DB45-T2755-2023-百香果品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR分子標記法-廣西壯族自治區(qū)

ICS65.020.20CCSB0545廣西壯族自治區(qū)地方標準DB45/T2755—2023百香果品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR分子標記法CodeofpracticeidentificationofpassionfruitvarietiesbySSRmolecularmarkermethod廣西壯族自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB45/T2755—2023目次前言.................................................................................II1范圍...............................................................................12規(guī)范性引用文件.....................................................................13術(shù)語和定義.........................................................................14縮略語.............................................................................15原理...............................................................................26材料和試劑.........................................................................26.1一般規(guī)定.......................................................................26.2試劑...........................................................................26.3溶液配制.......................................................................27儀器和設(shè)備.........................................................................38SSR引物序列信息....................................................................39操作步驟...........................................................................49.1樣品采集.......................................................................49.2DNA提取........................................................................49.3PCR擴增........................................................................49.4PCR產(chǎn)物檢測....................................................................410數(shù)據(jù)記錄與統(tǒng)計....................................................................510.1數(shù)據(jù)記錄......................................................................510.2統(tǒng)計..........................................................................511結(jié)果判定..........................................................................611.1判定方法......................................................................611.2結(jié)果表述......................................................................6附錄A（規(guī)范性）引物序列信息.........................................................7IDB45/T2755—2023前言本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。本文件由廣西檢驗檢疫標準化技術(shù)委員會提出、歸口并宣貫。本文件起草單位：廣西益譜檢測技術(shù)有限公司、廣西博測檢測技術(shù)服務(wù)有限公司、廣西綠保環(huán)境監(jiān)測有限公司、廣西智標云信息科技有限公司、南寧海關(guān)技術(shù)中心、廣西壯族自治區(qū)種子管理站、百色市檢驗檢測中心、南寧維爾凱生物科技有限公司。本文件主要起草人：趙永鋒、姚振光、何京明、黎保序、朱秋蓮、莫璋紅、蘇麗梅、薛海燕、梁俊、黃小娟、王丹、勞蘇海、莫薇、黃鸝、鄭美玲、官月香、韋仁礦、韋東、黃芳、劉守廷。IIDB45/T2755—2023百香果品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR分子標記法1范圍本文件界定了百香果品種鑒定技術(shù)的相關(guān)術(shù)語和定義，規(guī)定了利用簡單重復序列（simplesequencerepeat，SSR）分子標記法進行百香果品種鑒定的原理、材料和試劑、儀器設(shè)備、引物序列信息、操作步驟、數(shù)據(jù)記錄和統(tǒng)計、結(jié)果判定。本文件適用于廣西壯族自治區(qū)行政區(qū)域內(nèi)基于SSR分子標記的百香果品種SSR指紋數(shù)據(jù)采集和品種鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法NY/T2594植物品種鑒定DNA分子標記法總則3核心引物coreprimer品種鑒定中優(yōu)先選用一套簡單重復序列（SSR）引物，其檢測位點具有多態(tài)性高、重復性好等綜合具有所用SSR位點上不同等位變異的特性，用于輔助確定待測樣品的等位變異，校正儀器設(shè)備的系利用DNA在體外攝氏95℃高溫時變性會變成單鏈，低溫（經(jīng)常是60℃左右）時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結(jié)合，再調(diào)溫度至DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度（72℃左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖（5'-3'）的方向合成互補鏈。4縮略語1DB45/T2755—2023DNA：脫氧核糖核酸（DeoxyriboNucleicAcid）。5原理不同品種百香果的基因組成不同，其基因組中SSR的重復次數(shù)存在差異，根據(jù)SSR的差異，通過PCR擴增及電泳技術(shù)可以鑒定百香果品種。6材料和試劑6.1一般規(guī)定除另有說明外，本文件中使用分析純（含）以上試劑，水為符合GB/T6682規(guī)定的二級水，其中PCR用水要求達到一級水指標。6.2試劑6.2.1三羥甲基氨基甲烷（C4H11NO3）：純度＞99.0％。6.2.2乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）：純度≥99.0％。6.2.3硼酸（H3BO3）：ρ=1.43g/cm3，含量≥99.5％。6.2.4十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）：ρ=1.32g/mL，純度≥99.0％。6.2.5氯化鈉（NaCl）：ρ=2.165g/cm3，含量≥99.5％。6.2.6瓊脂糖。6.2.7過硫酸銨（(NH4)2S2O8）：ρ=1.98g/cm3，含量≥98.0％。6.2.12三氯甲烷（CHCl3）：ρ=1.50g/cm3。6.2.15去離子甲酰胺（CH3NO）：ρ=1.133g/mL。6.2.1640％丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺溶液（Acryl/BisSolution(29:1)）。6.2.17四甲基乙二胺（TEMED）：ρ=1.32g/mL。6.2.18DNA分子量標準（DNAmarker）：可以清楚區(qū)分50bp～500bp的DNA片段。6.2.192×TaqPlusPCR預混試劑：0.1U/μLTaqPlusPolymerase、500μmol/LdNTPeach、20mmol/LTris-HCl(pH=8.3)、100mmol/LKCl、3mmol/LMgCl2、穩(wěn)定劑、增強劑。6.3稱取5.40g三羥甲基氨基甲烷（6.1.1）、0.372g乙二胺四乙酸二鈉（6.1.2）和2.75g硼酸（6.1.3）溶于70mL一級水中，定容至100mL，在103.4kPa（121℃）條件下滅菌20min。2DB45/T2755—20236.3.3CTAB提取溶液稱取4.00g十六烷基三甲基溴化銨（6.1.4）、16.38g氯化鈉（6.1.5）、1.21g三羥甲基氨基甲烷（6.1.1）、1.49g乙二胺四乙酸二鈉（6.1.2）溶于70mL一級水，定容至200mL，在103.4kPa（121℃）條件下滅菌20min。6.3.4無菌一級水一級水在103.4kPa（121℃）條件下滅菌20min。6.3.51％瓊脂糖溶液1g瓊脂糖（6.1.6）溶于100mL的0.5×TBE緩沖液（6.2.2），適當加熱融化。6.3.610％過硫酸銨溶液稱取10g過硫酸銨（6.1.7），加入100mL一級水溶解。6.3.7電泳緩沖液稱取108g三羥甲基氨基甲烷（6.1.1）、7.44g乙二胺四乙酸二鈉（6.1.2）、55g硼酸（6.1.3）、0.80g氫氧化鈉（6.1.8），加入10L一級水溶解。6.3.8染色液稱取4.0g氫氧化鈉（6.1.8），加入400mL一級水溶解，臨用時再加1.6mL甲醛（6.1.10）。77.3高速冷凍離心機。7.4PCR擴增儀。7.5垂直板電泳系統(tǒng)。7.6凝膠成像系統(tǒng)。7.7毛細管電泳儀。7.8膠片觀察燈。7.9渦旋振蕩儀。8SSR引物序列信息3DB45/T2755—20239操作步驟9.1樣品采集隨機取5個單株，用不銹鋼剪刀采集種植的待測品種的百香果嫩葉放入塑料樣品袋中，做好標識，放入0℃～8℃保溫箱中，帶回實驗室，于-18℃及以下條件保存。9.2DNA提取稱取9.1中1g～2g百香果葉片用自來水沖洗干凈，再用一級水沖洗兩遍，自然晾干后用不銹鋼剪刀剪碎放入研缽中，加入液氮（6.1.11）研磨成粉末狀，稱取100mg放入1.5mL離心管中，加入750μLCTAB提取溶液（6.2.3），渦旋振蕩混勻后于65℃水浴45min～60min，期間每隔15min顛倒離心管混勻；加入500μL的三氯甲烷（6.1.12），顛倒混勻，12000r/min離心3min，轉(zhuǎn)移上清液約0.5mL至新離心管中，加入等體積（即0.5mL）預冷至約4℃的無水乙醇（6.1.13），顛倒混勻，-18℃下靜置1h，12000r/min離心3min，棄去上清液，室溫下?lián)]干沉淀。加入50μL無菌一級水（6.2.4）混勻后于-18℃及以下條件保存。注：以上為推薦的DNA提取方法。其他能夠達到PCR擴增質(zhì)量的DNA提取方法也適用于本文件。9.3PCR擴增9.3.1PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系參見表1。表1PCR反應(yīng)體系體積94℃預變性5min；94℃變性30s，退火30s（退火溫度按附錄A），72℃延伸30s，35個循環(huán)；最后72℃下延伸7min。9.4PCR產(chǎn)物檢測非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測在一對玻璃板間插入1.0mm寬的間隔片，在封口處注入1％瓊脂糖溶液（6.2.5），讓其凝固密封。在50mL量杯中依次加入7.5mL5×TBE緩沖液（6.2.1），7.5mL40％Acryl/BisSolution(29:1)（6.1.16），攪拌并用一級水定容至30mL；加入200μL10％過硫酸銨（6.2.6）和12μL四甲基乙二胺溶液（6.1.17），混勻后倒入凝膠板之間，隨即插好樣品梳，使其在50min～60min內(nèi)聚合凝固，凝膠高度不應(yīng)小于10cm。4DB45/T2755—20239.4.1.2電泳將玻璃板固定于垂直電泳槽上，在電泳槽中加入電泳緩沖液（6.2.7），小心拔下樣品梳。用加樣器吸取1μL不同引物PCR產(chǎn)物，加入樣品孔中，同時在同一塊膠中加入1μLDNAmarker（6.1.18）。電泳選用的電壓梯度為1V/cm～5V/cm，2×TaqPlus預混試劑（6.1.19）的藍色指示帶從上到下分別到達膠板1/2、2/3處（50min～70min）后結(jié)束電泳。9.4.1.3銀染顯色銀染顯色按下列步驟操作。a)固定：將附著凝膠的玻璃板用去一級水沖洗30s～60s后，將凝膠放入方形不銹鋼盤中；b)染色：加入染色液（6.2.8）覆蓋凝膠，輕搖5min～10min進行染色；c)漂洗：倒掉染色液，用去一級水快速漂洗兩次，每次20s；d)染色：放入顯色液（6.2.9）中，輕搖至顯色出清晰帶紋；e)漂洗：取出凝膠用一級水沖洗兩次；f)瀝干后進行拍照。9.4.2毛細管電泳檢測9.4.2.1PCR產(chǎn)物樣品準備分別量取等體積的稀釋后不同引物PCR擴增產(chǎn)物溶液混合，從混合液中吸取1μL按序號加入到DNA分析儀專用96孔板孔中，板中各孔分別再加入0.1μLDNALIZ500分子量內(nèi)標（6.1.14）和8.9μL去離子甲酰胺（6.1.15）。將樣品在PCR儀上95℃變性5min，取出，迅速置于冰浴中，冷卻10min～15min。將整個96孔板置于4000r/min離心機中，離心10s后放置到DNA分析儀上待檢。按照儀器操作規(guī)程，編輯樣品表及運行程序，執(zhí)行運行程序，儀器自動給出檢測結(jié)果，保存并記錄數(shù)據(jù)。10.110.1.2對于毛細管電泳檢測方法，使用對照品種消除DNA分析儀間可能存在的系統(tǒng)誤差，使用片段分析軟件讀取位點等位變異；10.1.3對于非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測方法，將待檢樣品與對照品種的等位變異片段進行比較，明確待檢樣品位點等位變異。10.2純合位點結(jié)合等位變異大小數(shù)據(jù)記為X/X，其中X為該位點等位變異的大?。浑s合位點的等位變異大小數(shù)據(jù)記錄為X/Y，其中X、Y分別為該位點上的2個等位變異的大小，小片段數(shù)據(jù)在前、大片段數(shù)據(jù)在后；缺失位點的等位變異大小數(shù)據(jù)記錄為0/0。示例1：樣品在某個位點上僅出現(xiàn)1個等位變異，大小為160bp，則該位點的等位變異數(shù)據(jù)記錄為160/160。示例2：樣品在某個位點上僅出現(xiàn)2個等位變異，大小為160bp、165bp，則該位點的等位變異數(shù)據(jù)記錄為160/165。5DB45/T2755—202311結(jié)果判定11.1判定方法11.1.1待檢樣品和對照品種間差異位點數(shù)≥2，判定為“不同品種”。11.1.2待檢樣品和對照品種間差異位點數(shù)=1，判定為“近似品種”。11.1.3待檢樣品和對照品種間差異位點數(shù)=0，判定為“極近似品種或相同品種”。11.2結(jié)果表述待測樣品與對照樣品（或數(shù)據(jù)庫中已知品種）利用分子標記類型，，差異位點采用數(shù)為檢測平臺，采用位點組合進行檢測，結(jié)果顯示：檢測位點數(shù)為，判定為（相同或疑同）。6DB45/T2755—2023附錄A（規(guī)范性）引物序列信息引物序列信息按表A.1。表A.1引物編號及引物擴增信息序號條帶大小引物退火溫度℃引物名稱PeRM10001PeRM10005PeRM10006PeRM10007PeRM10008PeRM10009PeRM10011PeRM10012PeRM10014PeRM10016PeRM10017PeRM10018PeRM10019PeRM10020Pa_F-P10A10Pa_F+R-Contig114引物序列（5’-3’）bp正向：GCATGGACTTGATTTGTATATTCT反向：GAGAACAATGATGTCACTTTCATA正向：TAGTGACATAACTGAAAACGCTAT反向：GAGTTACCGCTGAAGTTTTCTA正向：TCATTAACATCGTAAACAAAGATT反向：AATTCGACAAGATTTACTGATACA正向：GTAGTAGGAGAATATTTGAGGGAA反向：CTATTTTGTGATCCAAGGAAGT正向：GTCACTATCATCCCATAAAAATTC反向：AGGTAAAATTAATATGATAAGCGAA正向：GATTGATTTGTGGATGGATACT反向：CACTTGTTTCACTCGTACAATAAT正向：ATGGAGAAGACTTCAGAGTCAC’反向：AGAGATATTTTTCACTCACTGGAT正向：CTCCATATCAGATTAAGTAACCAC反向：CTCAAATAAAAACAAACCTGTTAC正向：CATTTATAAAGGAATTGACAAGAA反向：CTGAGTTAATGCTGTGATTAAGAT正向：AATTTTCTTGGCTTAAAACACTAC反向：TTGACTTCACTGCTATGGTATTAG正向：AAGACACTGATAGTTCTCTGAGG反向：CAAATTATGATAAGAAACTTGGAA正向：ACAGAAAAGAAAGATAAAGCAAAT反向：TTCAGTATCCAACTGAACACAC正向：TGGTAGTCAATCAGAAAACTAAGA反向：GAGTTGTTAGGTCTCCTCAACTTA正向：AACAGGGTATACTGTAAATCATTG反向：GTTTATTCCTTTCTCTTCTAGTGC正向：TGGAATGTGATTTGCATGG1295～10798～140149～19095～106105～123135～14550505050505055505050505050505050345120～130109135～1801518130～140149146～176160～170142～150132～1422207DB45/T2755—2023表A.1引物編號及引物擴增信息（續(xù)）序條帶大小引物退火溫度℃引物名稱引物序列（5’-3’）號bp正向：CAGAAGGAAAACCAGCAAG反向：CCCCATCATCATCACTTTC正向：TTAATGCCACAGCCCAAC反向：TGACCCAAAATCAAACACC正向：