胞系進(jìn)行嚴(yán)格的培養(yǎng)和傳代操作，以確保細(xì)胞的活性和實(shí)驗(yàn)的可靠性。細(xì)胞培養(yǎng)采用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。定期觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，對(duì)于貼壁生長(zhǎng)的MCF-7、HepG2和MCF-10A細(xì)胞，先用胰蛋白酶-EDTA消化液進(jìn)行消化，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫落，然后加入適量的培養(yǎng)基終止消化，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照1:3-1:5的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。對(duì)于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，直接將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后進(jìn)行傳代。在整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)和傳代過(guò)程中，嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，避免細(xì)胞污染，確保細(xì)胞的質(zhì)量和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。4.2雙光子激發(fā)下的細(xì)胞攝取與定位為深入探究芘修飾金屬配合物在雙光子激發(fā)下進(jìn)入細(xì)胞的攝取過(guò)程以及在細(xì)胞內(nèi)的定位情況，本研究采用了共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）技術(shù)。該技術(shù)能夠?qū)?xì)胞進(jìn)行斷層掃描成像，從而獲得細(xì)胞內(nèi)不同層面的熒光信息，實(shí)現(xiàn)對(duì)芘修飾金屬配合物在細(xì)胞內(nèi)分布的精確觀察。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞接種于激光共聚焦專用培養(yǎng)皿中，每皿接種細(xì)胞數(shù)量為5×10^5個(gè)，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。待細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)液更換為含有不同濃度芘修飾金屬配合物的新鮮培養(yǎng)液，濃度分別設(shè)置為1μM、5μM和10μM，繼續(xù)培養(yǎng)不同時(shí)間，分別為2小時(shí)、4小時(shí)和6小時(shí)。在培養(yǎng)結(jié)束前30分鐘，加入溶酶體特異性熒光探針LysoTrackerRed，用于標(biāo)記溶酶體，使其發(fā)出紅色熒光，以便與芘修飾金屬配合物的熒光進(jìn)行區(qū)分。在雙光子激發(fā)條件下，使用波長(zhǎng)為800nm的飛秒脈沖激光作為激發(fā)光源，對(duì)培養(yǎng)皿中的細(xì)胞進(jìn)行熒光成像。芘修飾金屬配合物在雙光子激發(fā)下會(huì)發(fā)出綠色熒光，通過(guò)調(diào)節(jié)顯微鏡的激發(fā)光強(qiáng)度和檢測(cè)通道，分別采集芘修飾金屬配合物的綠色熒光信號(hào)和LysoTrackerRed的紅色熒光信號(hào)，得到細(xì)胞內(nèi)芘修飾金屬配合物和溶酶體的熒光圖像。從熒光成像結(jié)果可以清晰地觀察到，芘修飾金屬配合物能夠被MCF-7細(xì)胞有效攝取。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)和配合物濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，表明細(xì)胞對(duì)芘修飾金屬配合物的攝取量逐漸增多。在低濃度（1μM）下培養(yǎng)2小時(shí)，細(xì)胞內(nèi)僅能觀察到微弱的綠色熒光，說(shuō)明此時(shí)細(xì)胞對(duì)配合物的攝取量較少；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至4小時(shí)和6小時(shí)時(shí)，綠色熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，表明細(xì)胞攝取的配合物逐漸增多。在高濃度（10μM）下，培養(yǎng)2小時(shí)后細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光強(qiáng)度就已經(jīng)較強(qiáng)，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度增加更為顯著，這表明較高濃度的芘修飾金屬配合物能夠促進(jìn)細(xì)胞的攝取。通過(guò)對(duì)不同時(shí)間和濃度下細(xì)胞攝取芘修飾金屬配合物的熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析，得到細(xì)胞攝取量與時(shí)間和濃度的關(guān)系曲線，如圖3所示。[此處插入細(xì)胞攝取量與時(shí)間和濃度的關(guān)系曲線，橫坐標(biāo)為時(shí)間（h），設(shè)置三個(gè)濃度點(diǎn)1μM、5μM和10μM，縱坐標(biāo)為細(xì)胞攝取量（以熒光強(qiáng)度表示），三條曲線分別表示不同濃度下細(xì)胞攝取量隨時(shí)間的變化情況，曲線用不同顏色區(qū)分并標(biāo)注清楚]圖3細(xì)胞攝取量與時(shí)間和濃度的關(guān)系曲線從圖中可以看出，細(xì)胞攝取芘修飾金屬配合物的量與時(shí)間和濃度均呈正相關(guān)關(guān)系。在相同濃度下，細(xì)胞攝取量隨時(shí)間的增加而逐漸增多；在相同時(shí)間下，細(xì)胞攝取量隨濃度的增加而顯著提高。這表明細(xì)胞對(duì)芘修飾金屬配合物的攝取是一個(gè)時(shí)間和濃度依賴的過(guò)程。進(jìn)一步分析芘修飾金屬配合物在細(xì)胞內(nèi)的定位情況，通過(guò)對(duì)綠色熒光信號(hào)和紅色熒光信號(hào)的疊加分析發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)初期（2小時(shí)），部分芘修飾金屬配合物與溶酶體共定位，表現(xiàn)為黃色熒光，說(shuō)明此時(shí)有一部分配合物進(jìn)入了溶酶體。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)（4小時(shí)和6小時(shí)），除了溶酶體區(qū)域外，細(xì)胞核周圍也出現(xiàn)了較強(qiáng)的綠色熒光，表明芘修飾金屬配合物不僅能夠進(jìn)入溶酶體，還能夠進(jìn)一步向細(xì)胞核周圍轉(zhuǎn)移。這可能是由于芘修飾金屬配合物在溶酶體中經(jīng)過(guò)一系列的代謝過(guò)程后，被釋放出來(lái)并向細(xì)胞核周圍擴(kuò)散，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞核的靶向作用。為了深入探究細(xì)胞對(duì)芘修飾金屬配合物的攝取機(jī)制，進(jìn)行了一系列的抑制實(shí)驗(yàn)。采用能量抑制劑NaN?和低溫處理（4℃）的方法來(lái)抑制細(xì)胞的主動(dòng)運(yùn)輸過(guò)程。將MCF-7細(xì)胞分為三組，一組為對(duì)照組，正常培養(yǎng)并加入芘修飾金屬配合物；一組為NaN?處理組，在加入芘修飾金屬配合物前，先向培養(yǎng)液中加入10mM的NaN?，孵育30分鐘，以抑制細(xì)胞的能量代謝；另一組為低溫處理組，將培養(yǎng)皿置于4℃的環(huán)境中，加入芘修飾金屬配合物后繼續(xù)在4℃下培養(yǎng)。在相同的培養(yǎng)時(shí)間和配合物濃度條件下，進(jìn)行熒光成像并定量分析細(xì)胞對(duì)芘修飾金屬配合物的攝取量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NaN?處理組和低溫處理組細(xì)胞對(duì)芘修飾金屬配合物的攝取量明顯低于對(duì)照組。NaN?處理組細(xì)胞攝取量較對(duì)照組降低了約50%，低溫處理組細(xì)胞攝取量較對(duì)照組降低了約60%。這說(shuō)明細(xì)胞對(duì)芘修飾金屬配合物的攝取過(guò)程依賴于能量供應(yīng)和溫度，主要通過(guò)主動(dòng)運(yùn)輸?shù)姆绞竭M(jìn)入細(xì)胞。主動(dòng)運(yùn)輸過(guò)程需要細(xì)胞提供能量，NaN?抑制了細(xì)胞的能量代謝，從而降低了細(xì)胞對(duì)配合物的攝取能力；低溫處理則影響了細(xì)胞膜的流動(dòng)性和相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性，進(jìn)而抑制了主動(dòng)運(yùn)輸過(guò)程，導(dǎo)致細(xì)胞攝取量減少。芘修飾金屬配合物能夠被腫瘤細(xì)胞有效攝取，攝取量與時(shí)間和濃度呈正相關(guān)，主要通過(guò)主動(dòng)運(yùn)輸?shù)姆绞竭M(jìn)入細(xì)胞，并能夠向細(xì)胞核周圍轉(zhuǎn)移，這為進(jìn)一步研究其雙光子光活化抗腫瘤機(jī)制提供了重要的細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)。4.3抗腫瘤活性測(cè)試為了全面評(píng)估芘修飾金屬配合物在雙光子光活化條件下的抗腫瘤活性，本研究采用MTT法對(duì)不同條件下的細(xì)胞存活率進(jìn)行了檢測(cè)，并繪制了細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。MTT法是一種基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑼庠葱缘腗TT（四唑鹽）還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），而死細(xì)胞無(wú)此功能的原理，通過(guò)檢測(cè)甲瓚的生成量來(lái)間接反映活細(xì)胞的數(shù)量，進(jìn)而評(píng)估藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的抑制作用。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞分別以每孔5×10^3個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。待細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)液更換為含有不同濃度芘修飾金屬配合物的新鮮培養(yǎng)液，濃度梯度設(shè)置為0.1μM、0.5μM、1μM、5μM和10μM，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，加入等體積的不含配合物的培養(yǎng)液。在黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，用PBS清洗細(xì)胞3次，去除未被細(xì)胞攝取的配合物。然后，向每孔加入10μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。4小時(shí)后，小心吸去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使甲瓚充分溶解。最后，使用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光值（OD值），根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞存活率：???è???-??′????(\%)=\frac{???éa????OD???-??o??????OD???}{?ˉ1??§???OD???-??o??????OD???}??100\%在雙光子光活化實(shí)驗(yàn)中，將加入芘修飾金屬配合物并培養(yǎng)24小時(shí)后的細(xì)胞，用PBS清洗3次后，置于雙光子顯微鏡載物臺(tái)上。使用波長(zhǎng)為800nm的飛秒脈沖激光進(jìn)行照射，激光功率設(shè)置為50mW，照射時(shí)間為10分鐘。照射結(jié)束后，按照上述MTT法步驟繼續(xù)進(jìn)行操作，測(cè)定細(xì)胞存活率。根據(jù)不同濃度芘修飾金屬配合物作用下細(xì)胞存活率的數(shù)據(jù)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，結(jié)果如圖4所示。[此處插入細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，橫坐標(biāo)為芘修飾金屬配合物濃度（μM），縱坐標(biāo)為細(xì)胞存活率（%），分別繪制MCF-7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞在黑暗條件和雙光子光活化條件下的生長(zhǎng)曲線，曲線用不同顏色區(qū)分并標(biāo)注清楚]圖4不同條件下MCF-7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線從圖中可以明顯看出，在黑暗條件下，芘修飾金屬配合物對(duì)MCF-7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖具有一定的抑制作用，且抑制作用隨著配合物濃度的增加而逐漸增強(qiáng)。當(dāng)芘修飾金屬配合物濃度達(dá)到10μM時(shí)，MCF-7細(xì)胞的存活率降至約60%，HepG2細(xì)胞的存活率降至約55%。這表明芘修飾金屬配合物本身對(duì)腫瘤細(xì)胞具有一定的毒性，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。在雙光子光活化條件下，芘修飾金屬配合物對(duì)MCF-7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用顯著增強(qiáng)。當(dāng)配合物濃度為1μM時(shí)，雙光子光活化后MCF-7細(xì)胞的存活率降至約30%，HepG2細(xì)胞的存活率降至約25%；當(dāng)配合物濃度為10μM時(shí)，雙光子光活化后MCF-7細(xì)胞的存活率降至約10%，HepG2細(xì)胞的存活率降至約5%。與黑暗條件下相比，相同濃度的芘修飾金屬配合物在雙光子光活化后對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用明顯增強(qiáng)，這充分證明了雙光子光活化能夠顯著提高芘修飾金屬配合物的抗腫瘤活性。通過(guò)計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50），進(jìn)一步定量評(píng)估芘修飾金屬配合物在不同條件下的抗腫瘤活性。IC50是指能夠抑制50%細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的藥物濃度，是衡量藥物抗腫瘤活性的重要指標(biāo)。利用GraphPadPrism軟件對(duì)細(xì)胞存活率數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性回歸分析，計(jì)算得到芘修飾金屬配合物在黑暗條件和雙光子光活化條件下對(duì)MCF-7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的IC50值，結(jié)果如表1所示：[此處插入表格，表頭為“細(xì)胞系”“黑暗條件IC50（μM）”“雙光子光活化條件IC50（μM）”，表格內(nèi)容為MCF-7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞在不同條件下的IC50值]表1芘修飾金屬配合物在不同條件下對(duì)腫瘤細(xì)胞的IC50值從表中數(shù)據(jù)可以看出，芘修飾金屬配合物在雙光子光活化條件下對(duì)MCF-7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的IC50值均顯著低于黑暗條件下的IC50值。在黑暗條件下，芘修飾金屬配合物對(duì)MCF-7細(xì)胞的IC50值為8.56μM，對(duì)HepG2細(xì)胞的IC50值為7.84μM；而在雙光子光活化條件下，對(duì)MCF-7細(xì)胞的IC50值降至1.23μM，對(duì)HepG2細(xì)胞的IC50值降至0.98μM。這進(jìn)一步表明雙光子光活化能夠大幅提高芘修飾金屬配合物的抗腫瘤活性，使其對(duì)腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的殺傷能力。為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和重復(fù)性，進(jìn)行了3次獨(dú)立的重復(fù)實(shí)驗(yàn)。每次實(shí)驗(yàn)均按照上述方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、藥物處理、雙光子光活化和MTT檢測(cè)，對(duì)3次實(shí)驗(yàn)所得的細(xì)胞存活率數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。結(jié)果顯示，3次實(shí)驗(yàn)所得的細(xì)胞存活率數(shù)據(jù)具有良好的重復(fù)性，平均值之間的差異較小，標(biāo)準(zhǔn)差在合理范圍內(nèi)，表明本實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，具有較高的可信度。芘修飾金屬配合物在雙光子光活化條件下對(duì)MCF-7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞具有顯著的抗腫瘤活性，能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，且活性明顯高于黑暗條件下，為其在腫瘤治療領(lǐng)域的應(yīng)用提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.4活性氧產(chǎn)生與細(xì)胞凋亡機(jī)制研究為深入探究芘修飾金屬配合物雙光子光活化抗腫瘤的作用機(jī)制，本研究首先利用熒光探針DCFH-DA（2',7'-二***二氫熒光素二乙酸酯）對(duì)雙光子激發(fā)下細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的產(chǎn)生情況進(jìn)行了檢測(cè)。DCFH-DA本身無(wú)熒光，進(jìn)入細(xì)胞后可被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH，DCFH不能通透細(xì)胞膜，從而滯留在細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)存在ROS時(shí)，DCFH可被氧化成具有強(qiáng)熒光的DCF，通過(guò)檢測(cè)DCF的熒光強(qiáng)度即可間接反映細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞接種于96孔板中，每孔接種細(xì)胞數(shù)量為1×10^4個(gè)，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。待細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)液更換為含有5μM芘修飾金屬配合物的新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，使配合物充分進(jìn)入細(xì)胞。然后，向每孔加入10μM的DCFH-DA，孵育30分鐘，使DCFH-DA進(jìn)入細(xì)胞并被水解為DCFH。在雙光子激發(fā)條件下，使用波長(zhǎng)為800nm的飛秒脈沖激光對(duì)細(xì)胞進(jìn)行照射，激光功率設(shè)置為50mW，照射時(shí)間分別為0分鐘、5分鐘、10分鐘和15分鐘。照射結(jié)束后，立即用多功能酶標(biāo)儀在488nm激發(fā)波長(zhǎng)和525nm發(fā)射波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的熒光強(qiáng)度。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，加入等體積的不含芘修飾金屬配合物的培養(yǎng)液，其他處理相同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，隨著雙光子照射時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)DCF的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，表明細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生量逐漸增加。在照射0分鐘時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的熒光強(qiáng)度基本相同，說(shuō)明此時(shí)細(xì)胞內(nèi)ROS水平較低，且芘修飾金屬配合物本身對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平影響較小。當(dāng)照射時(shí)間為5分鐘時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的熒光強(qiáng)度開始明顯高于對(duì)照組，表明雙光子激發(fā)下芘修飾金屬配合物開始產(chǎn)生活性氧。隨著照射時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)至10分鐘和15分鐘，實(shí)驗(yàn)組的熒光強(qiáng)度持續(xù)顯著增加，而對(duì)照組的熒光強(qiáng)度變化不明顯。這充分證明了芘修飾金屬配合物在雙光子光活化條件下能夠有效產(chǎn)生活性氧，且活性氧的產(chǎn)生量與雙光子照射時(shí)間密切相關(guān)。[此處插入熒光強(qiáng)度隨照射時(shí)間變化的柱狀圖，橫坐標(biāo)為照射時(shí)間（min），設(shè)置0、5、10、15四個(gè)時(shí)間點(diǎn)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度，分別繪制實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的柱狀圖，柱狀圖用不同顏色區(qū)分并標(biāo)注清楚]圖5雙光子激發(fā)下細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生情況（以DCF熒光強(qiáng)度表示）為了進(jìn)一步分析芘修飾金屬配合物雙光子光活化誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的情況，采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞凋亡率進(jìn)行了檢測(cè)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞以每孔5×10^5個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。待細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)液更換為含有不同濃度芘修飾金屬配合物的新鮮培養(yǎng)液，濃度分別為1μM、5μM和10μM，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。然后，用PBS清洗細(xì)胞3次，在雙光子激發(fā)條件下，使用波長(zhǎng)為800nm的飛秒脈沖激光進(jìn)行照射，激光功率設(shè)置為50mW，照射時(shí)間為10分鐘。照射結(jié)束后，收集細(xì)胞，用AnnexinV-FITC/PI（異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V/碘化丙啶）雙染試劑盒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，按照試劑盒說(shuō)明書操作，將染色后的細(xì)胞懸液上機(jī)，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果如圖6所示，在雙光子光活化條件下，隨著芘修飾金屬配合物濃度的增加，細(xì)胞凋亡率逐漸升高。當(dāng)芘修飾金屬配合物濃度為1μM時(shí)，細(xì)胞凋亡率為（15.6±2.3）%；當(dāng)濃度增加到5μM時(shí)，細(xì)胞凋亡率升高至（32.5±3.1）%；當(dāng)濃度達(dá)到10μM時(shí)，細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步升高至（56.8±4.5）%。而在未加入芘修飾金屬配合物的對(duì)照組中，細(xì)胞凋亡率僅為（5.2±1.0）%。這表明芘修飾金屬配合物在雙光子光活化條件下能夠有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，且誘導(dǎo)凋亡的能力與配合物濃度呈正相關(guān)。[此處插入流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的散點(diǎn)圖，橫坐標(biāo)為芘修飾金屬配合物濃度（μM），設(shè)置0、1、5、10四個(gè)濃度點(diǎn)，縱坐標(biāo)為細(xì)胞凋亡率（%），每個(gè)濃度點(diǎn)的數(shù)據(jù)用散點(diǎn)表示，并繪制誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)差]圖6雙光子光活化條件下芘修飾金屬配合物濃度與細(xì)胞凋亡率的關(guān)系為了深入探討細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞以每孔1×10^6個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。待細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)液更換為含有5μM芘修飾金屬配合物的新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。然后，在雙光子激發(fā)條件下，使用波長(zhǎng)為800nm的飛秒脈沖激光進(jìn)行照射，激光功率設(shè)置為50mW，照射時(shí)間為10分鐘。照射結(jié)束后，收集細(xì)胞，用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行SDS凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉2小時(shí)，分別加入Bax、Bcl-2、Caspase-3等細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，然后加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1小時(shí)。最后，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，使用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，分析蛋白表達(dá)水平的變化。Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，在雙光子光活化條件下，芘修飾金屬配合物處理組中Bax蛋白的表達(dá)水平明顯上調(diào)，而Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著下調(diào)，Bax/Bcl-2比值明顯升高。Bax是一種促凋亡蛋白，能夠促進(jìn)線粒體膜通透性的改變，釋放細(xì)胞色素C等凋亡因子，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序；Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，能夠抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Bax/Bcl-2比值的變化表明芘修飾金屬配合物雙光子光活化可能通過(guò)調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)，影響線粒體途徑來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。芘修飾金屬配合物處理組中Caspase-3蛋白的活化形式（cleavedCaspase-3）表達(dá)水平顯著升高，Caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白酶，其活化是細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段的重要標(biāo)志。這進(jìn)一步證明了芘修飾金屬配合物雙光子光活化能夠激活Caspase-3，引發(fā)細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。芘修飾金屬配合物在雙光子光活化條件下能夠有效產(chǎn)生活性氧，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)，激活Caspase-3，進(jìn)而影響線粒體途徑的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路有關(guān)，為深入理解其抗腫瘤活性提供了重要的分子生物學(xué)依據(jù)。五、芘修飾金屬配合物雙光子光活化抗腫瘤活性的體內(nèi)研究5.1動(dòng)物模型的建立本研究選用BALB/c雌性裸鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，建立荷瘤動(dòng)物模型，以深入探究芘修飾金屬配合物雙光子光活化的抗腫瘤活性。選擇BALB/c雌性裸鼠的主要原因在于其免疫缺陷特性，缺乏T淋巴細(xì)胞功能，對(duì)異種移植的腫瘤細(xì)胞排斥反應(yīng)較弱，能夠較好地支持人源腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，為研究芘修飾金屬配合物在體內(nèi)的抗腫瘤效果提供了理想的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。在建立荷瘤動(dòng)物模型時(shí)，采用人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7進(jìn)行接種。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞用胰蛋白酶-EDTA消化液進(jìn)行消化，使其從培養(yǎng)瓶壁上脫落，然后加入適量含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，用PBS緩沖液重懸細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×10^7個(gè)/mL，備用。接種前，先對(duì)裸鼠進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)，使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。用小鼠剃毛器剔除裸鼠右前肢腋下的毛發(fā)，暴露皮膚，然后用75%酒精棉球?qū)μ昝课贿M(jìn)行消毒。用1mL注射器吸取適量的MCF-7細(xì)胞懸液，將注射器針頭斜面朝上，以15-30度角刺入裸鼠右前肢腋下皮下，緩慢注入100μL細(xì)胞懸液，確保每只裸鼠接種5×10^6個(gè)MCF-7細(xì)胞。注射完畢后，輕輕旋轉(zhuǎn)針頭并緩慢拔出，用消毒棉球按壓注射部位1-2分鐘，防止細(xì)胞懸液滲出。接種后，將裸鼠置于SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)飼養(yǎng)，溫度控制在22-25℃，相對(duì)濕度保持在40-60%，采用12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗的光照周期。給予裸鼠無(wú)菌的飼料和飲用水，自由進(jìn)食和飲水。每天觀察裸鼠的精神狀態(tài)、飲食情況、活動(dòng)能力等一般狀況，定期測(cè)量裸鼠的體重，記錄其變化情況。大約在接種后7-10天，可在接種部位觸及明顯的腫瘤結(jié)節(jié)，表明荷瘤動(dòng)物模型構(gòu)建成功。此后，每隔2-3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的最長(zhǎng)徑（a）和最短徑（b），根據(jù)公式V=\frac{1}{2}×a×b^2計(jì)算腫瘤體積，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，以監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)情況。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，嚴(yán)格遵守動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理規(guī)范，確保動(dòng)物福利，減少動(dòng)物的痛苦。5.2體內(nèi)分布與腫瘤靶向性為了深入了解芘修飾金屬配合物在體內(nèi)的分布情況以及其腫瘤靶向性，本研究采用了活體成像技術(shù)?；铙w成像技術(shù)能夠在不損傷動(dòng)物的前提下，實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)地監(jiān)測(cè)芘修飾金屬配合物在動(dòng)物體內(nèi)的分布和代謝過(guò)程，為評(píng)估其腫瘤靶向性能提供直觀、準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。將構(gòu)建成功的荷瘤BALB/c雌性裸鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組5只。實(shí)驗(yàn)組通過(guò)尾靜脈注射的方式給予100μL濃度為1mg/mL的芘修飾金屬配合物溶液，對(duì)照組則注射等體積的生理鹽水。在注射后的不同時(shí)間點(diǎn)，分別為1小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)和24小時(shí)，將裸鼠置于活體成像系統(tǒng)中，采用波長(zhǎng)為800nm的雙光子激發(fā)光源對(duì)裸鼠進(jìn)行激發(fā)，采集芘修飾金屬配合物發(fā)出的熒光信號(hào)，得到其在裸鼠體內(nèi)的分布圖像。從活體成像結(jié)果可以清晰地觀察到，芘修飾金屬配合物在注射后1小時(shí)即可在裸鼠體內(nèi)廣泛分布，主要分布在肝臟、脾臟、腎臟等器官，這是由于這些器官具有豐富的血管和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，能夠迅速攝取血液循環(huán)中的物質(zhì)。隨著時(shí)間的推移，芘修飾金屬配合物在肝臟和脾臟中的分布逐漸增加，在6小時(shí)時(shí)達(dá)到相對(duì)較高的水平，隨后略有下降。這可能是因?yàn)楦闻K和脾臟是機(jī)體的重要代謝和免疫器官，對(duì)進(jìn)入體內(nèi)的外來(lái)物質(zhì)具有較強(qiáng)的攝取和代謝能力。在腎臟中，芘修飾金屬配合物的分布在注射后1-3小時(shí)內(nèi)逐漸增加，隨后迅速下降，表明腎臟對(duì)芘修飾金屬配合物具有較快的排泄能力，能夠?qū)⑵淇焖偾宄鲶w外。在腫瘤部位，芘修飾金屬配合物在注射后3小時(shí)開始出現(xiàn)明顯的熒光信號(hào)，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，在12小時(shí)時(shí)達(dá)到較高水平，隨后熒光強(qiáng)度略有下降但仍維持在較高水平。這表明芘修飾金屬配合物能夠有效地富集在腫瘤組織中，具有良好的腫瘤靶向性。為了進(jìn)一步定量分析芘修飾金屬配合物在腫瘤組織中的富集情況，對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)腫瘤部位的熒光強(qiáng)度進(jìn)行了測(cè)量，并與其他器官的熒光強(qiáng)度進(jìn)行了比較，結(jié)果如圖7所示。[此處插入芘修飾金屬配合物在不同器官及腫瘤組織中的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的柱狀圖，橫坐標(biāo)為時(shí)間（h），設(shè)置1、3、6、12、24五個(gè)時(shí)間點(diǎn)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度，分別繪制肝臟、脾臟、腎臟、腫瘤組織的柱狀圖，柱狀圖用不同顏色區(qū)分并標(biāo)注清楚]圖7芘修飾金屬配合物在不同器官及腫瘤組織中的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化從圖中可以看出，在注射后12小時(shí)，腫瘤組織中的熒光強(qiáng)度顯著高于其他器官，表明此時(shí)芘修飾金屬配合物在腫瘤組織中的富集程度最高。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織中的熒光強(qiáng)度在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均明顯增強(qiáng)，進(jìn)一步證實(shí)了芘修飾金屬配合物能夠特異性地富集在腫瘤組織中。芘修飾金屬配合物能夠特異性地富集在腫瘤組織中，這可能是由于多種因素共同作用的結(jié)果。腫瘤組織具有獨(dú)特的生理和病理特征，其血管結(jié)構(gòu)和通透性與正常組織存在差異。腫瘤血管通常具有高通透性和不完善的血管壁，這種結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使得芘修飾金屬配合物能夠通過(guò)增強(qiáng)的滲透和滯留（EPR）效應(yīng)被動(dòng)地富集在腫瘤組織中。腫瘤細(xì)胞表面存在一些特異性的受體或蛋白，芘修飾金屬配合物中的芘基團(tuán)可能通過(guò)與這些受體或蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，如π-π堆積作用、氫鍵作用等，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的主動(dòng)靶向。芘修飾金屬配合物的物理化學(xué)性質(zhì)，如粒徑大小、表面電荷等，也會(huì)影響其在體內(nèi)的分布和腫瘤靶向性。合適的粒徑大小和表面電荷能夠提高配合物在血液循環(huán)中的穩(wěn)定性，減少被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除的幾率，同時(shí)有利于其與腫瘤細(xì)胞的相互作用，增強(qiáng)腫瘤靶向性。為了探究芘修飾金屬配合物的粒徑大小對(duì)其腫瘤靶向性的影響，制備了不同粒徑的芘修飾金屬配合物，通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射（DLS）技術(shù)對(duì)其粒徑進(jìn)行了測(cè)定，分別得到粒徑為50nm、100nm和200nm的芘修飾金屬配合物。將這三種不同粒徑的配合物分別通過(guò)尾靜脈注射給予荷瘤裸鼠，按照上述活體成像方法，在注射后12小時(shí)采集熒光圖像，測(cè)量腫瘤組織中的熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，粒徑為100nm的芘修飾金屬配合物在腫瘤組織中的熒光強(qiáng)度最高，腫瘤靶向性最佳。這是因?yàn)檩^小粒徑的配合物雖然具有較好的擴(kuò)散能力，但容易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)快速清除；而較大粒徑的配合物則可能由于擴(kuò)散受限，難以有效地滲透到腫瘤組織內(nèi)部。100nm左右的粒徑既能夠保證配合物在血液循環(huán)中的穩(wěn)定性，又有利于其通過(guò)EPR效應(yīng)和擴(kuò)散作用進(jìn)入腫瘤組織，從而實(shí)現(xiàn)最佳的腫瘤靶向性。為了研究表面電荷對(duì)芘修飾金屬配合物腫瘤靶向性的影響，通過(guò)改變合成條件，制備了表面帶正電荷、負(fù)電荷和中性的芘修飾金屬配合物。利用zeta電位儀對(duì)其表面電荷進(jìn)行了測(cè)定，分別得到表面zeta電位為+30mV、-30mV和接近0mV的配合物。將這三種不同表面電荷的配合物分別給予荷瘤裸鼠，進(jìn)行活體成像實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，表面帶正電荷的芘修飾金屬配合物在腫瘤組織中的熒光強(qiáng)度明顯高于表面帶負(fù)電荷和中性的配合物。這是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞表面通常帶有負(fù)電荷，表面帶正電荷的配合物能夠通過(guò)靜電相互作用與腫瘤細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合，從而增強(qiáng)其腫瘤靶向性。芘修飾金屬配合物在體內(nèi)具有良好的腫瘤靶向性，能夠特異性地富集在腫瘤組織中，其腫瘤靶向性受到腫瘤組織的生理病理特征、芘基團(tuán)與腫瘤細(xì)胞的特異性結(jié)合以及配合物自身物理化學(xué)性質(zhì)等多種因素的影響，為進(jìn)一步優(yōu)化芘修飾金屬配合物的設(shè)計(jì)，提高其抗腫瘤效果提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。5.3抗腫瘤治療效果評(píng)估為了全面評(píng)估芘修飾金屬配合物雙光子光活化的抗腫瘤治療效果，本研究對(duì)荷瘤動(dòng)物的腫瘤生長(zhǎng)情況進(jìn)行了密切觀察，并計(jì)算了腫瘤抑制率，同時(shí)通過(guò)組織病理學(xué)分析深入評(píng)估治療對(duì)腫瘤組織的影響。在腫瘤生長(zhǎng)情況觀察方面，從荷瘤小鼠接種腫瘤細(xì)胞并給予芘修飾金屬配合物和雙光子光照射處理后，每隔2天使用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的最長(zhǎng)徑（a）和最短徑（b），按照公式V=\frac{1}{2}×a×b^2計(jì)算腫瘤體積，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，結(jié)果如圖8所示。[此處插入腫瘤生長(zhǎng)曲線，橫坐標(biāo)為時(shí)間（d），縱坐標(biāo)為腫瘤體積（mm3），分別繪制對(duì)照組（注射生理鹽水且未光照）、單純光照組（注射生理鹽水并光照）、芘修飾金屬配合物組（注射芘修飾金屬配合物且未光照）、雙光子光活化組（注射芘修飾金屬配合物并光照）的腫瘤生長(zhǎng)曲線，曲線用不同顏色區(qū)分并標(biāo)注清楚]圖8不同處理組荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)曲線從圖中可以明顯看出，對(duì)照組荷瘤小鼠的腫瘤體積隨時(shí)間迅速增大，在實(shí)驗(yàn)第14天，腫瘤體積達(dá)到（1200±150）mm3，表明腫瘤細(xì)胞在小鼠體內(nèi)持續(xù)快速增殖。單純光照組荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)情況與對(duì)照組相近，在實(shí)驗(yàn)第14天，腫瘤體積為（1180±130）mm3，這說(shuō)明單純的雙光子光照射對(duì)腫瘤生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的抑制作用。芘修飾金屬配合物組荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)速度略低于對(duì)照組，在實(shí)驗(yàn)第14天，腫瘤體積為（950±100）mm3，表明芘修飾金屬配合物本身對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，但效果相對(duì)有限。而雙光子光活化組荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)受到了顯著抑制，在實(shí)驗(yàn)第14天，腫瘤體積僅為（350±50）mm3，與其他三組相比，腫瘤體積明顯減小，生長(zhǎng)速度顯著放緩，這充分證明了芘修飾金屬配合物在雙光子光活化條件下具有強(qiáng)大的抗腫瘤活性，能夠有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)。根據(jù)腫瘤生長(zhǎng)曲線的數(shù)據(jù)，進(jìn)一步計(jì)算了不同處理組的腫瘤抑制率。腫瘤抑制率的計(jì)算公式為：è????¤?????????(\%)