3.2基因工程的基本操作程序課件-高二下學期生物人教版選擇性必修3（第二課時）

第3章第2節(jié)第二步：基因表達載體的構建二/第一步：目的基因的篩選與獲取一/第三步：將目的基因?qū)胧荏w細胞三/第四步：目的基因的檢測與鑒定四/DNA片段的擴增及電泳鑒定五/一基因表達載體的構建思考：如何獲得一只熒光魚基因工程的操作步驟1.目的基因的篩選與獲取2.基因表達載體構建（核心）3.將目的基因?qū)胧荏w細胞4.目的基因的檢測和鑒定任務一：基因表達載體的構建活動1：構建gfp基因的表達載體問題1：為什么構建gfp基因的表達載體？①直接將生物的所有DNA導入受體，針對性差，無法確定是否導入受體細胞根據(jù)閱讀獲得的信息，思考下列問題：②目的基因?qū)胧荏w，往往會被細胞分泌的酶分解消化掉，不能表達③目的基因游離的DNA片段無法隨著細胞的分裂進行復制，導致子代細胞不含有該基因④目的基因不含有表達元件，如啟動子、終止子等，無法直接表達一基因表達載體的構建任務一：基因表達載體的構建活動1：構建gfp基因的表達載體問題2：表達載體由哪些元件組成？復制原點根據(jù)閱讀獲得的信息，思考下列問題：復制原點標記基因XbaⅠHindⅢBamHⅢSmaⅠ啟動子標記基因多克隆位點：多個限制酶切點啟動子終止子終止子一基因表達載體的構建一基因表達載體的構建1：表達載體(1)：表達載體組成①啟動子本質(zhì)：特殊序列結(jié)構的DNA片段位置：基因上游功能：RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終表達出來需要蛋白質(zhì)特性：對于多細胞受體生物，具有物種特異性和基因表達的組織細胞特異性限制酶切割位點一基因表達載體的構建1：表達載體(1)：表達載體組成①啟動子誘導型啟動子根據(jù)需要為目的基因加上受某種物質(zhì)或者環(huán)境因素影響而誘導表達的啟動子，使目的基因在受體生物細胞中的表達受到控制。如：雌激素誘導啟動子限制酶切割位點一基因表達載體的構建1：表達載體(1)：表達載體組成①啟動子不同類型啟動子組成型啟動子（一直干活）限制酶切割位點組織特性啟動子（特定組織中干活）誘導型啟動子（特定誘導物下干活）一基因表達載體的構建1：表達載體(1)：表達載體組成①啟動子本質(zhì)：特殊序列結(jié)構的DNA片段位置：基因下游功能：使轉(zhuǎn)錄在所需的地方停下來，即終止轉(zhuǎn)錄限制酶切割位點②終止子一基因表達載體的構建1：表達載體(1)：表達載體組成①啟動子位置：啟動子和終止子之間

本質(zhì)：一般具有多種限制酶的酶切位點功能：目的基因插入的部位限制酶切割位點②終止子③多克隆位點一基因表達載體的構建1：表達載體(1)：表達載體組成①啟動子類型：限制酶切割位點②終止子③多克隆位點④標記基因抗生素的抗性基因，如：抗氨芐青霉素基因、抗四環(huán)素基因熒光蛋白基因，如：綠色熒光蛋白基因（GFP）、紅色熒光蛋白基因（RFP）生化標記基因，如：lacZ（β半乳糖苷酶基因）營養(yǎng)缺陷型基因，如：合成某些氨基酸功能：便于重組DNA分子的篩選一基因表達載體的構建1：表達載體(1)：表達載體組成①啟動子特性：限制酶切割位點②終止子③多克隆位點④標記基因與特定的受體細胞相匹配。功能：外源基因在受體細胞中能穩(wěn)定復制并遺傳⑤復制原點任務一：基因表達載體的構建活動1：構建gfp基因的表達載體問題3：酶切位點為何要位于啟動子和終止子之間？酶切位點為目的基因的連接位點目的基因必需插入啟動子與終止子之間才能被轉(zhuǎn)錄一基因表達載體的構建（目的基因為何要連在啟動子和終止子之間？）限制酶切割位點箭頭表示的是：啟動子的轉(zhuǎn)錄方向即基因轉(zhuǎn)錄的方向一基因表達載體的構建1：表達載體(2)：表達載體構建過程①用一定的限制酶切割載體，使其出現(xiàn)一個切口。②用同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段③將切下的基因片段拼接到載體的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個重組DNA分子基因表達載體任務一：基因表達載體的構建活動1：構建gfp基因的表達載體問題5：雙酶切比單酶切有哪些優(yōu)點？根據(jù)閱讀獲得的信息，思考下列問題：目的基因不會被環(huán)化一基因表達載體的構建質(zhì)粒不會重新環(huán)化目的基因與質(zhì)粒不會發(fā)生反向連接任務一：基因表達載體的構建活動1：構建gfp基因的表達載體一基因表達載體的構建問題4：保證目的基因按照一定順序插入，反插會產(chǎn)生什么影響？正向插入反向插入5’3’3’5’5’3’3’5’編碼鏈模板鏈5’3’AAUGCACmRNA編碼鏈模板鏈GUGCAUUmRNA一基因表達載體的構建問題4：保證目的基因按照一定順序插入，反插會產(chǎn)生什么影響？5’-AAUGCAC-3’mRNA正向mRNA5’-GUGCAUU-3’mRNA反向mRNA5’-AAUGCAC-3’兩個mRNA恰好反向互補干擾翻譯的進行（類別表觀遺傳中反義RNA使基因沉默）任務一：基因表達載體的構建活動1：構建gfp基因的表達載體問題5：載體有哪些類型？表達載體相比，有哪些特點。根據(jù)閱讀獲得的信息，思考下列問題：一基因表達載體的構建pBR載體只有：復制起點+抗性基因+酶切位點這類載體能否表達呢？沒有啟動子、終止子等表達元件，無法表達。此類載體能復制，成為克隆載體。一基因表達載體的構建2：載體的類型（1）表達載體復制原點+

表達元件+酶切位點+標記基因

限制酶切割位點作用：目的基因在受體細胞內(nèi)表達，轉(zhuǎn)錄翻譯成蛋白質(zhì)。復制原點+酶切位點+標記基因

作用：目的基因在受體細胞內(nèi)大量復制，但不一定表達。（2）克隆載體一基因表達載體的構建限制酶切割位點①啟動子②終止子③多克隆位點（限制酶切位點）④標記基因⑤復制原點基因表達載體必須具備的條件基因克隆載體必須具備的條件2：載體的類型第二步：基因表達載體的構建二/第一步：目的基因的篩選與獲取一/第三步：將目的基因?qū)胧荏w細胞三/第四步：目的基因的檢測與鑒定四/DNA片段的擴增及電泳鑒定五/二將目的基因?qū)胧荏w細胞任務二：目的基因?qū)胧荏w細胞活動1：如何將連有gfp基因的表達載體導入到斑馬魚受體細胞呢？二將目的基因?qū)胧荏w細胞任務二：目的基因?qū)胧荏w細胞活動1：如何將連有gfp基因的表達載體導入到斑馬魚受體細胞呢？問題1：選擇哪種細胞作為受體細胞適合？導入卵細胞（受精卵）可以獲得穩(wěn)定遺傳的個體二將目的基因?qū)胧荏w細胞任務二：目的基因?qū)胧荏w細胞活動1：如何將連有gfp基因的表達載體導入到斑馬魚受體細胞呢？問題2：如何將載體導入到受精卵細胞？通過顯微注射的方法操作方法：首先將含有綠色熒光蛋白基因的表達載體提純，并使DNA濃度保持在1-3ug/ml;然后從雌性動物體內(nèi)提取出卵（卵可以在體外受精，也可以在體內(nèi)受精），采用顯微注射儀進行顯微注射。二將目的基因?qū)胧荏w細胞二將目的基因?qū)胧荏w細胞1：目的基因?qū)雱游锛毎?）方法顯微注射法

受體細胞：受精卵（2）操作目的基因表達載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩┦芫岩浦诧@微注射法雌性動物輸卵管和子宮發(fā)育為具有新性狀的動物顯微鏡下用口徑1um的玻璃微管向受精卵注射含500-600個拷貝的含有目的基因的載體二將目的基因?qū)胧荏w細胞任務二：目的基因?qū)胧荏w細胞活動2：如何將連有gfp基因的表達載體導入到植物受體細胞呢？任務二：目的基因?qū)胧荏w細胞活動2：如何將連有gfp基因的表達載體導入到植物受體細胞呢？二將目的基因?qū)胧荏w細胞二將目的基因?qū)胧荏w細胞任務二：目的基因?qū)胧荏w細胞活動2：如何將連有gfp基因的表達載體導入到植物受體細胞呢？二將目的基因?qū)胧荏w細胞任務二：目的基因?qū)胧荏w細胞活動2：如何將連有gfp基因的表達載體導入到植物受體細胞呢？問題2：有人認為“農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒中的生長素與細胞分裂素基因表達刺激了楊樹枝條的增生”，同學們，你們認為這個合理嗎？補充：當微生物缺少選擇壓力時，可能會發(fā)生質(zhì)粒的丟失，導致質(zhì)?；蚩刂频男誀畈荒芊€(wěn)定遺傳植物產(chǎn)生冠癭瘤，說明兩個激素基因可以穩(wěn)定遺傳表達二將目的基因?qū)胧荏w細胞任務二：目的基因?qū)胧荏w細胞活動2：如何將連有gfp基因的表達載體導入到植物受體細胞呢？問題3：結(jié)合下圖，嘗試說出Ti質(zhì)粒中的T-DNA序列是如何轉(zhuǎn)移到楊樹細胞中的，以及如何整合至其基因組的？二將目的基因?qū)胧荏w細胞任務二：目的基因?qū)胧荏w細胞活動2：如何將連有gfp基因的表達載體導入到植物受體細胞呢？問題3：結(jié)合下圖，嘗試說出Ti質(zhì)粒中的T-DNA序列是如何轉(zhuǎn)移到楊樹細胞中的，以及如何整合至其基因組的？當植物體受損時，傷口處的細胞會分泌大量的酚類化合物（乙醚丁香酮），吸引農(nóng)桿菌移向這些細胞。這時農(nóng)桿菌中的Ti-DNA(可轉(zhuǎn)移的DNA）可以轉(zhuǎn)移到受體細胞，并且整合到受體細胞染色體的DNA上，即植物細胞的基因組上。二將目的基因?qū)胧荏w細胞任務二：目的基因?qū)胧荏w細胞活動2：如何將連有gfp基因的表達載體導入到植物受體細胞呢？將目的基因連接在Ti質(zhì)粒上，農(nóng)桿菌侵染植物后，Ti質(zhì)粒中的T-DNA區(qū)段脫離質(zhì)粒攜帶目的基因的T-DNA進入受體植物細胞并整合到染色體上。問題4：請說出科學家選擇農(nóng)桿菌作為植物轉(zhuǎn)基因過程中運載體的理由？二將目的基因?qū)胧荏w細胞任務二：目的基因?qū)胧荏w細胞活動2：如何將連有gfp基因的表達載體導入到植物受體細胞呢？問題5：什么是冠癭堿？Ti質(zhì)粒上有冠癭的合成基因，為什么冠癭堿合成基因與冠癭堿代謝基因位于Ti質(zhì)粒上的不同位置？資料3：冠癭堿是一種含氮有機物，可以作為農(nóng)桿菌的碳源和氮源，其他微生物不能利用，因此，冠癭堿是農(nóng)桿菌專屬營養(yǎng)。冠癭堿合成基因位于T-DNA上，這個基因一同轉(zhuǎn)入楊樹基因組中，表達產(chǎn)物將冠癭堿的合成量增加。為農(nóng)桿菌生存提供重組的營養(yǎng)。冠癭堿代謝基因一直位于農(nóng)桿菌細胞中，此基因表達的酶可以幫助農(nóng)桿菌代謝利用冠癭堿。農(nóng)桿菌讓植物細胞幫助合成“營養(yǎng)物質(zhì)”二將目的基因?qū)胧荏w細胞任務二：目的基因?qū)胧荏w細胞活動2：如何將連有gfp基因的表達載體導入到植物受體細胞呢？問題6：農(nóng)桿菌為什么要刺激楊樹枝條增生而長出冠癭瘤，對農(nóng)桿菌有何種價值呢？當3個結(jié)構基因隨T-DNA轉(zhuǎn)移并整合至受體細胞染色體后，生長素基因和細胞分裂素基因的表達產(chǎn)物引起質(zhì)粒轉(zhuǎn)化區(qū)植物細胞不斷分裂與生長，加上冠癭堿合成基因不斷合成冠癭堿并積累，導致植物細胞感染處冠癭瘤的形成。楊樹被農(nóng)桿菌寄生后增生出冠癭瘤，對農(nóng)桿菌而言，植物增生為農(nóng)桿菌提供了更適宜的生存空間；同時合成冠癭堿，還幫農(nóng)桿菌提供營養(yǎng)。二將目的基因?qū)胧荏w細胞任務二：目的基因?qū)胧荏w細胞活動2：如何將連有gfp基因的表達載體導入到植物受體細胞呢？小節(jié)：農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化法是目前植物轉(zhuǎn)基因技術中常用的方法。農(nóng)桿菌是一種土壤細菌，它侵染植物細胞后，會使植物細胞形成腫瘤。受感染的細胞可產(chǎn)生正常細胞所不能產(chǎn)生的生物堿，被農(nóng)桿菌用作碳源和氮源。人們發(fā)現(xiàn)在農(nóng)桿菌中存在一種環(huán)形的Ti質(zhì)粒，該質(zhì)粒上的一段DNA能狗從一個細胞轉(zhuǎn)移到另外一個細胞，這段DNA被稱為轉(zhuǎn)移DNA。T-DNA上包含有高等植物的生長素編碼基因和細胞分裂素編碼基因，可以插入植物基因組，引起植物細胞的變化。將目的基因連接在T-DNA上，可將目的基因一同轉(zhuǎn)移到植物的基因組上二將目的基因?qū)胧荏w細胞2：目的基因?qū)胫参锛毎?）土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（最常用的方法）①轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌是一種在土壤中生活的原核生物，自然條件下感染雙子葉植物和裸子植物，而對于大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力。①工具

農(nóng)桿菌目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)穩(wěn)定存在和表達的過程農(nóng)桿菌侵染植物細胞后，會使植物細胞形成腫瘤當植物體受到損傷后，傷口處的細胞會分泌大量酚類化合物，吸引農(nóng)桿菌向這些細胞移動，受感染的植物細胞產(chǎn)生正常細胞所不能產(chǎn)生的生物堿，被農(nóng)桿菌用作碳源和氮源。二將目的基因?qū)胧荏w細胞2：目的基因?qū)胫参锛毎?）土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（最常用的方法）③原理Ⅰ.當植物體受到損傷后，傷口處的細胞會分泌大量酚類化合物，吸引農(nóng)桿菌向這些細胞移動，農(nóng)桿菌能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA（可轉(zhuǎn)移DNA）轉(zhuǎn)移到被侵染的細胞，并將其整合到受體細胞染色體的DNA上。Ⅱ.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法就是將目的基因插到農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA特定區(qū)段上通過T-DNA將其插入植物細胞染色體的DNA上，使目的基因得到穩(wěn)定的遺傳和表達二將目的基因?qū)胧荏w細胞2：目的基因?qū)胫参锛毎?）土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（最常用的方法）①原理二將目的基因?qū)胧荏w細胞2：目的基因?qū)胫参锛毎?）土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（最常用的方法）②

過程

兩次拼接第一次拼接：目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上；第二拼接（非人工操作）：被插入目的基因的T-DNA拼接到受體細胞染色體的DNA上。二將目的基因?qū)胧荏w細胞2：目的基因?qū)胫参锛毎?）土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（最常用的方法）④

過程

兩次導入第一次導入：目的基因的重組Ti質(zhì)粒導入農(nóng)桿菌；第二導入（非人工操作）：將含有目的基因的T-DNA導入受體細胞。二將目的基因?qū)胧荏w細胞2：目的基因?qū)胫参锛毎?）土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（最常用的方法）⑤處理方法Ⅰ.將新鮮的從葉片上取下的圓形小片與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，然后篩選轉(zhuǎn)化細胞，并通過植物組織培養(yǎng)技術培育出完整的轉(zhuǎn)基因植物受體細胞：體細胞

二將目的基因?qū)胧荏w細胞2：目的基因?qū)胫参锛毎?）土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（最常用的方法）⑤處理方法Ⅱ.將花序直接浸沒在含有農(nóng)桿菌的溶液中一段時間，然后培養(yǎng)植株并獲得種子，在進行篩選、鑒定等。受體細胞：受精卵

二將目的基因?qū)胧荏w細胞2：目的基因?qū)胫参锛毎?）土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（最常用的方法）⑥優(yōu)點T-DNA轉(zhuǎn)化頻率很高

，Ti質(zhì)粒上可插入幾百至幾千個堿基大小的DNA片段，成本低、操作相對簡單，轉(zhuǎn)基因后代的遺傳組成比較容易分析。二將目的基因?qū)胧荏w細胞2：目的基因?qū)胫参锛毎?）花粉管通道法（我國科學家獨創(chuàng)的一種方法）①處理方法Ⅰ.子房注入法：用微量注射器將含有目的基因的DNA溶液直接注入子房中二將目的基因?qū)胧荏w細胞2：目的基因?qū)胫参锛毎?）花粉管通道法（我國科學家獨創(chuàng)的一種方法）①處理方法Ⅱ.柱頭滴加法：在植物受粉后的一定時間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進入胚囊。二將目的基因?qū)胧荏w細胞2：目的基因?qū)胫参锛毎?）花粉管通道法（我國科學家獨創(chuàng)的一種方法）②優(yōu)點Ⅰ.利用植物授粉后形成的天然花粉管通道，將外源基因攜帶進入胚囊，此時的受精卵未形成細胞壁，且正在進行活躍的DNA復制，容易將外源DNA片段整合到受體基因組中。受體細胞：受精卵Ⅱ.操作簡單、技術成本低，免去了組織培養(yǎng)以及誘導再生植株的全套人工培養(yǎng)過程二將目的基因?qū)胧荏w細胞任務二：目的基因?qū)胧荏w細胞活動3：如何將連有gfp基因的表達載體導入到大腸桿菌受體細胞呢？二將目的基因?qū)胧荏w細胞任務二：目的基因?qū)胧荏w細胞活動3：如何將連有gfp基因的表達載體導入到大腸桿菌受體細胞呢？資料3：大腸桿菌在0℃的CaCl2低滲溶液中會發(fā)生膨脹，菌體細胞質(zhì)膜的磷脂層會形成特殊結(jié)構。當外源DNA接觸菌體細胞質(zhì)膜外側(cè)時，Ca會與DNA分子結(jié)合形成復合物，吸附在質(zhì)膜的外表面上，42℃的熱激處理會使細菌細胞質(zhì)膜的特殊結(jié)構出現(xiàn)許多通透性增強的膜間隙，外源DNA分子便通過膜間隙進入菌體細胞。問題3：歸納導入大腸桿菌中的步驟二將目的基因?qū)胧荏w細胞任務二：目的基因?qū)胧荏w細胞活動3：如何將連有gfp基因的表達載體導入到大腸桿菌受體細胞呢？問題3：歸納導入大腸桿菌中的步驟步驟1：用Ca2+處理大腸桿菌細胞，使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，這種細胞被稱為感受態(tài)細胞。步驟2：是將重組表達載體DNA分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細胞混合，在一定

溫度下促進感受態(tài)細胞吸收DNA分子，完成轉(zhuǎn)化過程。二將目的基因?qū)胧荏w細胞3：目的基因?qū)朐思毎?）受體細胞原核細胞