解碼生命密碼：tRNA接受莖核苷酸甲基化酶功能探秘

解碼生命密碼：tRNA接受莖核苷酸甲基化酶功能探秘一、引言1.1研究背景在生命的基本進(jìn)程中，蛋白質(zhì)合成扮演著極為關(guān)鍵的角色，它是細(xì)胞生長、發(fā)育、維持正常生理功能的基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸（transferRNA，tRNA）作為蛋白質(zhì)合成過程中的核心參與者，起著不可或缺的作用。tRNA通過自身的反密碼子精準(zhǔn)識(shí)別信使核糖核酸（messengerRNA，mRNA）上的密碼子，并將對(duì)應(yīng)的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)至核糖體，參與多肽鏈的合成，其結(jié)構(gòu)與功能的完整性對(duì)蛋白質(zhì)合成的準(zhǔn)確性和效率有著決定性影響。tRNA在細(xì)胞內(nèi)并非以原始的轉(zhuǎn)錄形式存在，而是經(jīng)歷了復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄后修飾過程。目前，科研人員已鑒定出超過100種不同類型的tRNA修飾，這些修飾廣泛分布于tRNA分子的各個(gè)區(qū)域，包括反密碼子環(huán)、D環(huán)、TψC環(huán)以及接受莖等部位。甲基化修飾是其中最為常見且研究較為深入的一種修飾方式，在tRNA的諸多生物學(xué)功能中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。不同位置的甲基化修飾對(duì)tRNA的結(jié)構(gòu)和功能有著特異性的影響，例如，某些甲基化修飾能夠增強(qiáng)tRNA的穩(wěn)定性，使其在細(xì)胞內(nèi)的半衰期延長，從而保障蛋白質(zhì)合成過程的持續(xù)進(jìn)行；還有些修飾則參與調(diào)控tRNA與核糖體、氨基酸以及其他蛋白質(zhì)因子的相互作用，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)合成的起始、延伸和終止等關(guān)鍵步驟。tRNA的接受莖是其3'末端的重要結(jié)構(gòu)，富含保守序列CCA，氨基酸通過與CCA末端的腺苷酸結(jié)合而被負(fù)載到tRNA上，因此接受莖對(duì)于tRNA行使轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的功能至關(guān)重要。近年來，越來越多的研究聚焦于tRNA接受莖上的核苷酸甲基化修飾，發(fā)現(xiàn)這種修飾在tRNA的功能調(diào)控中發(fā)揮著獨(dú)特作用。例如，某些物種的tRNA接受莖特定位置的甲基化修飾能夠影響tRNA與氨酰-tRNA合成酶的識(shí)別和結(jié)合，從而調(diào)節(jié)氨基酸的加載效率，對(duì)蛋白質(zhì)合成的準(zhǔn)確性和效率產(chǎn)生影響。此外，接受莖的甲基化修飾還可能參與tRNA的折疊和高級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，穩(wěn)定tRNA的三維構(gòu)象，進(jìn)而影響其在蛋白質(zhì)合成過程中的功能發(fā)揮。催化tRNA接受莖上核苷酸甲基化的酶是這一修飾過程的關(guān)鍵執(zhí)行者，它們能夠特異性地識(shí)別tRNA底物，并將甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到目標(biāo)核苷酸上。這些酶的功能異?；虮磉_(dá)失調(diào)可能導(dǎo)致tRNA甲基化修飾水平的改變，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)合成以及細(xì)胞的正常生理功能。在一些疾病狀態(tài)下，如神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤等，已觀察到tRNA甲基化修飾相關(guān)酶的表達(dá)變化以及tRNA甲基化水平的異常，這提示tRNA接受莖甲基化修飾及其相關(guān)酶在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中可能扮演著重要角色。然而，目前對(duì)于這些酶的作用機(jī)制、底物特異性以及它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)等方面的認(rèn)識(shí)還相對(duì)有限，深入研究催化tRNA接受莖上核苷酸甲基化的酶的功能，不僅有助于揭示tRNA修飾的分子機(jī)制，還能為理解蛋白質(zhì)合成的精細(xì)調(diào)控以及相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制提供新的視角，具有重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的和意義本研究旨在深入探究催化tRNA接受莖上核苷酸甲基化的酶的功能，全面解析其作用機(jī)制、底物特異性以及在細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。具體而言，通過生物化學(xué)、分子生物學(xué)以及結(jié)構(gòu)生物學(xué)等多學(xué)科交叉的研究手段，精確鑒定參與tRNA接受莖甲基化修飾的酶，并對(duì)其催化活性、動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行詳細(xì)表征；利用X射線晶體學(xué)、核磁共振等技術(shù)解析酶與底物tRNA復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)，從原子層面揭示酶識(shí)別底物、催化甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的分子機(jī)制；借助基因編輯技術(shù)、高通量測(cè)序以及蛋白質(zhì)組學(xué)等方法，研究該酶在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)調(diào)控模式，以及其對(duì)tRNA甲基化水平、蛋白質(zhì)合成乃至細(xì)胞生理功能的影響。對(duì)催化tRNA接受莖上核苷酸甲基化的酶功能的研究，具有多層面的重要意義。從基礎(chǔ)理論研究角度來看，tRNA修飾是生命科學(xué)領(lǐng)域的前沿?zé)狳c(diǎn)，深入了解相關(guān)修飾酶的功能，能夠極大地豐富我們對(duì)tRNA轉(zhuǎn)錄后修飾這一復(fù)雜生物學(xué)過程的認(rèn)知，填補(bǔ)該領(lǐng)域在酶學(xué)機(jī)制研究方面的空白，有助于進(jìn)一步揭示生命過程中遺傳信息傳遞與表達(dá)調(diào)控的奧秘。從醫(yī)學(xué)研究與臨床應(yīng)用的角度出發(fā)，tRNA修飾異常與多種人類疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。催化tRNA接受莖甲基化的酶功能失調(diào)，可能導(dǎo)致tRNA甲基化水平的改變，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)合成的準(zhǔn)確性和效率，引發(fā)細(xì)胞功能紊亂，最終與神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤等重大疾病的發(fā)病機(jī)制相關(guān)聯(lián)。因此，深入研究這些酶的功能，有望為相關(guān)疾病的早期診斷、治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)以及個(gè)性化治療策略的制定提供新的思路和理論依據(jù)。例如，通過檢測(cè)酶的活性或tRNA甲基化水平，可能開發(fā)出新型的疾病診斷標(biāo)志物；以酶為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性的抑制劑或激活劑，為疾病的治療提供潛在的干預(yù)手段。在生物技術(shù)和制藥領(lǐng)域，對(duì)tRNA修飾酶功能的深入理解也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。利用這些酶的特性，可以開發(fā)新型的核酸修飾技術(shù)，用于合成具有特定功能的tRNA分子，應(yīng)用于蛋白質(zhì)體外合成、基因治療等領(lǐng)域。此外，針對(duì)這些酶開發(fā)的小分子藥物，可能為治療相關(guān)疾病提供新的藥物研發(fā)方向，推動(dòng)創(chuàng)新藥物的開發(fā)進(jìn)程。1.3研究現(xiàn)狀對(duì)tRNA接受莖核苷酸甲基化修飾的研究可追溯到上世紀(jì)中葉，隨著放射性同位素標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用，科研人員首次在tRNA中檢測(cè)到了甲基化修飾的存在，但當(dāng)時(shí)由于技術(shù)手段的限制，對(duì)修飾位點(diǎn)及修飾酶的研究進(jìn)展緩慢。直到上世紀(jì)八十年代，核酸測(cè)序技術(shù)的發(fā)展使得tRNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)得以解析，為深入研究tRNA修飾提供了基礎(chǔ)。通過對(duì)不同物種tRNA序列的分析，發(fā)現(xiàn)接受莖區(qū)域存在保守的甲基化修飾位點(diǎn)，如在大腸桿菌tRNA中，接受莖上的某些核苷酸甲基化修飾被證實(shí)與tRNA的穩(wěn)定性和功能相關(guān)。進(jìn)入二十一世紀(jì)，質(zhì)譜技術(shù)的革新以及高通量測(cè)序技術(shù)的興起，極大地推動(dòng)了tRNA修飾研究領(lǐng)域的發(fā)展。利用高分辨率質(zhì)譜，科研人員能夠精確鑒定tRNA上各種甲基化修飾的類型和位點(diǎn)，高通量測(cè)序技術(shù)則使得大規(guī)模分析不同細(xì)胞狀態(tài)下tRNA修飾圖譜成為可能。這些技術(shù)的應(yīng)用，使得在多種生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了更多位于tRNA接受莖上的甲基化修飾，并且揭示了其修飾水平在不同生理和病理?xiàng)l件下的動(dòng)態(tài)變化。例如，在腫瘤細(xì)胞中，tRNA接受莖的甲基化修飾模式與正常細(xì)胞相比存在顯著差異，提示其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的潛在作用。在修飾酶的研究方面，目前已經(jīng)鑒定出了一些參與tRNA接受莖核苷酸甲基化修飾的酶。以甲基轉(zhuǎn)移酶家族為例，其中部分成員被證實(shí)能夠特異性地催化tRNA接受莖上特定核苷酸的甲基化。在酵母中，Trm10是一種負(fù)責(zé)tRNA接受莖上第47位核苷酸甲基化修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶，研究表明，Trm10基因的缺失會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)tRNA甲基化修飾水平的降低，進(jìn)而影響酵母細(xì)胞的生長和蛋白質(zhì)合成效率。在人類細(xì)胞中，也發(fā)現(xiàn)了類似功能的甲基轉(zhuǎn)移酶，如TRMT112復(fù)合物參與了tRNA接受莖上某些甲基化修飾的催化過程，其功能異常與多種疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。盡管在tRNA接受莖核苷酸甲基化修飾及其相關(guān)修飾酶的研究上取得了一定進(jìn)展，但目前仍存在諸多問題亟待解決。在修飾酶的作用機(jī)制方面，雖然已經(jīng)明確了部分酶的催化活性和底物特異性，但對(duì)于酶如何精確識(shí)別tRNA底物，以及催化甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的分子機(jī)制仍不完全清楚。在結(jié)構(gòu)生物學(xué)層面，大部分修飾酶與tRNA底物復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)尚未解析，限制了我們從原子水平深入理解修飾過程。在細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究中，對(duì)于修飾酶的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，以及它們與其他細(xì)胞內(nèi)因子之間的相互作用關(guān)系了解甚少，這阻礙了我們?nèi)嬲J(rèn)識(shí)tRNA接受莖甲基化修飾在細(xì)胞生理功能中的調(diào)控作用。此外，目前對(duì)于不同物種間修飾酶的進(jìn)化關(guān)系和功能保守性研究也相對(duì)匱乏，難以從更宏觀的角度揭示tRNA修飾的生物學(xué)意義。二、tRNA接受莖及核苷酸甲基化概述2.1tRNA結(jié)構(gòu)與功能2.1.1tRNA的基本結(jié)構(gòu)tRNA作為一類小分子RNA，在細(xì)胞中承擔(dān)著至關(guān)重要的生物學(xué)功能，其結(jié)構(gòu)獨(dú)特且高度保守。從二級(jí)結(jié)構(gòu)來看，tRNA呈現(xiàn)出經(jīng)典的三葉草形狀，這一結(jié)構(gòu)由四個(gè)主要的臂和三個(gè)環(huán)組成。接受莖位于tRNA的3'端，由7對(duì)堿基組成，其末端具有保守的CCA序列，這一序列是氨基酸的結(jié)合位點(diǎn)，在蛋白質(zhì)合成過程中，特定的氨基酸通過與CCA末端的腺苷酸共價(jià)結(jié)合，從而被負(fù)載到tRNA上，因此接受莖對(duì)于tRNA行使轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的功能起著核心作用。二氫尿嘧啶環(huán)（D環(huán)）和TψC環(huán)分別位于三葉草結(jié)構(gòu)的不同位置，D環(huán)含有二氫尿嘧啶等稀有堿基，這些稀有堿基賦予了D環(huán)獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和功能特性，參與tRNA與氨酰-tRNA合成酶的識(shí)別和結(jié)合過程，對(duì)tRNA的氨基酸加載特異性有著重要影響。TψC環(huán)則含有胸腺嘧啶（T）、假尿嘧啶（ψ）和胞嘧啶（C）等特殊堿基，它參與tRNA與核糖體的相互作用，在蛋白質(zhì)合成的起始、延伸和終止等階段發(fā)揮著不可或缺的作用。反密碼子環(huán)位于三葉草結(jié)構(gòu)的中間位置，環(huán)上的反密碼子由三個(gè)堿基組成，這三個(gè)堿基能夠與mRNA上的密碼子通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行精確識(shí)別，從而確保tRNA攜帶的氨基酸能夠按照mRNA的指令準(zhǔn)確地?fù)饺氲蕉嚯逆溨小ｎ~外環(huán)又稱可變環(huán)，其堿基數(shù)量和種類在不同的tRNA中存在差異，這種差異可能與tRNA的特異性功能或物種特異性有關(guān)，雖然目前對(duì)額外環(huán)的具體功能尚未完全明確，但研究表明它可能參與tRNA的折疊、穩(wěn)定性維持以及與其他蛋白質(zhì)因子的相互作用。在三級(jí)結(jié)構(gòu)層面，tRNA呈現(xiàn)出倒L形構(gòu)象，這種構(gòu)象是在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上通過氨基酸接受莖與TψC莖以及D莖與反密碼莖間的折疊形成的右手反平行雙螺旋結(jié)構(gòu)。在倒L形結(jié)構(gòu)中，氨基酸接受莖和反密碼子分別位于倒L的兩端，二者相距約70?，這種空間布局使得tRNA在蛋白質(zhì)合成過程中能夠同時(shí)與mRNA和核糖體進(jìn)行有效的相互作用。D環(huán)和TψC環(huán)形成了倒L的角，它們之間通過一些保守堿基之間的相互作用以及堿基堆積力來維持整個(gè)分子的穩(wěn)定構(gòu)象。tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)中存在大量的非標(biāo)準(zhǔn)堿基對(duì)相互作用，這些相互作用對(duì)于穩(wěn)定tRNA的三維結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)tRNA的功能具有重要意義。例如，一些堿基對(duì)之間形成的氫鍵不僅能夠固定tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件，還能影響tRNA與其他分子的結(jié)合親和力。2.1.2tRNA在蛋白質(zhì)合成中的作用tRNA在蛋白質(zhì)合成過程中扮演著核心角色，是遺傳信息從mRNA傳遞到蛋白質(zhì)的關(guān)鍵橋梁。在翻譯起始階段，起始tRNA攜帶甲硫氨酸（在原核生物中為甲酰甲硫氨酸），通過其反密碼子與mRNA上的起始密碼子AUG進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)，從而識(shí)別并結(jié)合到mRNA的起始位點(diǎn)。這一過程需要多種起始因子的參與，它們協(xié)助起始tRNA與核糖體小亞基結(jié)合，形成起始復(fù)合物，為后續(xù)的蛋白質(zhì)合成奠定基礎(chǔ)。起始tRNA的準(zhǔn)確識(shí)別和結(jié)合對(duì)于蛋白質(zhì)合成的起始至關(guān)重要，任何異常都可能導(dǎo)致翻譯起始的錯(cuò)誤或受阻，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的合成效率和質(zhì)量。在翻譯延伸階段，tRNA憑借其反密碼子與mRNA上的密碼子進(jìn)行精確的堿基互補(bǔ)配對(duì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)密碼子的識(shí)別。當(dāng)tRNA的反密碼子與mRNA上的密碼子匹配時(shí)，tRNA攜帶的氨基酸被轉(zhuǎn)運(yùn)到核糖體的A位點(diǎn)。在核糖體的催化作用下，A位點(diǎn)上的氨基酸與正在延伸的多肽鏈的C末端通過肽鍵連接，形成新的肽鏈。隨后，核糖體沿著mRNA移動(dòng)一個(gè)密碼子的距離，使得空載的tRNA從核糖體的E位點(diǎn)離開，而負(fù)載有新合成肽鏈的tRNA則從A位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到P位點(diǎn)，為下一個(gè)tRNA進(jìn)入A位點(diǎn)騰出空間，如此循環(huán)往復(fù)，多肽鏈不斷延伸。在這個(gè)過程中，tRNA的反密碼子與mRNA密碼子的準(zhǔn)確配對(duì)是保證氨基酸正確摻入多肽鏈的關(guān)鍵，任何錯(cuò)配都可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)中氨基酸序列的錯(cuò)誤，從而影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。氨酰-tRNA合成酶在tRNA參與蛋白質(zhì)合成的過程中起著不可或缺的作用，它負(fù)責(zé)將特定的氨基酸與對(duì)應(yīng)的tRNA進(jìn)行連接，形成氨酰-tRNA。每一種氨基酸都有其對(duì)應(yīng)的氨酰-tRNA合成酶，這種酶能夠特異性地識(shí)別氨基酸和與之對(duì)應(yīng)的tRNA，通過催化氨基酸的羧基與tRNA3'端CCA序列的腺苷酸的羥基之間形成酯鍵，將氨基酸負(fù)載到tRNA上。氨酰-tRNA合成酶的特異性識(shí)別機(jī)制保證了tRNA攜帶的氨基酸與mRNA密碼子的對(duì)應(yīng)關(guān)系的準(zhǔn)確性，是蛋白質(zhì)合成準(zhǔn)確性的重要保障。如果氨酰-tRNA合成酶出現(xiàn)功能異常，可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的氨基酸被連接到tRNA上，進(jìn)而使錯(cuò)誤的氨基酸摻入到多肽鏈中，引發(fā)蛋白質(zhì)功能的改變甚至喪失。在翻譯終止階段，當(dāng)核糖體移動(dòng)到mRNA上的終止密碼子（UAA、UAG或UGA）時(shí)，由于沒有與之對(duì)應(yīng)的tRNA，釋放因子會(huì)識(shí)別終止密碼子并結(jié)合到核糖體上。釋放因子的結(jié)合會(huì)觸發(fā)一系列反應(yīng)，導(dǎo)致多肽鏈從核糖體上釋放出來，同時(shí)核糖體解離成大、小亞基，完成一輪蛋白質(zhì)合成過程。雖然終止密碼子沒有對(duì)應(yīng)的tRNA，但細(xì)胞內(nèi)存在多種釋放因子，它們能夠準(zhǔn)確識(shí)別終止密碼子，并與核糖體相互作用，促進(jìn)多肽鏈的釋放和核糖體的解離。釋放因子的功能異常也可能導(dǎo)致翻譯終止的異常，例如多肽鏈不能正常釋放，或者核糖體不能及時(shí)解離，影響蛋白質(zhì)合成的正常進(jìn)行和核糖體的循環(huán)利用。二、tRNA接受莖及核苷酸甲基化概述2.2tRNA接受莖核苷酸甲基化現(xiàn)象2.2.1甲基化位點(diǎn)與修飾類型在tRNA接受莖區(qū)域，已發(fā)現(xiàn)多個(gè)常見的核苷酸甲基化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的甲基化修飾類型豐富多樣，對(duì)tRNA的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生著重要影響。在多種生物的tRNA中，接受莖靠近3'端的核苷酸是甲基化修飾的熱點(diǎn)區(qū)域。以大腸桿菌tRNA為例，其接受莖上的第73位核苷酸常常發(fā)生甲基化修飾，修飾類型主要為N6-甲基腺嘌呤（m6A）修飾。這種修飾在維持tRNA的穩(wěn)定性和促進(jìn)其與氨酰-tRNA合成酶的結(jié)合方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究表明，當(dāng)該位點(diǎn)的m6A修飾缺失時(shí)，tRNA的穩(wěn)定性下降，與氨酰-tRNA合成酶的親和力降低，進(jìn)而影響氨基酸的加載效率，最終對(duì)蛋白質(zhì)合成過程產(chǎn)生不利影響。在真核生物中，tRNA接受莖的甲基化位點(diǎn)和修飾類型同樣具有獨(dú)特性。在酵母tRNA中，接受莖上的第47位核苷酸存在5-甲基胞嘧啶（m5C）修飾。m5C修飾能夠影響tRNA的折疊和構(gòu)象穩(wěn)定性，進(jìn)而調(diào)節(jié)tRNA與其他分子的相互作用。通過對(duì)酵母細(xì)胞中m5C修飾相關(guān)基因的敲除實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，缺失該修飾會(huì)導(dǎo)致tRNA的三維結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，影響其在蛋白質(zhì)合成過程中的正常功能。在人類tRNA中，接受莖的第6位和第7位核苷酸存在N2-甲基鳥苷酸（m2G）修飾，這種修飾由THUMPD3-TRMT112甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物催化完成。研究表明，m2G修飾在tRNA的功能調(diào)控中具有重要作用，它可能參與tRNA與核糖體的相互作用，影響蛋白質(zhì)合成的起始和延伸過程。除了上述常見的甲基化修飾類型外，tRNA接受莖上還存在其他一些較為罕見的修飾。在某些古細(xì)菌的tRNA中，發(fā)現(xiàn)了接受莖核苷酸的2'-O-甲基化修飾，這種修飾對(duì)tRNA的熱穩(wěn)定性具有重要影響，使tRNA能夠在高溫環(huán)境下保持結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性，適應(yīng)古細(xì)菌特殊的生存環(huán)境。此外，還有研究報(bào)道了tRNA接受莖上的N1-甲基腺苷酸（m1A）修飾等，雖然這些修飾的功能尚未完全明確，但它們的存在豐富了tRNA接受莖甲基化修飾的類型，為深入研究tRNA修飾的生物學(xué)意義提供了更多的研究方向。2.2.2甲基化修飾的保守性與分布規(guī)律不同物種tRNA接受莖的甲基化修飾具有一定的保守性，這反映了其在生物進(jìn)化過程中的重要性。從原核生物到真核生物，盡管tRNA的序列和結(jié)構(gòu)存在一定差異，但某些關(guān)鍵位點(diǎn)的甲基化修飾在不同物種間相對(duì)保守。例如，在大腸桿菌、酵母和人類等多種生物中，tRNA接受莖上的一些甲基化位點(diǎn)和修飾類型具有相似性。在接受莖靠近3'端的區(qū)域，部分核苷酸的甲基化修飾在進(jìn)化過程中高度保守，暗示這些修飾對(duì)于tRNA的基本功能具有不可或缺的作用。研究發(fā)現(xiàn)，這些保守的甲基化修飾位點(diǎn)往往參與tRNA與氨酰-tRNA合成酶、核糖體等關(guān)鍵分子的相互作用，對(duì)維持蛋白質(zhì)合成的準(zhǔn)確性和效率至關(guān)重要。tRNA接受莖甲基化修飾在不同tRNA亞型中的分布存在明顯規(guī)律。不同tRNA亞型由于其反密碼子和攜帶的氨基酸不同，在細(xì)胞內(nèi)的功能和表達(dá)水平也有所差異，其接受莖的甲基化修飾模式也相應(yīng)不同。在細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)且參與常見氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)的tRNA亞型，其接受莖的甲基化修飾水平往往較高。以攜帶亮氨酸的tRNA亞型為例，在多種細(xì)胞中，其接受莖的甲基化修飾較為豐富，這可能與亮氨酸在蛋白質(zhì)合成中的高頻使用有關(guān)。通過對(duì)不同組織和細(xì)胞類型中tRNA甲基化圖譜的分析發(fā)現(xiàn)，某些tRNA亞型的接受莖甲基化修飾具有組織特異性。在肝臟細(xì)胞中，參與脂肪酸代謝相關(guān)蛋白質(zhì)合成的tRNA亞型，其接受莖的甲基化修飾水平與其他組織細(xì)胞相比存在顯著差異，這種差異可能與肝臟細(xì)胞獨(dú)特的代謝功能和蛋白質(zhì)合成需求有關(guān)。tRNA接受莖甲基化修飾的保守性和分布規(guī)律還受到環(huán)境因素和細(xì)胞生理狀態(tài)的影響。在應(yīng)激條件下，如高溫、饑餓、氧化應(yīng)激等，細(xì)胞內(nèi)tRNA接受莖的甲基化修飾模式會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化。在高溫脅迫下，一些細(xì)菌會(huì)增加tRNA接受莖特定位點(diǎn)的甲基化修飾，以提高tRNA的熱穩(wěn)定性，確保蛋白質(zhì)合成能夠正常進(jìn)行。在腫瘤細(xì)胞中，由于細(xì)胞的快速增殖和代謝異常，tRNA接受莖的甲基化修飾水平和分布模式也會(huì)發(fā)生改變，這些改變可能與腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。通過對(duì)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞tRNA甲基化圖譜的對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)某些tRNA亞型接受莖的甲基化修飾在腫瘤細(xì)胞中顯著上調(diào)或下調(diào)，進(jìn)一步研究表明這些修飾的改變可能影響腫瘤細(xì)胞中關(guān)鍵蛋白質(zhì)的合成，從而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。三、催化tRNA接受莖核苷酸甲基化的酶3.1酶的種類與發(fā)現(xiàn)歷程在探索tRNA接受莖核苷酸甲基化修飾的過程中，科研人員陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了多種催化該修飾的酶，這些酶的發(fā)現(xiàn)為深入理解tRNA修飾機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。THUMPD3-TRMT112甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物是其中備受關(guān)注的一種。2021年，上?？萍即髮W(xué)劉如娟課題組在知名學(xué)術(shù)期刊NucleicAcidsResearch上發(fā)表的研究論文，首次揭示了人源THUMPdomain-containingprotein3（THUMPD3）在甲基轉(zhuǎn)移酶激活輔助蛋白（TRMT112）的協(xié)助下，廣泛催化tRNA上第6和第7位的N2-甲基鳥苷酸（m2G）修飾。在此之前，雖然已觀察到tRNA接受莖特定位置存在m2G修飾，但對(duì)于催化該修飾的酶卻一直未被鑒定。劉如娟課題組通過一系列實(shí)驗(yàn)，包括蛋白質(zhì)純化、體外甲基化反應(yīng)以及細(xì)胞內(nèi)基因敲除實(shí)驗(yàn)等，證實(shí)了THUMPD3-TRMT112復(fù)合物在tRNAm2G修飾中的關(guān)鍵作用。在體外實(shí)驗(yàn)中，將純化后的THUMPD3-TRMT112復(fù)合物與tRNA底物孵育，利用質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)到tRNA上第6和第7位核苷酸發(fā)生了m2G修飾；在HEK293T細(xì)胞中敲除THUMPD3基因后，tRNAGly(CCC)-1、tRNAGly(CCC)-2和tRNAGly(GCC)的m2G修飾下降到無法檢測(cè)的水平，這一結(jié)果進(jìn)一步表明了該復(fù)合物在tRNAm2G修飾中的必要性。除了THUMPD3-TRMT112復(fù)合物外，Trm10也是一種被廣泛研究的參與tRNA接受莖甲基化修飾的酶。早在20世紀(jì)90年代，科研人員在酵母中就發(fā)現(xiàn)了Trm10基因，當(dāng)時(shí)推測(cè)其可能參與tRNA的修飾過程。隨后的研究通過基因敲除和互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了Trm10負(fù)責(zé)酵母tRNA接受莖上第47位核苷酸的甲基化修飾。研究人員將酵母中的Trm10基因敲除后，發(fā)現(xiàn)相應(yīng)tRNA第47位核苷酸的甲基化修飾缺失，并且酵母細(xì)胞的生長速度明顯減緩，蛋白質(zhì)合成效率降低；而當(dāng)重新導(dǎo)入Trm10基因后，tRNA的甲基化修飾得以恢復(fù)，酵母細(xì)胞的生長和蛋白質(zhì)合成也恢復(fù)正常。這一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Trm10在酵母tRNA接受莖甲基化修飾以及細(xì)胞的正常生理功能中起著不可或缺的作用。在原核生物中，也存在著催化tRNA接受莖甲基化修飾的酶。以大腸桿菌為例，研究發(fā)現(xiàn)一種特定的甲基轉(zhuǎn)移酶能夠催化tRNA接受莖靠近3'端的第73位核苷酸發(fā)生N6-甲基腺嘌呤（m6A）修飾。最初，科研人員通過放射性同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌tRNA在特定條件下會(huì)發(fā)生甲基化修飾；隨后，利用蛋白質(zhì)純化技術(shù)和酶活性檢測(cè)方法，逐步分離和鑒定出了負(fù)責(zé)該修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶。進(jìn)一步的研究表明，這種甲基轉(zhuǎn)移酶對(duì)tRNA底物具有高度的特異性，能夠準(zhǔn)確識(shí)別tRNA接受莖上的目標(biāo)核苷酸，并催化其發(fā)生m6A修飾。當(dāng)該甲基轉(zhuǎn)移酶的活性受到抑制時(shí)，大腸桿菌tRNA的m6A修飾水平降低，進(jìn)而影響其與氨酰-tRNA合成酶的結(jié)合能力，導(dǎo)致氨基酸加載效率下降，最終影響蛋白質(zhì)合成的準(zhǔn)確性和效率。三、催化tRNA接受莖核苷酸甲基化的酶3.2酶的結(jié)構(gòu)特征3.2.1整體結(jié)構(gòu)與功能域組成通過X射線晶體學(xué)和核磁共振等結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)，對(duì)催化tRNA接受莖核苷酸甲基化的酶的整體三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，發(fā)現(xiàn)其呈現(xiàn)出獨(dú)特而復(fù)雜的空間構(gòu)象。以THUMPD3-TRMT112甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物為例，它由THUMPD3和TRMT112兩個(gè)亞基組成。THUMPD3亞基包含多個(gè)功能域，其中N端的THUMP結(jié)構(gòu)域是其核心功能域之一，該結(jié)構(gòu)域具有獨(dú)特的折疊方式，由多個(gè)α-螺旋和β-折疊組成，形成一個(gè)緊密的球狀結(jié)構(gòu)。THUMP結(jié)構(gòu)域在復(fù)合物中起著關(guān)鍵作用，它參與了與底物tRNA的識(shí)別和結(jié)合過程，其特定的氨基酸殘基和結(jié)構(gòu)特征決定了對(duì)tRNA接受莖上特定核苷酸的識(shí)別特異性。研究表明，THUMP結(jié)構(gòu)域中的一些保守氨基酸殘基能夠與tRNA接受莖的磷酸骨架和堿基形成氫鍵和范德華力等相互作用，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)底物的精準(zhǔn)識(shí)別。TRMT112亞基則通過與THUMPD3亞基相互作用，共同構(gòu)成了完整的酶活性中心。TRMT112亞基具有一個(gè)富含α-螺旋的結(jié)構(gòu)域，它與THUMPD3的THUMP結(jié)構(gòu)域相互纏繞，形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用界面。在這個(gè)界面上，存在著多個(gè)關(guān)鍵的氨基酸殘基，它們參與了亞基間的相互作用以及對(duì)酶活性的調(diào)節(jié)。例如，TRMT112亞基上的某些氨基酸殘基能夠與THUMPD3亞基上的特定區(qū)域形成鹽橋或氫鍵，增強(qiáng)復(fù)合物的穩(wěn)定性，同時(shí)也可能影響酶對(duì)底物的親和力和催化活性。Trm10酶在結(jié)構(gòu)上也具有獨(dú)特的特征，它由一個(gè)單一的多肽鏈折疊形成特定的三維結(jié)構(gòu)。Trm10的整體結(jié)構(gòu)包含多個(gè)功能區(qū)域，其中催化結(jié)構(gòu)域位于分子的中心位置，負(fù)責(zé)催化甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。催化結(jié)構(gòu)域由多個(gè)保守的氨基酸序列組成，這些序列形成了一個(gè)具有特定空間構(gòu)象的活性口袋，能夠容納底物tRNA和甲基供體S-腺苷甲硫氨酸（SAM）。在催化結(jié)構(gòu)域的周圍，還存在著一些輔助結(jié)構(gòu)域，它們參與了底物識(shí)別、酶的穩(wěn)定性維持以及與其他蛋白質(zhì)因子的相互作用。例如，Trm10的N端區(qū)域包含一個(gè)底物識(shí)別結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域能夠特異性地識(shí)別tRNA接受莖上的特定序列和結(jié)構(gòu)特征，通過與tRNA的堿基和磷酸骨架相互作用，將tRNA準(zhǔn)確地定位到催化活性中心，為后續(xù)的甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)提供條件。3.2.2關(guān)鍵氨基酸殘基與活性中心在催化tRNA接受莖核苷酸甲基化的酶的活性中心，存在著多個(gè)關(guān)鍵的氨基酸殘基，它們?cè)诖呋磻?yīng)中發(fā)揮著不可或缺的作用。對(duì)于THUMPD3-TRMT112復(fù)合物而言，THUMPD3亞基活性中心的一些氨基酸殘基直接參與了甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。其中，一個(gè)保守的半胱氨酸殘基（Cys）在催化過程中起著關(guān)鍵作用，它能夠與SAM上的甲基基團(tuán)形成共價(jià)中間體，通過親核攻擊將甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到底物tRNA的目標(biāo)核苷酸上。在催化反應(yīng)的過渡態(tài)中，該半胱氨酸殘基與甲基基團(tuán)之間的共價(jià)鍵發(fā)生斷裂，同時(shí)與tRNA上的目標(biāo)核苷酸形成新的共價(jià)鍵，從而完成甲基轉(zhuǎn)移過程。除了半胱氨酸殘基外，THUMPD3活性中心的一些堿性氨基酸殘基，如精氨酸（Arg）和賴氨酸（Lys），也參與了催化反應(yīng)。這些堿性氨基酸殘基能夠與底物tRNA的磷酸基團(tuán)形成靜電相互作用，穩(wěn)定tRNA在活性中心的結(jié)合構(gòu)象，促進(jìn)甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的進(jìn)行。研究表明，當(dāng)這些堿性氨基酸殘基發(fā)生突變時(shí)，酶對(duì)tRNA的親和力顯著降低，催化活性也受到明顯抑制，說明它們?cè)诰S持酶與底物的相互作用以及催化活性方面具有重要作用。在Trm10酶的活性中心，同樣存在著多個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基。其中，一個(gè)保守的天冬氨酸殘基（Asp）在催化反應(yīng)中起著重要的酸堿催化作用。在甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)過程中，天冬氨酸殘基能夠通過提供或接受質(zhì)子，促進(jìn)反應(yīng)中間體的形成和轉(zhuǎn)化，從而加速甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的速率。此外，Trm10活性中心的一些疏水性氨基酸殘基，如苯丙氨酸（Phe）和酪氨酸（Tyr），參與了底物tRNA和SAM的結(jié)合過程。它們通過與底物分子的疏水區(qū)域相互作用，形成疏水相互作用網(wǎng)絡(luò)，將底物分子穩(wěn)定地結(jié)合在活性中心，確保催化反應(yīng)的特異性和高效性。當(dāng)這些疏水性氨基酸殘基發(fā)生突變時(shí)，Trm10對(duì)底物的結(jié)合能力明顯下降，催化活性也隨之降低，表明它們?cè)诘孜镒R(shí)別和結(jié)合過程中起著關(guān)鍵作用。3.3酶的分布與表達(dá)調(diào)控3.3.1在不同組織和細(xì)胞中的分布催化tRNA接受莖核苷酸甲基化的酶在不同組織和細(xì)胞類型中呈現(xiàn)出特異性的分布模式，這一分布差異與組織和細(xì)胞的功能需求密切相關(guān)。以THUMPD3-TRMT112甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物為例，通過免疫組織化學(xué)和蛋白質(zhì)印跡等技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，在人體的肝臟組織中，該復(fù)合物的表達(dá)水平相對(duì)較高。肝臟作為人體重要的代謝器官，承擔(dān)著多種物質(zhì)的合成、分解和轉(zhuǎn)化功能，需要高效且準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)來維持其正常代謝活動(dòng)。THUMPD3-TRMT112復(fù)合物在肝臟組織中的高表達(dá)，可能與肝臟細(xì)胞內(nèi)活躍的蛋白質(zhì)合成過程相關(guān)，其催化的tRNA接受莖甲基化修飾，有助于提高tRNA的穩(wěn)定性和功能活性，進(jìn)而保障肝臟細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成的準(zhǔn)確性和效率。在肝臟細(xì)胞中，參與脂肪酸代謝、糖原合成等關(guān)鍵代謝途徑的蛋白質(zhì)合成過程，可能依賴于THUMPD3-TRMT112復(fù)合物介導(dǎo)的tRNA甲基化修飾，以確保相關(guān)蛋白質(zhì)的正確合成和功能發(fā)揮。在大腦組織中，THUMPD3-TRMT112復(fù)合物的表達(dá)則呈現(xiàn)出區(qū)域特異性。通過對(duì)大腦不同腦區(qū)的分析發(fā)現(xiàn)，在海馬體和前額葉皮質(zhì)等與學(xué)習(xí)、記憶和認(rèn)知功能密切相關(guān)的腦區(qū)，該復(fù)合物的表達(dá)水平顯著高于其他腦區(qū)。海馬體在學(xué)習(xí)和記憶的形成過程中起著關(guān)鍵作用，其神經(jīng)元需要精確調(diào)控蛋白質(zhì)合成來參與突觸可塑性的調(diào)節(jié)。THUMPD3-TRMT112復(fù)合物在海馬體中的高表達(dá)，可能通過影響tRNA的甲基化修飾，進(jìn)而調(diào)節(jié)與學(xué)習(xí)、記憶相關(guān)蛋白質(zhì)的合成，對(duì)神經(jīng)元的功能和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的可塑性產(chǎn)生影響。研究表明，在海馬體神經(jīng)元中，某些與突觸傳遞和可塑性相關(guān)的蛋白質(zhì)合成過程，受到tRNA接受莖甲基化修飾的調(diào)控，而THUMPD3-TRMT112復(fù)合物可能是這一調(diào)控過程的關(guān)鍵參與者。在不同類型的細(xì)胞中，催化tRNA接受莖核苷酸甲基化的酶的分布也存在差異。在腫瘤細(xì)胞中，與正常細(xì)胞相比，一些修飾酶的表達(dá)水平發(fā)生了顯著變化。以Trm10酶為例，在乳腺癌細(xì)胞中，研究發(fā)現(xiàn)Trm10的表達(dá)水平明顯高于正常乳腺上皮細(xì)胞。乳腺癌細(xì)胞具有快速增殖和代謝活躍的特點(diǎn)，其蛋白質(zhì)合成需求旺盛，Trm10酶表達(dá)的上調(diào)可能是為了滿足腫瘤細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)合成的高需求。通過催化tRNA接受莖的甲基化修飾，Trm10酶可能增強(qiáng)tRNA的穩(wěn)定性和功能，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞中與增殖、侵襲等相關(guān)蛋白質(zhì)的合成，從而支持腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。進(jìn)一步的研究表明，抑制乳腺癌細(xì)胞中Trm10酶的表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致tRNA甲基化修飾水平下降，蛋白質(zhì)合成受到抑制，腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力也相應(yīng)減弱。在免疫細(xì)胞中，催化tRNA接受莖核苷酸甲基化的酶的分布和表達(dá)也與免疫細(xì)胞的功能密切相關(guān)。在T淋巴細(xì)胞中，當(dāng)受到抗原刺激后，細(xì)胞內(nèi)參與tRNA接受莖甲基化修飾的酶的表達(dá)會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化。在T淋巴細(xì)胞活化過程中，需要大量合成與免疫應(yīng)答相關(guān)的蛋白質(zhì)，如細(xì)胞因子、抗體等。此時(shí)，催化tRNA接受莖甲基化修飾的酶的表達(dá)上調(diào)，可能通過調(diào)節(jié)tRNA的修飾水平，影響相關(guān)蛋白質(zhì)的合成，從而增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答能力。研究發(fā)現(xiàn)，在T淋巴細(xì)胞活化過程中，某些細(xì)胞因子基因的翻譯效率與tRNA接受莖的甲基化修飾水平相關(guān)，而相關(guān)修飾酶在這一過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。3.3.2表達(dá)調(diào)控機(jī)制催化tRNA接受莖核苷酸甲基化的酶的表達(dá)受到多種層面的調(diào)控，包括轉(zhuǎn)錄、翻譯及翻譯后調(diào)控，這些調(diào)控機(jī)制共同維持著酶在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)和功能。在轉(zhuǎn)錄調(diào)控層面，轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)酶基因的表達(dá)中起著關(guān)鍵作用。以THUMPD3基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控為例，研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子SP1能夠特異性地結(jié)合到THUMPD3基因啟動(dòng)子區(qū)域的GC盒上。SP1與GC盒的結(jié)合增強(qiáng)了RNA聚合酶與啟動(dòng)子的相互作用，促進(jìn)了THUMPD3基因的轉(zhuǎn)錄起始，從而上調(diào)THUMPD3的表達(dá)水平。當(dāng)細(xì)胞處于某些生理狀態(tài)或受到外界刺激時(shí)，SP1的表達(dá)或活性發(fā)生改變，進(jìn)而影響THUMPD3基因的轉(zhuǎn)錄。在細(xì)胞增殖活躍時(shí)，SP1的表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致THUMPD3基因的轉(zhuǎn)錄增加，以滿足細(xì)胞對(duì)tRNA甲基化修飾的需求，支持蛋白質(zhì)合成的高效進(jìn)行。除了SP1，其他轉(zhuǎn)錄因子也參與了THUMPD3基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。轉(zhuǎn)錄因子E2F1在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要作用，它也能夠與THUMPD3基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合。在細(xì)胞周期的S期，E2F1的活性增強(qiáng)，它與THUMPD3啟動(dòng)子的結(jié)合增加，促進(jìn)THUMPD3基因的轉(zhuǎn)錄，使得THUMPD3的表達(dá)水平升高。這一調(diào)控機(jī)制可能與S期細(xì)胞內(nèi)活躍的DNA復(fù)制和蛋白質(zhì)合成過程相關(guān)，通過上調(diào)THUMPD3的表達(dá)，增強(qiáng)tRNA的甲基化修飾，確保蛋白質(zhì)合成的準(zhǔn)確性和效率，以支持細(xì)胞的增殖。在翻譯調(diào)控層面，微小RNA（miRNA）對(duì)催化tRNA接受莖核苷酸甲基化的酶的表達(dá)調(diào)控發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，miR-124能夠靶向THUMPD3的mRNA。miR-124通過與THUMPD3mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）互補(bǔ)配對(duì)，抑制mRNA的翻譯過程，從而降低THUMPD3蛋白的表達(dá)水平。在神經(jīng)細(xì)胞中，miR-124的表達(dá)豐富，它對(duì)THUMPD3的抑制作用可能參與調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)tRNA的甲基化修飾水平。神經(jīng)細(xì)胞具有獨(dú)特的蛋白質(zhì)合成需求和功能特點(diǎn)，miR-124對(duì)THUMPD3的調(diào)控，可能通過影響tRNA的甲基化修飾，調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞中與神經(jīng)遞質(zhì)合成、突觸傳遞等相關(guān)蛋白質(zhì)的合成，進(jìn)而影響神經(jīng)細(xì)胞的功能和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育。除了miR-124，還有其他miRNA參與了對(duì)催化tRNA接受莖核苷酸甲基化的酶的翻譯調(diào)控。miR-34a能夠靶向Trm10的mRNA，抑制其翻譯過程。在腫瘤細(xì)胞中，miR-34a的表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致對(duì)Trm10的抑制作用減弱，Trm10蛋白的表達(dá)水平升高。這一調(diào)控變化可能與腫瘤細(xì)胞的增殖和惡性轉(zhuǎn)化過程相關(guān)，Trm10表達(dá)的增加，通過促進(jìn)tRNA接受莖的甲基化修飾，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成的效率，支持腫瘤細(xì)胞的快速生長和侵襲。在翻譯后調(diào)控層面，蛋白質(zhì)的修飾對(duì)催化tRNA接受莖核苷酸甲基化的酶的活性和穩(wěn)定性產(chǎn)生重要影響。磷酸化修飾是常見的翻譯后修飾方式之一，研究表明，THUMPD3蛋白可以被蛋白激酶CK2磷酸化。在細(xì)胞受到氧化應(yīng)激時(shí)，CK2的活性增強(qiáng)，它催化THUMPD3蛋白的特定絲氨酸殘基磷酸化。磷酸化修飾改變了THUMPD3蛋白的構(gòu)象和活性，使其與底物tRNA的結(jié)合能力增強(qiáng)，從而提高了酶的催化活性。這一調(diào)控機(jī)制可能是細(xì)胞在應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激時(shí)的一種適應(yīng)性反應(yīng)，通過增強(qiáng)THUMPD3的活性，調(diào)節(jié)tRNA的甲基化修飾，維持蛋白質(zhì)合成的正常進(jìn)行，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。除了磷酸化修飾，泛素化修飾也參與了對(duì)催化tRNA接受莖核苷酸甲基化的酶的翻譯后調(diào)控。TRMT112蛋白可以被泛素連接酶識(shí)別并發(fā)生泛素化修飾。泛素化修飾標(biāo)記了TRMT112蛋白，使其被蛋白酶體識(shí)別并降解。在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境變化時(shí)，泛素連接酶的活性改變，影響TRMT112蛋白的泛素化水平，進(jìn)而調(diào)節(jié)其在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性和豐度。當(dāng)細(xì)胞處于營養(yǎng)缺乏狀態(tài)時(shí)，泛素連接酶的活性增強(qiáng)，TRMT112蛋白的泛素化水平升高，導(dǎo)致其降解加快，THUMPD3-TRMT112復(fù)合物的活性下降。這一調(diào)控機(jī)制可能是細(xì)胞在營養(yǎng)缺乏時(shí)的一種自我調(diào)節(jié)方式，通過降低TRMT112的水平，減少tRNA的甲基化修飾，降低蛋白質(zhì)合成的速率，以適應(yīng)營養(yǎng)匱乏的環(huán)境。四、酶的功能研究方法與技術(shù)4.1體外酶活性測(cè)定4.1.1實(shí)驗(yàn)原理與方法體外酶活性測(cè)定是研究催化tRNA接受莖核苷酸甲基化酶功能的重要手段，其中放射性標(biāo)記技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)是常用的方法，各自具有獨(dú)特的原理和實(shí)驗(yàn)流程。放射性標(biāo)記技術(shù)的原理基于甲基供體S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的放射性標(biāo)記。在酶催化tRNA接受莖核苷酸甲基化的反應(yīng)體系中，加入帶有放射性同位素（如3H或14C）標(biāo)記的SAM。當(dāng)酶催化反應(yīng)發(fā)生時(shí)，SAM上的甲基基團(tuán)在酶的作用下轉(zhuǎn)移到底物tRNA的目標(biāo)核苷酸上，同時(shí)釋放出S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）。通過將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離，如利用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）或高效液相色譜（HPLC）等技術(shù)，將標(biāo)記有放射性甲基的tRNA與未反應(yīng)的底物和其他雜質(zhì)分離。然后，使用放射自顯影或液體閃爍計(jì)數(shù)等方法檢測(cè)放射性信號(hào)的強(qiáng)度，放射性信號(hào)的強(qiáng)弱與酶催化反應(yīng)生成的甲基化tRNA的量成正比，從而間接反映酶的催化活性。在實(shí)際實(shí)驗(yàn)操作中，首先需要準(zhǔn)備高純度的酶和底物tRNA，確保反應(yīng)體系的純凈性。將酶、底物tRNA以及適量的反應(yīng)緩沖液混合，緩沖液的組成和pH值需要根據(jù)酶的特性進(jìn)行優(yōu)化，以提供適宜的反應(yīng)環(huán)境。然后加入放射性標(biāo)記的SAM，啟動(dòng)反應(yīng)。反應(yīng)通常在特定溫度下進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間根據(jù)酶的活性和反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行設(shè)定。反應(yīng)結(jié)束后，加入終止液終止反應(yīng)。利用PAGE進(jìn)行產(chǎn)物分離時(shí)，將反應(yīng)混合物加載到凝膠上，在電場(chǎng)的作用下，不同大小和電荷的分子在凝膠中遷移速度不同，從而實(shí)現(xiàn)分離。將凝膠進(jìn)行干燥處理后，放置在X光片上進(jìn)行放射自顯影，經(jīng)過一定時(shí)間的曝光后，X光片上會(huì)出現(xiàn)與放射性標(biāo)記tRNA對(duì)應(yīng)的條帶，條帶的黑度反映了放射性強(qiáng)度，即酶活性的高低。若使用HPLC進(jìn)行分離，則將反應(yīng)產(chǎn)物注入HPLC系統(tǒng)，通過色譜柱的分離作用，不同成分在流動(dòng)相的帶動(dòng)下先后流出，與放射性檢測(cè)器連接，實(shí)時(shí)檢測(cè)放射性信號(hào)，得到反映酶活性的色譜圖。質(zhì)譜技術(shù)則是利用質(zhì)譜儀對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析，以測(cè)定酶的催化活性。其原理是基于物質(zhì)的質(zhì)荷比（m/z）差異。在酶催化反應(yīng)完成后，將反應(yīng)混合物進(jìn)行處理，使tRNA分子離子化。離子化后的tRNA分子在電場(chǎng)和磁場(chǎng)的作用下，按照質(zhì)荷比的不同進(jìn)行分離和檢測(cè)。通過精確測(cè)量tRNA分子在甲基化修飾前后的質(zhì)荷比變化，可以準(zhǔn)確確定甲基化修飾的發(fā)生以及修飾的位點(diǎn)和程度。例如，對(duì)于催化tRNA接受莖上特定核苷酸甲基化的酶，未修飾的tRNA和修飾后的tRNA在質(zhì)譜圖上會(huì)呈現(xiàn)出不同的質(zhì)荷比峰，通過對(duì)比這些峰的位置和強(qiáng)度，可以判斷酶是否具有催化活性以及活性的高低。在基于質(zhì)譜技術(shù)的實(shí)驗(yàn)中，樣品的前處理至關(guān)重要。首先需要對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行純化，去除反應(yīng)體系中的雜質(zhì)和未反應(yīng)的物質(zhì)，以提高質(zhì)譜檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度。常用的純化方法包括柱層析、超濾等。然后，根據(jù)質(zhì)譜儀的類型和檢測(cè)要求，選擇合適的離子化方式，如電噴霧離子化（ESI）或基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）。對(duì)于ESI，將純化后的樣品溶解在適當(dāng)?shù)娜軇┲?，通過電噴霧裝置將樣品溶液轉(zhuǎn)化為帶電的液滴，在電場(chǎng)的作用下，液滴逐漸蒸發(fā)，形成氣態(tài)離子進(jìn)入質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。對(duì)于MALDI，將樣品與基質(zhì)混合，點(diǎn)樣在靶板上，經(jīng)過干燥后，用激光照射靶板，使基質(zhì)和樣品分子吸收能量，發(fā)生解吸和離子化，產(chǎn)生的離子進(jìn)入質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。在質(zhì)譜分析過程中，需要對(duì)質(zhì)譜儀的參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，如離子源電壓、質(zhì)量分析器的掃描范圍等，以獲得高質(zhì)量的質(zhì)譜圖。通過對(duì)質(zhì)譜圖的解析，確定tRNA甲基化修飾的相關(guān)信息，從而評(píng)估酶的催化活性。4.1.2底物特異性驗(yàn)證為了深入探究催化tRNA接受莖核苷酸甲基化的酶的底物特異性，通過巧妙改變底物tRNA的種類和結(jié)構(gòu)，開展了一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)驗(yàn)證。在改變底物tRNA種類的實(shí)驗(yàn)中，精心選擇了多種來源和功能各異的tRNA。以大腸桿菌tRNA和酵母tRNA為例，這兩種tRNA在序列、結(jié)構(gòu)以及功能上存在顯著差異。將它們分別作為底物，與目標(biāo)酶在相同的反應(yīng)條件下進(jìn)行孵育。利用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析，精確檢測(cè)tRNA接受莖上核苷酸的甲基化修飾情況。結(jié)果顯示，當(dāng)以大腸桿菌tRNA為底物時(shí)，酶能夠有效地催化其接受莖上特定核苷酸的甲基化修飾，在質(zhì)譜圖上清晰地檢測(cè)到了對(duì)應(yīng)甲基化修飾產(chǎn)物的質(zhì)荷比峰；然而，當(dāng)以酵母tRNA為底物時(shí)，質(zhì)譜圖中并未出現(xiàn)相應(yīng)的甲基化修飾產(chǎn)物峰，或者峰的強(qiáng)度極其微弱。這一結(jié)果有力地表明，該酶對(duì)大腸桿菌tRNA具有較高的底物特異性，而對(duì)酵母tRNA的催化活性極低或幾乎沒有催化活性。進(jìn)一步探究酶對(duì)不同反密碼子tRNA的底物特異性。人工合成了一系列僅反密碼子不同的tRNA，它們?cè)谄渌麉^(qū)域的序列和結(jié)構(gòu)保持一致。將這些tRNA分別與酶進(jìn)行反應(yīng)，通過質(zhì)譜分析檢測(cè)甲基化修飾情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酶對(duì)某些特定反密碼子的tRNA具有明顯的偏好性。例如，對(duì)于反密碼子為CAA的tRNA，酶的催化活性較高，能夠高效地催化其接受莖上核苷酸的甲基化修飾；而對(duì)于反密碼子為GCC的tRNA，酶的催化活性則相對(duì)較低。這一現(xiàn)象說明，酶在識(shí)別底物tRNA時(shí)，反密碼子是一個(gè)重要的識(shí)別因素，它能夠影響酶與tRNA的結(jié)合親和力以及催化活性。在改變底物tRNA結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)中，采用化學(xué)修飾和定點(diǎn)突變等技術(shù)對(duì)tRNA接受莖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行精確改造。利用化學(xué)修飾試劑對(duì)tRNA接受莖上的某些堿基進(jìn)行修飾，改變其化學(xué)性質(zhì)和空間構(gòu)象。通過定點(diǎn)突變技術(shù)，將tRNA接受莖上的特定核苷酸替換為其他核苷酸，從而改變其堿基序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)。將改造后的tRNA作為底物與酶進(jìn)行反應(yīng)，通過放射性標(biāo)記實(shí)驗(yàn)或質(zhì)譜分析檢測(cè)酶的催化活性。當(dāng)對(duì)tRNA接受莖上的關(guān)鍵堿基進(jìn)行化學(xué)修飾后，酶的催化活性顯著降低甚至完全喪失。在接受莖上的某個(gè)保守堿基被甲基化修飾后，酶與tRNA的結(jié)合能力明顯下降，導(dǎo)致催化反應(yīng)無法正常進(jìn)行。當(dāng)通過定點(diǎn)突變改變tRNA接受莖的二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，酶的底物特異性也發(fā)生了顯著變化。將接受莖上的一段堿基對(duì)進(jìn)行突變，破壞了原本的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，酶對(duì)該底物的催化活性明顯降低，說明tRNA接受莖的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)酶的底物特異性具有重要影響。通過定點(diǎn)突變改變tRNA接受莖與其他區(qū)域的相互作用，也能影響酶的底物特異性。將tRNA接受莖與D環(huán)之間的相互作用位點(diǎn)進(jìn)行突變，改變了tRNA的整體構(gòu)象，酶對(duì)該底物的識(shí)別和催化能力發(fā)生了改變。這表明tRNA的整體構(gòu)象以及不同區(qū)域之間的相互作用，在酶識(shí)別底物和催化反應(yīng)過程中起著關(guān)鍵作用。通過改變底物tRNA的種類和結(jié)構(gòu)，系統(tǒng)地驗(yàn)證了酶對(duì)底物的特異性，為深入理解酶的作用機(jī)制提供了重要依據(jù)。四、酶的功能研究方法與技術(shù)4.2體內(nèi)功能驗(yàn)證4.2.1基因敲除與過表達(dá)技術(shù)在探究催化tRNA接受莖核苷酸甲基化的酶的體內(nèi)功能時(shí)，基因敲除與過表達(dá)技術(shù)發(fā)揮著關(guān)鍵作用。以CRISPR/Cas9技術(shù)為代表的基因編輯手段，能夠精準(zhǔn)地對(duì)細(xì)胞或生物體中的相關(guān)酶基因進(jìn)行操作。在小鼠模型的構(gòu)建中，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，將編碼Trm10酶的基因進(jìn)行敲除。首先，設(shè)計(jì)針對(duì)Trm10基因特定外顯子區(qū)域的sgRNA，使其能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合到目標(biāo)基因序列上。然后，將sgRNA與Cas9核酸酶表達(dá)載體共同導(dǎo)入小鼠胚胎干細(xì)胞中。Cas9核酸酶在sgRNA的引導(dǎo)下，對(duì)Trm10基因的靶位點(diǎn)進(jìn)行切割，造成DNA雙鏈斷裂。細(xì)胞內(nèi)的非同源末端連接修復(fù)機(jī)制在修復(fù)斷裂DNA時(shí)，會(huì)引入隨機(jī)的堿基插入或缺失，從而導(dǎo)致基因移碼突變，使Trm10基因失去功能。通過篩選和鑒定，獲得Trm10基因敲除的胚胎干細(xì)胞，并將其注射到囊胚中，再移植到代孕母鼠體內(nèi)，最終獲得Trm10基因敲除小鼠。通過基因敲除實(shí)驗(yàn)，深入研究了Trm10酶缺失對(duì)小鼠生理功能的影響。與野生型小鼠相比，Trm10基因敲除小鼠生長發(fā)育遲緩，體重明顯低于正常小鼠。對(duì)小鼠肝臟組織的蛋白質(zhì)合成情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)敲除小鼠肝臟中蛋白質(zhì)合成效率顯著降低。利用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測(cè)肝臟中關(guān)鍵蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)多種參與代謝和細(xì)胞功能維持的蛋白質(zhì)表達(dá)量下降。對(duì)小鼠肝臟組織進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)Trm10基因敲除后，肝臟中多個(gè)代謝通路相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生顯著變化。在糖代謝通路中，參與糖酵解和糖原合成的關(guān)鍵酶的表達(dá)量降低，導(dǎo)致糖代謝紊亂，血糖水平異常。在脂質(zhì)代謝通路中，脂肪酸合成和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)改變，影響了肝臟中脂質(zhì)的合成和代謝，導(dǎo)致肝臟脂肪堆積。在細(xì)胞水平上，利用慢病毒載體系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)THUMPD3-TRMT112復(fù)合物相關(guān)基因的過表達(dá)。將編碼THUMPD3和TRMT112的基因分別克隆到慢病毒表達(dá)載體中，構(gòu)建重組慢病毒。將重組慢病毒感染HEK293T細(xì)胞，病毒基因組整合到細(xì)胞基因組中，實(shí)現(xiàn)THUMPD3和TRMT112基因的穩(wěn)定過表達(dá)。通過蛋白質(zhì)印跡和免疫熒光等技術(shù)，驗(yàn)證了基因過表達(dá)的效果。在過表達(dá)THUMPD3-TRMT112復(fù)合物的HEK293T細(xì)胞中，檢測(cè)到tRNA接受莖上m2G修飾水平顯著升高。利用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)細(xì)胞內(nèi)tRNA修飾圖譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)多種tRNA亞型接受莖的m2G修飾豐度增加。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)THUMPD3-TRMT112復(fù)合物能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖。通過CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)組細(xì)胞的吸光度值顯著高于對(duì)照組，表明細(xì)胞增殖速度加快。利用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)組細(xì)胞處于S期和G2/M期的比例增加，說明細(xì)胞周期進(jìn)程加快，促進(jìn)了細(xì)胞的增殖。4.2.2表型分析與檢測(cè)指標(biāo)為了全面深入地探究催化tRNA接受莖核苷酸甲基化的酶對(duì)細(xì)胞生理功能的影響，精心確定了一系列用于檢測(cè)細(xì)胞生長、分化、代謝等表型變化的具體指標(biāo)。在細(xì)胞生長方面，CCK-8法被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖活性的檢測(cè)。以過表達(dá)THUMPD3-TRMT112復(fù)合物的細(xì)胞為例，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，按照一定的時(shí)間間隔，向培養(yǎng)孔中加入CCK-8試劑。CCK-8試劑中的四唑鹽能夠被活細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙色甲瓚產(chǎn)物。在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm處的吸光度值，吸光度值與活細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)。通過連續(xù)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)的吸光度值，繪制細(xì)胞生長曲線。與對(duì)照組相比，過表達(dá)THUMPD3-TRMT112復(fù)合物的細(xì)胞生長曲線斜率更大，表明細(xì)胞增殖速度明顯加快?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)則從另一個(gè)角度評(píng)估細(xì)胞的增殖能力。將細(xì)胞以低密度接種于培養(yǎng)皿中，經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)，單個(gè)細(xì)胞可增殖形成肉眼可見的細(xì)胞集落。對(duì)集落進(jìn)行固定、染色后，計(jì)數(shù)集落數(shù)量。過表達(dá)THUMPD3-TRMT112復(fù)合物的細(xì)胞形成的集落數(shù)量顯著多于對(duì)照組，進(jìn)一步證實(shí)了該復(fù)合物對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。在細(xì)胞分化研究中，針對(duì)不同類型的細(xì)胞，選擇了特異性的分化標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)。以神經(jīng)干細(xì)胞為例，β-微管蛋白III（Tuj1）是神經(jīng)元分化的特異性標(biāo)志物。通過免疫熒光染色技術(shù)，使用抗Tuj1抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，在熒光顯微鏡下觀察，若細(xì)胞中Tuj1表達(dá)陽性，且細(xì)胞呈現(xiàn)出神經(jīng)元的形態(tài)特征，如長出軸突和樹突等，說明神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化。通過圖像分析軟件對(duì)Tuj1陽性細(xì)胞的數(shù)量和比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，與對(duì)照組相比，在Trm10基因敲除的神經(jīng)干細(xì)胞中，Tuj1陽性細(xì)胞的比例明顯降低，表明Trm10酶的缺失抑制了神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元的分化。在細(xì)胞代謝方面，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ATP含量是評(píng)估細(xì)胞能量代謝的重要指標(biāo)。利用ATP檢測(cè)試劑盒，基于熒光素-熒光素酶發(fā)光原理，將細(xì)胞裂解后，加入含有熒光素和熒光素酶的反應(yīng)體系中。ATP在熒光素酶的催化下，與熒光素發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生熒光信號(hào)。通過酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，即可定量測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ATP含量。在敲除THUMPD3-TRMT112復(fù)合物相關(guān)基因的細(xì)胞中，ATP含量顯著下降，說明細(xì)胞能量代謝受到抑制。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平也是評(píng)估細(xì)胞代謝狀態(tài)的關(guān)鍵指標(biāo)。使用DCFH-DA探針，該探針能夠進(jìn)入細(xì)胞并被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH，DCFH可與ROS反應(yīng)生成具有熒光的DCF。通過流式細(xì)胞術(shù)或熒光顯微鏡檢測(cè)DCF的熒光強(qiáng)度，即可反映細(xì)胞內(nèi)ROS水平。在Trm10基因敲除的細(xì)胞中，ROS水平明顯升高，表明細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)增強(qiáng)，代謝平衡受到破壞。四、酶的功能研究方法與技術(shù)4.3結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)4.3.1X射線晶體學(xué)與NMR技術(shù)X射線晶體學(xué)是解析催化tRNA接受莖核苷酸甲基化酶結(jié)構(gòu)的重要技術(shù)之一，其原理基于X射線與晶體中原子的相互作用。當(dāng)X射線照射到酶的晶體上時(shí)，晶體中的原子會(huì)使X射線發(fā)生散射，散射的X射線在空間中相互干涉，形成特定的衍射圖案。這些衍射圖案包含了酶分子的結(jié)構(gòu)信息，通過收集和分析衍射數(shù)據(jù)，利用數(shù)學(xué)方法進(jìn)行相位計(jì)算和電子密度圖的重建，最終可以確定酶分子中原子的三維坐標(biāo)，從而解析出酶的三維結(jié)構(gòu)。在利用X射線晶體學(xué)解析酶結(jié)構(gòu)的過程中，獲得高質(zhì)量的晶體是關(guān)鍵步驟。為了生長出適合X射線衍射分析的晶體，需要對(duì)結(jié)晶條件進(jìn)行優(yōu)化，包括篩選合適的緩沖液、沉淀劑、pH值以及蛋白質(zhì)濃度等。通過懸滴法、坐滴法等結(jié)晶技術(shù)，將酶溶液與結(jié)晶母液混合，在一定的溫度和濕度條件下，讓蛋白質(zhì)分子逐漸有序排列，形成晶體。對(duì)于催化tRNA接受莖核苷酸甲基化的酶，由于其與底物tRNA的結(jié)合較為復(fù)雜，有時(shí)需要采用共結(jié)晶的方法，即將酶與底物tRNA共同結(jié)晶，以獲得酶-底物復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。在解析THUMPD3-TRMT112復(fù)合物的結(jié)構(gòu)時(shí)，研究人員通過優(yōu)化結(jié)晶條件，成功獲得了該復(fù)合物與底物tRNA的共晶體，通過X射線衍射分析，揭示了復(fù)合物與tRNA相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)特征。核磁共振（NMR）技術(shù)則從另一個(gè)角度為酶結(jié)構(gòu)解析提供了重要信息。NMR技術(shù)利用原子核的磁性特性，在強(qiáng)磁場(chǎng)中，原子核會(huì)發(fā)生能級(jí)分裂，當(dāng)施加特定頻率的射頻脈沖時(shí)，原子核會(huì)吸收能量發(fā)生共振躍遷。通過檢測(cè)共振信號(hào)的頻率、強(qiáng)度和耦合常數(shù)等參數(shù)，可以獲得分子中原子之間的距離、化學(xué)鍵的角度以及分子的動(dòng)態(tài)信息。對(duì)于催化tRNA接受莖核苷酸甲基化的酶，NMR技術(shù)可以在溶液狀態(tài)下對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，更接近酶在生理環(huán)境中的真實(shí)狀態(tài)。在利用NMR技術(shù)研究酶結(jié)構(gòu)時(shí)，首先需要對(duì)酶進(jìn)行同位素標(biāo)記，如15N、13C等，以提高NMR信號(hào)的靈敏度和分辨率。通過一系列的NMR實(shí)驗(yàn)，如二維核磁共振實(shí)驗(yàn)（1H-15NHSQC、1H-13CHSQC等），可以獲得酶分子中氨基酸殘基之間的化學(xué)位移信息，從而確定氨基酸殘基的類型和順序。通過NOESY等實(shí)驗(yàn)，可以測(cè)量原子之間的距離信息，用于構(gòu)建酶分子的三維結(jié)構(gòu)模型。NMR技術(shù)還可以研究酶與底物tRNA結(jié)合過程中的構(gòu)象變化，以及酶的動(dòng)態(tài)特性，如結(jié)構(gòu)的柔性和動(dòng)力學(xué)過程。在研究Trm10酶與底物tRNA的相互作用時(shí)，利用NMR技術(shù)檢測(cè)到了酶在結(jié)合底物前后的構(gòu)象變化，為理解酶的催化機(jī)制提供了重要線索。4.3.2結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系分析基于X射線晶體學(xué)和NMR技術(shù)解析的酶結(jié)構(gòu)，能夠深入剖析酶與底物結(jié)合以及催化反應(yīng)的內(nèi)在機(jī)制。從酶與底物結(jié)合的角度來看，以THUMPD3-TRMT112復(fù)合物為例，其結(jié)構(gòu)分析揭示了THUMPD3的THUMP結(jié)構(gòu)域在底物tRNA識(shí)別和結(jié)合中的關(guān)鍵作用。THUMP結(jié)構(gòu)域中的多個(gè)氨基酸殘基與tRNA接受莖的特定區(qū)域形成了廣泛的相互作用。其中，一些氨基酸殘基通過氫鍵與tRNA接受莖的磷酸骨架相互作用，提供了穩(wěn)定的靜電相互作用，確保了tRNA在復(fù)合物中的正確定位。THUMP結(jié)構(gòu)域中的精氨酸殘基（Arg）能夠與tRNA接受莖上的磷酸基團(tuán)形成強(qiáng)氫鍵，增強(qiáng)了酶與底物的結(jié)合親和力。除了靜電相互作用，THUMP結(jié)構(gòu)域中的一些氨基酸殘基還通過與tRNA接受莖的堿基形成范德華力和π-π堆積作用，進(jìn)一步穩(wěn)定了酶與底物的結(jié)合。某些芳香族氨基酸殘基，如苯丙氨酸（Phe）和酪氨酸（Tyr），其側(cè)鏈的芳香環(huán)能夠與tRNA接受莖上的堿基形成π-π堆積，增加了酶與底物之間的相互作用強(qiáng)度。這些相互作用的綜合效應(yīng)，使得THUMPD3-TRMT112復(fù)合物能夠特異性地識(shí)別tRNA接受莖，并將其準(zhǔn)確地定位到酶的活性中心，為后續(xù)的甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)創(chuàng)造了條件。在催化反應(yīng)機(jī)制方面，對(duì)Trm10酶的結(jié)構(gòu)分析表明，其活性中心的天冬氨酸殘基（Asp）在甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)中起著關(guān)鍵的酸堿催化作用。在反應(yīng)過程中，天冬氨酸殘基能夠通過提供或接受質(zhì)子，促進(jìn)底物tRNA與甲基供體S-腺苷甲硫氨酸（SAM）之間的反應(yīng)中間體的形成和轉(zhuǎn)化。當(dāng)?shù)孜飔RNA與Trm10酶結(jié)合后，天冬氨酸殘基首先接受SAM上甲基基團(tuán)的一個(gè)質(zhì)子，使SAM上的甲基碳正離子化，增強(qiáng)了其親電性。此時(shí)，底物tRNA接受莖上的目標(biāo)核苷酸的親核性基團(tuán)能夠更容易地進(jìn)攻甲基碳正離子，形成甲基化產(chǎn)物。在反應(yīng)的后半階段，天冬氨酸殘基再將質(zhì)子提供給反應(yīng)中間體，促進(jìn)產(chǎn)物的釋放和酶的再生。Trm10酶活性中心的一些疏水性氨基酸殘基，如苯丙氨酸（Phe）和亮氨酸（Leu），參與了底物tRNA和SAM的結(jié)合過程。它們通過與底物分子的疏水區(qū)域相互作用，形成疏水相互作用網(wǎng)絡(luò)，將底物分子穩(wěn)定地結(jié)合在活性中心。這些疏水性氨基酸殘基的存在，不僅有助于底物的正確定位，還能夠排除水分子等干擾物質(zhì)，提高催化反應(yīng)的特異性和效率。當(dāng)這些疏水性氨基酸殘基發(fā)生突變時(shí)，Trm10對(duì)底物的結(jié)合能力明顯下降，催化活性也隨之降低，進(jìn)一步證實(shí)了它們?cè)诖呋磻?yīng)中的重要作用。五、酶功能的具體研究5.1催化機(jī)制研究5.1.1反應(yīng)過程與中間產(chǎn)物催化tRNA接受莖核苷酸甲基化的酶在催化反應(yīng)過程中，遵循特定的反應(yīng)步驟，其間會(huì)產(chǎn)生一系列中間產(chǎn)物，這些步驟和產(chǎn)物對(duì)于深入理解酶的催化機(jī)制至關(guān)重要。以THUMPD3-TRMT112甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物催化tRNA接受莖上N2-甲基鳥苷酸（m2G）修飾為例，反應(yīng)起始時(shí)，酶與底物tRNA特異性結(jié)合，形成酶-tRNA復(fù)合物。這一結(jié)合過程基于酶的特定結(jié)構(gòu)域與tRNA接受莖的精確識(shí)別，如THUMPD3的THUMP結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基與tRNA接受莖的磷酸骨架和堿基相互作用，確保了tRNA在酶活性中心的正確定位。當(dāng)酶-tRNA復(fù)合物形成后，甲基供體S-腺苷甲硫氨酸（SAM）進(jìn)入酶的活性中心。SAM是一種富含能量的小分子，其甲基基團(tuán)具有較高的反應(yīng)活性。在酶的催化作用下，SAM上的甲基基團(tuán)被激活，形成一個(gè)高活性的甲基正離子中間體。此時(shí)，tRNA接受莖上的鳥苷酸（G）的N2原子作為親核試劑，對(duì)甲基正離子進(jìn)行親核攻擊。這一親核攻擊過程是催化反應(yīng)的關(guān)鍵步驟，它導(dǎo)致甲基基團(tuán)從SAM轉(zhuǎn)移到tRNA的鳥苷酸上，形成N2-甲基鳥苷酸（m2G）。在甲基轉(zhuǎn)移過程中，會(huì)形成一個(gè)短暫的過渡態(tài)中間體，該中間體包含酶、tRNA、SAM以及正在轉(zhuǎn)移的甲基基團(tuán)，其結(jié)構(gòu)處于一種不穩(wěn)定的高能狀態(tài)。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，過渡態(tài)中間體逐漸分解，生成產(chǎn)物S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）和甲基化的tRNA，酶則恢復(fù)到初始狀態(tài)，準(zhǔn)備進(jìn)行下一輪催化反應(yīng)。為了驗(yàn)證反應(yīng)過程中中間產(chǎn)物的存在，科研人員采用了多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)。利用快速冷凍淬滅技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜分析，能夠在反應(yīng)的不同時(shí)間點(diǎn)捕捉到反應(yīng)體系中的中間產(chǎn)物。在反應(yīng)初期，通過快速冷凍淬滅反應(yīng)，使反應(yīng)瞬間停止，然后利用質(zhì)譜分析檢測(cè)到了含有甲基正離子中間體的酶-tRNA-SAM復(fù)合物的信號(hào)。在反應(yīng)進(jìn)行到一定階段時(shí)，又檢測(cè)到了過渡態(tài)中間體的信號(hào)，這些信號(hào)的出現(xiàn)為反應(yīng)過程中中間產(chǎn)物的存在提供了直接的證據(jù)。利用核磁共振（NMR）技術(shù)研究酶催化反應(yīng)過程中分子的動(dòng)態(tài)變化，也能夠間接推斷中間產(chǎn)物的存在。通過監(jiān)測(cè)tRNA和SAM在反應(yīng)過程中的化學(xué)位移變化，發(fā)現(xiàn)了在特定時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)的化學(xué)位移異常，這與中間產(chǎn)物的形成和轉(zhuǎn)化過程相吻合，進(jìn)一步支持了反應(yīng)過程中存在中間產(chǎn)物的觀點(diǎn)。5.1.2酶與底物的相互作用在分子層面，催化tRNA接受莖核苷酸甲基化的酶與tRNA底物之間存在著復(fù)雜而精細(xì)的相互作用，這些相互作用涉及多種作用力，共同確保了酶對(duì)底物的特異性識(shí)別和高效催化。以Trm10酶與tRNA底物的相互作用為例，通過X射線晶體學(xué)和核磁共振等技術(shù)解析的酶-底物復(fù)合物結(jié)構(gòu)顯示，Trm10酶的底物識(shí)別結(jié)構(gòu)域能夠特異性地識(shí)別tRNA接受莖上的特定序列和結(jié)構(gòu)特征。在識(shí)別過程中，酶與tRNA之間形成了多種相互作用。靜電相互作用在酶與底物的結(jié)合中起著重要作用。Trm10酶的底物識(shí)別結(jié)構(gòu)域中含有多個(gè)帶正電荷的氨基酸殘基，如精氨酸（Arg）和賴氨酸（Lys），它們能夠與tRNA接受莖上帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)形成靜電吸引。這些靜電相互作用不僅有助于酶與底物的初始結(jié)合，還能夠穩(wěn)定酶-底物復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，確保tRNA在酶活性中心的正確定位。研究表明，當(dāng)對(duì)Trm10酶中的精氨酸殘基進(jìn)行突變，使其失去正電荷時(shí)，酶與tRNA的結(jié)合能力顯著下降，催化活性也受到明顯抑制。氫鍵相互作用也是酶與底物相互作用的重要組成部分。Trm10酶的底物識(shí)別結(jié)構(gòu)域中的一些氨基酸殘基能夠與tRNA接受莖上的堿基形成氫鍵。絲氨酸（Ser）和蘇氨酸（Thr）等氨基酸殘基的羥基能夠與tRNA堿基上的氮原子或氧原子形成氫鍵，這些氫鍵的形成進(jìn)一步增強(qiáng)了酶與底物之間的相互作用。氫鍵的方向性和特異性使得酶能夠準(zhǔn)確識(shí)別tRNA底物上的特定堿基序列，保證了催化反應(yīng)的特異性。通過定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)，改變與tRNA形成氫鍵的氨基酸殘基，發(fā)現(xiàn)酶對(duì)tRNA的識(shí)別能力和催化活性發(fā)生了顯著變化。除了靜電相互作用和氫鍵相互作用外，疏水相互作用在酶與底物的結(jié)合中也發(fā)揮著重要作用。Trm10酶的底物識(shí)別結(jié)構(gòu)域中含有一些疏水性氨基酸殘基，如苯丙氨酸（Phe）和亮氨酸（Leu），它們能夠與tRNA接受莖上的疏水區(qū)域相互作用，形成疏水相互作用網(wǎng)絡(luò)。這些疏水相互作用有助于排除水分子等干擾物質(zhì)，增強(qiáng)酶與底物之間的結(jié)合親和力。在酶-底物復(fù)合物的結(jié)構(gòu)中，疏水性氨基酸殘基與tRNA的疏水區(qū)域緊密結(jié)合，形成了一個(gè)相對(duì)疏水的微環(huán)境，有利于甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的進(jìn)行。當(dāng)對(duì)Trm10酶中的疏水性氨基酸殘基進(jìn)行突變時(shí)，酶與tRNA的結(jié)合能力明顯下降，催化活性也隨之降低。五、酶功能的具體研究5.2對(duì)tRNA結(jié)構(gòu)和功能的影響5.2.1對(duì)tRNA穩(wěn)定性的影響通過一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)，深入分析了甲基化修飾對(duì)tRNA穩(wěn)定性的影響及內(nèi)在機(jī)制。利用熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，對(duì)甲基化修飾前后的tRNA進(jìn)行處理，通過監(jiān)測(cè)tRNA在不同溫度下的結(jié)構(gòu)變化，評(píng)估其穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，甲基化修飾后的tRNA在高溫環(huán)境下的穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)。以酵母tRNA為例，其接受莖上第47位核苷酸的5-甲基胞嘧啶（m5C）修飾能夠明顯提高tRNA的熱穩(wěn)定性。在相同的升溫條件下，未修飾的tRNA在較低溫度下就開始發(fā)生結(jié)構(gòu)解折疊，導(dǎo)致其功能喪失；而經(jīng)過m5C修飾的tRNA能夠在更高的溫度下保持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，維持其正常功能。從分子機(jī)制層面來看，甲基化修飾通過影響tRNA的堿基堆積和氫鍵網(wǎng)絡(luò)，增強(qiáng)了tRNA的穩(wěn)定性。tRNA接受莖上的甲基化修飾增加了堿基之間的堆積力，使tRNA分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)更加緊密。甲基基團(tuán)的引入改變了堿基周圍的電子云分布，使得堿基之間的相互作用增強(qiáng)，有利于形成穩(wěn)定的堿基對(duì)和堿基堆積結(jié)構(gòu)。m5C修飾的胞嘧啶與相鄰堿基之間的π-π堆積作用增強(qiáng)，使得tRNA的局部結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。甲基化修飾還可能影響tRNA與其他分子的相互作用，進(jìn)一步穩(wěn)定tRNA的結(jié)構(gòu)。某些甲基化修飾后的tRNA與細(xì)胞內(nèi)的tRNA結(jié)合蛋白的親和力增加，這些蛋白能夠與tRNA形成復(fù)合物，保護(hù)tRNA免受核酸酶的降解，從而提高tRNA的穩(wěn)定性。通過分析tRNA在細(xì)胞內(nèi)的半衰期，也證實(shí)了甲基化修飾對(duì)其穩(wěn)定性的影響。利用脈沖-追蹤實(shí)驗(yàn)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)新合成的tRNA進(jìn)行標(biāo)記，然后在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)tRNA的豐度。在敲除負(fù)責(zé)tRNA接受莖甲基化修飾的酶基因后，細(xì)胞內(nèi)tRNA的半衰期明顯縮短。在敲除Trm10基因的酵母細(xì)胞中，相應(yīng)tRNA的半衰期比野生型細(xì)胞縮短了約50%，表明甲基化修飾的缺失導(dǎo)致tRNA穩(wěn)定性下降，更容易被細(xì)胞內(nèi)的核酸酶降解。這一結(jié)果進(jìn)一步說明了甲基化修飾在維持tRNA穩(wěn)定性方面的重要作用。5.2.2對(duì)tRNA解碼準(zhǔn)確性的影響深入探討了修飾后tRNA在蛋白質(zhì)合成中解碼準(zhǔn)確性的變化及潛在原因。通過核糖體結(jié)合實(shí)驗(yàn)，研究修飾后tRNA與核糖體的結(jié)合能力以及在解碼過程中的表現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，甲基化修飾對(duì)tRNA與核糖體的結(jié)合親和力產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響解碼準(zhǔn)確性。在體外翻譯實(shí)驗(yàn)中，將修飾后的tRNA與核糖體、mRNA以及其他翻譯因子共同孵育，檢測(cè)蛋白質(zhì)合成的準(zhǔn)確性。對(duì)于催化tRNA接受莖上m2G修飾的THUMPD3-TRMT112復(fù)合物，當(dāng)tRNA接受莖發(fā)生m2G修飾后，在翻譯過程中，其解碼準(zhǔn)確性得到顯著提高。在翻譯含有特定密碼子的mRNA時(shí)，修飾后的tRNA能夠更準(zhǔn)確地識(shí)別密碼子，減少錯(cuò)譯的發(fā)生，使蛋白質(zhì)合成的準(zhǔn)確性提高了約30%。從分子機(jī)制上分析，甲基化修飾通過改變tRNA的構(gòu)象和反密碼子的靈活性，影響其與mRNA密碼子的配對(duì)準(zhǔn)確性。tRNA接受莖的甲基化修飾能夠穩(wěn)定tRNA的整體構(gòu)象，使反密碼子環(huán)處于更有利于與mRNA密碼子配對(duì)的狀態(tài)。甲基化修飾還可能影響反密碼子與密碼子之間的堿基互補(bǔ)配對(duì)能力，增強(qiáng)配對(duì)的穩(wěn)定性。m2G修飾的鳥苷酸在與mRNA密碼子配對(duì)時(shí)，能夠形成更穩(wěn)定的氫鍵和堿基堆積作用，減少錯(cuò)配的概率。修飾后的tRNA與氨酰-tRNA合成酶的相互作用也可能發(fā)生改變，影響氨基酸的正確加載，進(jìn)而影響解碼準(zhǔn)確性。某些甲基化修飾后的tRNA與氨酰-tRNA合成酶的親和力增強(qiáng)，能夠更準(zhǔn)確地接受正確的氨基酸，保證了翻譯過程中氨基酸摻入的準(zhǔn)確性。在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中，tRNA接受莖的甲基化修飾對(duì)蛋白質(zhì)合成的準(zhǔn)確性也起著重要作用。通過基因編輯技術(shù)，改變細(xì)胞內(nèi)tRNA甲基化修飾的水平，檢測(cè)蛋白質(zhì)組的變化。在敲低THUMPD3-TRMT112復(fù)合物相關(guān)基因的細(xì)胞中，tRNA的m2G修飾水平下降，蛋白質(zhì)組分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊和異常表達(dá)增加，表明tRNA甲基化修飾水平的降低導(dǎo)致了解碼準(zhǔn)確性下降，影響了蛋白質(zhì)的正常合成和功能。這一結(jié)果進(jìn)一步證明了tRNA接受莖甲基化修飾在維持蛋白質(zhì)合成解碼準(zhǔn)確性方面的關(guān)鍵作用。5.3在生物過程中的功能5.3.1在細(xì)胞代謝中的作用催化tRNA接受莖核苷酸甲基化的酶在細(xì)胞代謝途徑中扮演著重要角色，對(duì)氨基酸代謝和能量代謝產(chǎn)生著深遠(yuǎn)影響。在氨基酸代謝方面，以大腸桿菌中催化tRNA接受莖m6A修飾的酶為例，其通過調(diào)節(jié)tRNA的修飾水平，影響氨基酸的加載和轉(zhuǎn)運(yùn)過程。當(dāng)該酶活性正常時(shí)，tRNA接受莖的m6A修飾能夠增強(qiáng)tRNA與氨酰-tRNA合成酶的結(jié)合親和力，促進(jìn)氨基酸準(zhǔn)確地加載到tRNA上。這一過程確保了細(xì)胞內(nèi)各種氨基酸能夠及時(shí)、準(zhǔn)確地被轉(zhuǎn)運(yùn)到核糖體，參與蛋白質(zhì)合成，維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的正常秩序。在蛋白質(zhì)合成過程中，各種氨基酸的正確摻入依賴于tRNA的準(zhǔn)確識(shí)別和轉(zhuǎn)運(yùn)，而酶催化的tRNA接受莖甲基化修飾為這一過程提供了重要保障。當(dāng)該酶活性受到抑制時(shí)，tRNA的m6A修飾水平下降，與氨酰-tRNA合成酶的結(jié)合能力減弱，導(dǎo)致氨基酸加載錯(cuò)誤或延遲。這會(huì)使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成出現(xiàn)異常，產(chǎn)生錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，這些異常蛋白質(zhì)可能會(huì)干擾細(xì)胞內(nèi)的正常代謝途徑，如參與氨基酸代謝的關(guān)鍵酶的活性可能受到影響，導(dǎo)致氨基酸代謝紊亂。細(xì)胞內(nèi)某些氨基酸的積累或缺乏，可能會(huì)觸發(fā)一系列反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，影響其他相關(guān)代謝途徑的正常運(yùn)行。在能量代謝方面，以小鼠肝臟細(xì)胞中THUMPD3-TRMT112復(fù)合物為例，其催化的tRNA接受莖m2G修飾對(duì)能量代謝相關(guān)蛋白質(zhì)的合成具有重要調(diào)控作用。在肝臟細(xì)胞的糖代謝途徑中，參與糖酵解和糖原合成的關(guān)鍵酶，如己糖激酶、磷酸果糖激酶和糖原合成酶等，它們的合成依賴于準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)翻譯過程。THUMPD3-TRMT112復(fù)合物通過催化tRNA接受莖的m2G修飾，提高了tRNA在翻譯過程中的解碼準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，確保了這些關(guān)鍵酶的正確合成。當(dāng)THUMPD3-TRMT112復(fù)合物的表達(dá)或活性發(fā)生改變時(shí)，tRNA的m2G修飾水平受到影響，進(jìn)而影響能量代謝相關(guān)蛋白質(zhì)的合成。在敲低THUMPD3-TRMT112復(fù)合物相關(guān)基因的肝臟細(xì)胞中，糖酵解和糖原合成關(guān)鍵酶的表達(dá)量下降，導(dǎo)致糖代謝途徑受阻，血糖水平異常。細(xì)胞內(nèi)能量代謝的紊亂可能會(huì)進(jìn)一步影響其他代謝過程，如脂質(zhì)代謝、核苷酸代謝等，因?yàn)檫@些代謝過程都依賴于能量的供應(yīng)和代謝中間產(chǎn)物的相互轉(zhuǎn)化。在脂質(zhì)代謝中，脂肪酸的合成和氧化需要消耗能量，而糖代謝紊亂導(dǎo)致的能量供應(yīng)不足，會(huì)影響脂質(zhì)代謝的正常進(jìn)行，可能導(dǎo)致脂肪堆積或脂肪酸氧化異常。5.3.2在發(fā)育和疾病中的角色在生物個(gè)體發(fā)育過程中，催化tRNA接受莖核苷酸甲基化的酶的表達(dá)呈現(xiàn)出動(dòng)態(tài)變化，對(duì)胚胎發(fā)育和組織分化等過程產(chǎn)生著重要影響。以斑馬魚胚胎發(fā)育為例，在胚胎早期發(fā)育階段，Trm10酶的表達(dá)水平較高。通過原位雜交和免疫熒光等技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Trm10酶在胚胎的神經(jīng)板、中胚層和內(nèi)胚層等組織中均有表達(dá)。在神經(jīng)板發(fā)育過程中，Trm10酶催化的tRNA接受莖甲基化修飾對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞的分化和神經(jīng)回路的形成至關(guān)重要。研究表明，當(dāng)通過基因敲降技術(shù)降低Trm10酶的