醫(yī)用供體豬基因鑒定通則

ICS07.080

CCS

□B

地方標(biāo)準(zhǔn)

DBXX/TXXXX—XXXX

醫(yī)用供體豬基因鑒定通則

GeneraIprinciplesofgeneticidentificationformedicaldonorpigs

（征求意見稿）

在提交反饋意見時(shí)，請(qǐng)將您知道的相關(guān)專利連同支持性文件一并附上。

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實(shí)施

發(fā)布

DBXX/TXXXX-XXXX

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1范圍

本文件規(guī)定了醫(yī)用供體豬基因鑒定的總體原則及鑒定方法。

本文件適用「醫(yī)用供體豬的生產(chǎn)、引種、交付過程中基因鑒定。

基因修飾動(dòng)物的基因鑒定可參考本文件。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件,

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T19495.4-2004轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)核酸定性PCR檢測(cè)方法

GB/T19495.7轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)抽樣和制樣

GB/T30989高通量基因測(cè)序技術(shù)規(guī)程

GB/T33681.1高通量基因測(cè)序樣本預(yù)處理方法第1部分：動(dòng)物組織樣本預(yù)處理

GB/T35537高通量基因測(cè)序結(jié)果評(píng)價(jià)要求

GB/T38477基因表達(dá)的測(cè)定蛋白印跡法

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

醫(yī)用供體豬medicaIdonorpigs

通過生物工程技術(shù)獲得，用于提供醫(yī)療用途的活器官或生物材料制備的低免疫原性豬及其群體。

32

基因修飾geneticmodification

利用生物化學(xué)方法修改生物遺傳物質(zhì)，使生物產(chǎn)生新性狀，修飾方式主要包括轉(zhuǎn)基因、基因編輯介

導(dǎo)的基因定點(diǎn)插入和基因敲除3種。

注：醫(yī)用供體豬常見基因修飾名稱及種類見附錄A。

33

基因整合geneintegration

將特定基因片段導(dǎo)入宿主基因組內(nèi)的基因修飾方法，包括轉(zhuǎn)基因和基因定點(diǎn)插入。

基因敲除knockout

將特定基因片段從基因組中去除的基因修飾方式。

35

基因修飾穩(wěn)定性檢測(cè)geneticmodificationstabiIitytest

通過連續(xù)檢測(cè)不同代數(shù)基因修飾動(dòng)物基因型、基因表達(dá)情況來評(píng)估基因修飾在動(dòng)物群體中遺傳穩(wěn)

定、及表達(dá)穩(wěn)定的手段。

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3.6

基因組結(jié)構(gòu)變異structuraIvariants；SVs

在醫(yī)用供體豬獲得過程中，基因組上發(fā)生長片段（＞50bp）的序列變化和位置關(guān)系變化。

注：基因組結(jié)構(gòu)變異包括長片段序列插入或刪除、串聯(lián)重復(fù)、染包體倒位、染色體內(nèi)部或染色體之間的序列易位、

基因拷貝數(shù)變異以及嵌合性變異等。

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脫靶off-target

與靶標(biāo)不同的基因組位置和/或核酸序列。

示例：結(jié)合脫靶、切割脫靶、編輯脫靶、序列改變脫靶。

注：編輯脫靶屬于非預(yù)期編輯。

[來源:ISO5058:1-2021,3.1.4]

?fl

高通量測(cè)序high-throughputsequencing

以一次并行幾十萬到幾百萬條核酸分子序列測(cè)定和一般讀長較短等為標(biāo)志，適用于DNA的測(cè)序

技術(shù)。

[來源:35890-2018,3.1]

4總體原則

基因鑒定是醫(yī)用供體豬制備過程中重要組成環(huán)節(jié)，醫(yī)用供體豬制備、篩選、交付等過程應(yīng)對(duì)其進(jìn)行

基因鑒定。因其用途的特殊性，醫(yī)用供體豬基因鑒定應(yīng)同時(shí)考慮安全性和有效性，降低因基因修飾技術(shù)

引入的不可控因素。安全性和有效性評(píng)價(jià)應(yīng)結(jié)合設(shè)計(jì)預(yù)期、基因修飾類型進(jìn)行綜合評(píng)估，鑒定項(xiàng)目可參

考表1。

表1醫(yī)用供體豬基因鑒定評(píng)價(jià)項(xiàng)目

序號(hào)鑒定/檢測(cè)項(xiàng)目評(píng)價(jià)類型

1基因型

有效性評(píng)價(jià)

2基因表達(dá)

3遺傳穩(wěn)定性遺傳穩(wěn)定檢測(cè)

4基因組結(jié)構(gòu)變異

安全性評(píng)價(jià)

5脫靶

5鑒定項(xiàng)目及方法

5'有效性評(píng)價(jià)

5.1.1基因型鑒定

5.1.1.1鑒定方法

樣本DNA提取可選用符合要求的商業(yè)化試劑盒進(jìn)行提取，也可由實(shí)驗(yàn)室自建方法提取。引物設(shè)計(jì)應(yīng)

在目標(biāo)基因（擬整合基因/敲除基因靶位）上下游設(shè)計(jì)引物，參考序列可在NCBI上獲取。樣本DNA提取后，

進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，符合質(zhì)量要求的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，觀察目標(biāo)條帶判定是否符合

2

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預(yù)期。判定基因整合見5.1.1.2a）。判定目標(biāo)基因的是否敲除，應(yīng)將符合預(yù)期的條帶回收，進(jìn)行Sanger

測(cè)序（見5.1.1.2b））。

注：基因整合鑒定示例見附錄BLEA29丫基因有效性檢測(cè)方法基因型鑒定部分，基因敲除鑒定示例見附錄CGGTA1有

效性檢測(cè)基因型鑒定部分。

5.1.1.2結(jié)果判定

a）出現(xiàn)目標(biāo)條帶，則判定基因整合有效。

b）目標(biāo)片段測(cè)序結(jié)果和參考序列比對(duì)，靶位產(chǎn)生不為3的倍數(shù)堿基的插入和缺失，則判定基因敲

除有效。

5.1.2基因表達(dá)

5.1.2.1檢測(cè)方法

選取與目標(biāo)蛋白相結(jié)合的特異抗體對(duì)醫(yī)用供體豬組織、細(xì)胞水平進(jìn)行蛋白檢測(cè)。可采用蛋白免疫印

跡法、免疫組化/免疫熒光、醉聯(lián)免疫吸附技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)等方法進(jìn)行檢測(cè),建議根據(jù)不同生產(chǎn)工藝

選擇合適的檢測(cè)方法，蛋白免疫印跡法可作為基礎(chǔ)方法選用，蛋白免疫印跡法檢測(cè)及判定方法可參考

GB/T38477o蛋白免疫卬跡、免疫組化（熒光）、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)檢測(cè)示例見附錄BLEA29Y基因有效

性檢測(cè)方法基因表達(dá)鑒定部分。流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)檢測(cè)示例見附錄CGGTA1有效性檢測(cè)基因表達(dá)鑒定

部分。

5.1.2.2蛋白免疫印跡法結(jié)果判定

a）成像圖片本底干凈，能觀察到轉(zhuǎn)印膜均勻的輕微背景輪廓，目標(biāo)條帶清晰且不過曝，即可判定

目標(biāo)蛋白表達(dá)。

b）基因整合類應(yīng)有目標(biāo)基因蛋白表達(dá)，敲除類應(yīng)無目標(biāo)基因蛋白表達(dá)。

52遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)

5.2.1通用要求

醫(yī)用供體豬自然繁育進(jìn)行擴(kuò)大化培養(yǎng)時(shí)應(yīng)符合封閉群或近交系的育種方式，同時(shí)應(yīng)檢測(cè)基因遺傳

穩(wěn)定性。

5.2.2檢測(cè)方法

醫(yī)用供體豬群體每代個(gè)體均應(yīng)進(jìn)行基因型鑒定和基因表達(dá)檢測(cè)，方法見5.1,應(yīng)連續(xù)監(jiān)測(cè)3代以上。

5.2.3結(jié)果分析

醫(yī)用供體豬基因型鑒定及基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果符合基因分離定律和自由組合定律，則認(rèn)為具有遺傳

穩(wěn)定性。

53安全性評(píng)價(jià)

5.3.1染色體結(jié)構(gòu)變異和脫靶檢測(cè)

在基因修飾過程中，存在染色體結(jié)構(gòu)變異和基因修飾脫靶的風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)對(duì)原代個(gè)體進(jìn)行染色體結(jié)構(gòu)變

異和脫靶檢測(cè)，評(píng)價(jià)安全性。

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采集醫(yī)用供體豬基因修飾前后的血液或組織進(jìn)行高通量測(cè)序，獲取醫(yī)用供體豬基因組序列信息，進(jìn)

行生物信息學(xué)分析。樣本處理參照GB/T33681.1的要求執(zhí)行，測(cè)序方法參照GB/T30989進(jìn)行，測(cè)序質(zhì)量

控制參照GB/T35537執(zhí)行。

5.3.2結(jié)果分析

a)染色體結(jié)構(gòu)變異

基因修飾前后，除基因修飾位點(diǎn)外，染色體其他區(qū)域基因序列無差異，醫(yī)用供體豬基因組未發(fā)生非

預(yù)期基因片段插入、序列缺失、倒置、異位，則認(rèn)為在醫(yī)用供體豬制備過程中未引入基因安全風(fēng)險(xiǎn)。

b)脫靶檢測(cè)

使用Cas-OFFinder(CRISPRRGENTools(rgenome.net))或類似算法模型工具，在豬基因組參考

序列內(nèi)匹配脫靶風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)，允許sgRNA的靶標(biāo)序列存在1個(gè)?4個(gè)錯(cuò)配，醫(yī)用供體豬脫靶各風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)序列

信息和基因組參考序列一致，則認(rèn)為沒有脫靶，反之則存在脫靶風(fēng)險(xiǎn)。

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附錄A

（資料性）

醫(yī)用供體豬常見基因名及修飾類型

GGTA1

B4GALNT2/B4GALNT2L

基因敲除CMAH

PERV

SLAclassTorB2M

humanmembranecofactorproteintransgenic(hCD46-tg)

humandecay-acceleralingfactortransgenic(hOD55-tg)

humanmembraneinhibitorofreactivelysistransgenic(hCD59-tg)

humancomp1ement-regu1atoryproteinClinhibitortransgenic(hCl-INH-tg)

IlLA-E/humanbe:a2-microglobulintransgenic(HLA-E/B2M-tg)

humansignalregulatoryproteinalphatransgenic(hCD47-tg)

humanLEA29Ytransgenic(LE/\29Y-tg)

humanCTLA4-Igtransgenic(hCTI.A4Tg-tg)

porcineCTLA4-Igtransgenic(pCTLA4-Ig-tg)

基因整合

humandominant-negativemutantclassIItransactivatortransgenic(CIITA-DN-tg)

humanthrombomodulintransgenic(hTBM-tg)

humanendothelialproteinCreceptortransgenic(hEPCR-tg)

humantissuefactorpathwayinhibitortransgenic(hTFPI-tg)

humanectonucleosidetriphosphatediphosphohydro1ase-1transgenic(hCD39-tg)

humanecto-5'-nucleotidasetransgenic(hCD73-tg)

humantumournecrosisfactora-inducedprotein3(TNFAIP3)transgenic(A2C'-tg)

humanhaemeoxygenase1transgenic(hllMOXl-tg)

solublehumanTNFRI-Fctransgenic(shTNFRI-Fc-tg)

[來源：ReichartB,CcoperDKC,LanginM,TonjesRR,PiersonRN,Wo1fE.Cardiac

xenotransplantation:fromconcepttoclinic.CardiovescRes.2023Feb3;118(18):3499~3516.

doi:10.1093/cvr/cvacl80.PMID:36461918;PMCID:PMC9897693.]

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附錄B

（資料性）

LEA29Y基因整合有效性檢測(cè)方法

B.1LEA29Y基因型鑒定

B.1.1原理

以LEA29Y基因?yàn)榘形稽c(diǎn)，設(shè)計(jì)上下游引物，進(jìn)行PCR檢測(cè)。

B.1.2樣品準(zhǔn)備

B.1.2.1樣品種類

豬耳組織、血液等

B.1.2.2樣品采集

耳樣采集：在豬出生后盡快采集豬只耳樣，以便及時(shí)獲得新生豬基因型信息。采集耳樣前，采樣工

具及采樣部位做好消毒，使用耳標(biāo)鉗在豬耳朵上剪下耳組織，將耳組織放入1.5mL離心管中用于下一步

基因組提取。

血液采集：使用紫色采血管，采集豬全血3-5mL,采樣前將豬只保定好，行豬頸靜脈采血術(shù)。

B.1.2.3樣品處理

使用基因組DNA提取試劑盒（簡石生物，TD468）,提取樣品總DNA。用于下一步的PCR實(shí)驗(yàn)。

對(duì)于耳組織樣品，提取總）NA前應(yīng)對(duì)其進(jìn)行研磨處理，已獲得更高的濃度的基因組DNA。對(duì)于全血樣

本，應(yīng)首先進(jìn)行破紅處理，去除全血中無核的紅細(xì)胞后，提取白細(xì)胞總DNA,以提高基因組DNA質(zhì)量。

B.1.3PCR反應(yīng)

B.1.3.1引物設(shè)計(jì)

針對(duì)LEA29Y基因序列，使用引物設(shè)計(jì)軟件或者網(wǎng)站設(shè)計(jì)特異性引物。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)引物序列如下：

上游引物：5,-GTACCCACCGCCATACTACG-3,；下游引物：5,-GCGATGTCGCTGGGATAGAA-3,

上下游引物位置及擴(kuò)增片段序列如下：

^CGAGGGCATAGGCAACGGAACCCAGATTTATGTAATTGATCCAGAACCGTGCCC

AGATTCTGACCAGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCT

GGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGG

TCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGT

GGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTC

CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCC

AGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCC

CATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGC「（T3

ATCGC

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B.1.3.2PCR反應(yīng)體系和程序

表B.1PCR反應(yīng)體系

組分名稱組分用量

酶緩沖液KODBuffer2x10pL

上游引物0.5pL

下游引物0.5pL

酶KOD0.25pL

模板100ng-500ng

ddH2O添加到20HL

表B.2PCR反應(yīng)程序

步驟溫度時(shí)間循環(huán)

194℃2min1

298"C10s；60℃30s；68c30s；32

312℃81

按照表B.I配置PCR反應(yīng)體系，按照表B.2進(jìn)行PCR反應(yīng)程序。

B.1.3.3PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定

使用K的瓊脂糖，電壓120V,電泳15-20分鐘，在凝膠成像系統(tǒng)中檢測(cè)。

B.1.4結(jié)果判定

如果泳道中出現(xiàn)573bp的條帶，則說明PCR結(jié)果陽性，LEA29Y基因整合到了改豬基因組上。如圖B.1

所示，LEA29Y實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)573bp的條帶，而野生型對(duì)照組沒有出現(xiàn)573bp的條帶，說明LEA29Y在DN.A水平

上整合成功。

LEA29YGAPDH

778183WT778183WT

573bp7sgp

SOOt>p

圖B.1LEA29YPCR鑒定結(jié)果

B.2LEA29Y基因型表達(dá)鑒定

B.2.1原理

使用WesternBlot,免疫組化和免疫熒光等免疫學(xué)方法，利用LEA29Y蛋白與LEA29Y抗體的特異性結(jié)

合，檢測(cè)抗體酶標(biāo)物或標(biāo)記熒光來間接鑒定LEA29Y的表達(dá)。

B.2.2WesternBlot方法基因表達(dá)鑒定。

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B.2.2.1樣品準(zhǔn)備

取適量豬胰腺組織樣品，加入100ulRIPA裂解液，冰上裂解30min。獲得胰腺組織蛋與液。用BCA

蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)胰腺蛋白濃度。

B.2.2.2WesternBlot實(shí)驗(yàn)

按照如下步驟進(jìn)行WesternBlot實(shí)驗(yàn)：

(1)蛋白上樣量為30ug,5xSDSloadingbuffer蛋白變性上樣緩沖液為蛋白樣品體積的1/4,

100℃,lOmin使蛋白變性;

(2)制備SDS分離膠和濃縮膠；

(3)統(tǒng)一上樣30ug,將樣品加入SDS膠齒中。

(4)恒壓60v電泳45min,后120V電泳1.5h；

(5)PVDF膜用甲醇浸泡2min,ddH20浸泡3min,lxTransferBuffe浸泡30min,濾紙和海綿直接

置于lxTransferBuffe浸泡30min

(6)將海綿、濾紙、凝膠、PVDP膜按順序放好，恒流200A電泳1.5h。

(7)將膜取出于TBST緩沖液中清洗后，加入5席脫脂奶粉，室溫下?lián)u床上封閉2h:TBST緩沖液

漂洗三次，每次5川in;丁5%脫脂奶粉稀釋的一抗溶液(1:1000)中4代過夜；TBST緩沖液洗脫三次，每次

5min;加入TBST稀釋的二抗(1:1500)室溫?fù)u床孵育lh;T3ST緩沖液漂洗一次，每次5min。

(8)辣根過氧化物顯色液2ml于膜上，Tanon5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀顯影。

B.2.2.3結(jié)果判定

81肽腕WTttW

LEA29Y-

伊Actin-

圖B.2WesternBlot檢測(cè)結(jié)果示例圖

如圖B.2所示，如果實(shí)驗(yàn)組在預(yù)期蛋白大小的位置出現(xiàn)了明顯條帶，而野生型對(duì)照組在該位置無條

帶，則說明改豬LEA29Y基因成功表達(dá)。

B.2.3免疫組化和免疫熒光方法基因表達(dá)鑒定

B.2.3.1試劑

LEA29Y一抗，兔抗人IgG(Abeam,ab6759,USA)；胰島素一抗，鼠抗豬胰島素抗體(Abeam,ab7760,

USA)；山羊抗兔鼠通用二抗(DA-KO,Denmark)；羊抗兔IgG(FITC)(Abeam,ab6717,USA)：羊抗鼠IgG

(AlexaFluor?594)(Abeam,abl50160,USA)；OCT包埋劑(ElectronMicroscopySciences,USA)；；

B.2.3.2樣品準(zhǔn)備

將采集的轉(zhuǎn)基因豬的胰腺組織在OCT(ElectronMicroscopySciences,Hatfield,PA,USA)中包

埋并冷凍，并儲(chǔ)存在-70℃。用冰凍切片機(jī)作冷凍切片(6pi)用于免疫組化和免疫熒光染色。

B.2.3.3免疫組化實(shí)驗(yàn)

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(1)固定:取出切片，室溫放置5mins。用4%的多聚甲醛PBS溶液室溫固定15mins,PBS沖洗次(沖洗

可以采用側(cè)斜淋洗，也可至于平皿中搖晃).打孔：如果是需要染細(xì)胞內(nèi)的蛋白，用曲拉通(TritonX-

100)打孔：組織樣品浸于含0.25附1~近。浪-100的PBS中l(wèi)Omins,之后用PBS洗3次，每次5mins。如果

是染膜蛋白的，不需要曲拉通打孔。

(2)封閉:將組織置于含陶BSA的PBST溶液中30mins,封閉非特異性粘合的抗體。對(duì)于多聚甲醛固

定并進(jìn)行免疫熒光的樣本，在封閉緩沖液中加入03mol/L的甘氨酸。

(3)孵化:組織樣本浸于一抗(用含%BSA的PBST稀釋)，放于濕盒中，室溫lh或4c過夜用PBS洗3次

每次5mins。浸入二抗(1%BSA的PBST溶液)，室溫lh。PBS洗3次,每次5mins。

(4)染色:漫入0.ITug/mL的DAPI或Hoechst中，染色I(xiàn)min,PBS淋洗三次。

(5)封片:用蓋玻片封片，指甲油固定，保存與4或-20C。

B.2.3.4免疫熒光實(shí)驗(yàn)

(1)冰凍切片取出，室溫放置使其干燥后，用冷丙酮于4℃固定10分鐘：

(2)切片用0.01MPBS清洗后加入1.2%雙氧水作用30分鐘，以除去非特異染色；

(3)0.01MPBS清洗，洗3次每次10分鐘;

(4)0.3%TritonXT00作用30分鐘;

(5)加入以抗體稀釋液(含1%BSA的0.01MPBS,pH7.4)稀釋至作濃度的?抗，4過夜;

(6)0.01MPBS清洗,洗3次，每次10分鐘；

(7)加入熒光抗體IgG(AlexaFluor?594)(1:100)或FITC-IgG(l:100),室溫育2小時(shí)；

(8)0.01MPBS清洗,3次10分鐘;

(9)緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察

B.2.3.5結(jié)果判定

圖B.3免疫組化結(jié)果示例圖

如圖B.3所示，如果實(shí)驗(yàn)組視野中出現(xiàn)如圖所示結(jié)果，則判斷為LEA29Y基因表達(dá)鑒定免疫組化陽性。

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圖B.4免疫熒光結(jié)果示例圖

如圖B.4所示，如果實(shí)驗(yàn)組視野中出現(xiàn)如圖所示結(jié)果（LEA29Y標(biāo)記的是綠色熒光，胰島細(xì)胞標(biāo)記的

紅色熒光），則判斷為LEA29Y基因表達(dá)鑒定免疫熒光陽性。

B.2.4ELISA方法鑒定基因表達(dá)

B.2.4.1試劑耗材

10mL注射器，促凝采血管、1.5mL離心管、人淋巴毒性相關(guān)抗原4（CTLA4）ELISA檢測(cè)試劑盒

B.2.4.2樣品準(zhǔn)備

隨機(jī)挑選4頭LEA29Y轉(zhuǎn)基因豬（編號(hào)77、221、266、269）和月齡相近的5頭野生型豬，禁食16h,清

醒狀態(tài)下用10mL注射器從巴馬豬的前腔靜脈采集8磯全血。取6nli保存在促凝采血管內(nèi)，低速離心1（）

min后吸取上清分離血清，分裝到1.5ml離心管中，用于下一步ELISA實(shí)驗(yàn)

B.2.4.3ELISA實(shí)驗(yàn)步驟

檢測(cè)方法如下：

1）按說明書，倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，其稀釋后標(biāo)準(zhǔn)品終濃度依次為：lng/ml、0.5ng/ml、0.25ng/ml.

0.125ng/ml0.0625ng/ml、0ng/ml；

2）上樣：分設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔（依次加入稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品50uL,不加酶標(biāo)抗體、其余各環(huán)節(jié)同待測(cè)樣品

孔）、空白孔（不加樣品、酶標(biāo)抗體、酶標(biāo)試劑，其余各環(huán)節(jié)同待測(cè)樣品孔）、待測(cè)樣品孔。向待測(cè)樣

品孔內(nèi)加入待測(cè)血清（4頭轉(zhuǎn)基因豬血清及5頭野生型豬血清）樣品40UL,再加10uLCTLA4酶標(biāo)抗體。

上樣時(shí)避免觸及孔壁，輕搖混勻。

3）溫育：封板膜封好微孔板，在恒溫箱內(nèi)37c溫育0.訃。

4）洗滌：揭掉封板膜，棄掉液體，甩十，加入洗滌液，靜止30s棄掉液體，重復(fù)5次，拍十。

5）加前：每孔加入酶標(biāo)試劑50UL,空白孔除外。

6）溫育：操作同3）。

7）洗滌：操作同4）。

8）顯色：向孔內(nèi)先后加入顯色試劑A和B各50UL,輕輕震蕩混勻，37c避光

9）終止：每孔加入50uL終止液，終止反應(yīng)。

10）測(cè)定：用空白孔校0,450nm波長依次測(cè)量各孔的0D值

B.2./I.4檢測(cè)結(jié)果計(jì)算

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根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，0D值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，由樣品的0D值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)

濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線及兩種豬檢測(cè)結(jié)果如圖B.5所示，結(jié)果顯示用ELISA對(duì)采集血樣檢測(cè)，在胰島特異表達(dá)

LEA29Y轉(zhuǎn)基因豬和野生型豬血液內(nèi)均檢測(cè)到LEA29Y,但轉(zhuǎn)基因豬中檢測(cè)到的值高于野生型豬，差異顯著

UAVI

圖B.5ELISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線及豬血清樣品檢測(cè)結(jié)果

11

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附錄C

（資料性）

GGTA1基因敲除及表達(dá)有效性檢測(cè)方法

C.1GGTA1基因型鑒定

C.1.1原埋

以GGTA1基因?yàn)榘行蛄?，建立PCR檢測(cè)方法,并結(jié)合PCR產(chǎn)物sanger測(cè)序結(jié)果，判斷GGTA1基因敲除類

型。

C.1.2樣品準(zhǔn)備

C.1.2.1樣品種類

豬耳組織、血液等

C.1.2.2樣品采集

耳樣采集：在豬出生后盡快采集豬只耳樣，以便及時(shí)獲得新生豬基因型信息。采集耳樣前，采樣工

具及采樣部位做好消毒，使用耳標(biāo)鉗在豬耳朵上剪下耳組織，將耳組織放入1.5mL離心管中用于下一步

基因組提取。

血液采集：使用紫色采血管，采集豬全血3-5mL,采樣前將豬只保定好，行豬頸靜脈采血術(shù)。

C.1.2.3樣品處理

使用基因組DNA提取試劑盒（簡石生物，TD468）,提取樣品總DNA。用于下一步的PCR實(shí)驗(yàn)。

對(duì)于耳組織樣品，提取總）NA前應(yīng)對(duì)其進(jìn)行研磨處理，已獲得更高的濃度的基因組DNA。對(duì)于全血樣

木，應(yīng)首先進(jìn)行破紅處理，去除全血中無核的紅細(xì)胞后，提取向細(xì)胞總DNA,以提高基因組DNA質(zhì)量。

C.1.3PCR反應(yīng)

C.1.3.1引物設(shè)計(jì)

針對(duì)GGTA1基因編輯位點(diǎn)序列，使用引物設(shè)計(jì)軟件或者網(wǎng)站設(shè)計(jì)特異性引物。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)引物序列

如下：

上游引物：5,-AGGGACAGTAGACCTAGGAAAC-3,：下游引物：5,-GATCCTAATTGGGTTTGCTGCC-3,

引物在GGTA1基因所在的位置如圖B.6所示。

AGGGACAGTAGACCTAGGMA（GGATGCTTCCTCTAGTCTGTGATGCGAGGTGGGGCATCTGAGTTGGGGGCGGCTGGAGCCCTT

AGGGACCATTAACT^CCCGTCACTCTCCCACATCTCGGTGGACCTTGGGATCAGTCAGGATGCTTCCCCTTTGAGCCTC.^ATGGC

CTTAGTATCCTTCCCMCCCAGACGGCCCTGTCAGTTCATTGACTTGGCTAATTTGCCAGTGTAGGCCTATGCA.UTTMGGTAG.^ACG

CACTCCTTAGCGCTCGTTGACTATTCATCAACTTTTCCTTTTAG.^UGATATTGGTATAAGCACTTCTTA.^UCCArATTCCACTC

TGGGTGTATTTAATCTAATTTTCCCTTCTCCTTTTCTTTTCCCAGGAGA.AAATMTGAATGTC.UAGGAAGAGTGGTTCTGTCMTGCT

GCTTGTCTCAACTGTMTGGTTGTGTTTTGGGAATACATCAACAGGTAATTATGA.^ACATGATG.AAATGATGTTGATGMAGTCTCCTC

TA.ATCTCCTAGTTATCAGCCAAGTCACCAGCTTGCATT.AAAAGTAGGATTCACTGACACCGTA.4AGAAAGCATTCCAGAGAGTTGCCGT

TGTGGCTCAGGGGCAGCAAACCCAATTAGGATC-

圖B.6GGTA1編輯位點(diǎn)處基因序列

12

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C.1.3.2PCR反應(yīng)體系和程序

表B.3PCR反應(yīng)體系

組分名稱組分用量

酶緩沖液KODBuffer2x10pL

上游引物().5pL

下游引物().5RL

酶KOD0.25pL

模板100ng-500ng

ddH2O添加到20HL

表B.4PCR反應(yīng)程序

步驟溫度時(shí)間循環(huán)

194℃2min1

98,C10s；

260℃30s；32

68℃30s；

312℃81

按照表B.3配置PCR反應(yīng)體系，按照表B.4進(jìn)行PCR反應(yīng)程序。

C.1.3.3PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定

使用K的瓊脂糖，電壓120V,電泳15-20分鐘，在凝膠成像系統(tǒng)中檢測(cè)。

C.1.3.4PCR產(chǎn)物sanger測(cè)序

對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行sanger測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GGTA1編輯位點(diǎn)處的參考序列比對(duì)，判斷GGTA1基因是否敲

除及具體的敲除類型。

C.1.4結(jié)果判定

如果泳道中出現(xiàn)652bp的條。且目標(biāo)片段測(cè)序結(jié)果和參考序列比對(duì)，靶位產(chǎn)生不為3的倍數(shù)堿基的插

入和缺失，則判定基因敲除有效。示例結(jié)果如圖B.7所示，結(jié)果顯示其在編輯位點(diǎn)處有Ibp的缺失，產(chǎn)生

移碼突變，證明GGTA1基因在些因?qū)用媲贸晒Α?/p>

行生理堵—GTTCTGTCAATGCTGCTTGTCTCAACTGTAATGGTTGTGTTTTGGGAATACATCAACA*

618旗基

己比對(duì)14..61S

X景U/插入子

GTKO豬訓(xùn)序結(jié)果?GTTCTGTCAATGCTGCTTGTCTCAQDTGTAATGGTTGTGTTTTGGGAATACATCAACAL

904?；葙|(zhì)ii：

對(duì)

E

U

26025024023022021C

圖B.7GGTA1編輯位點(diǎn)處測(cè)序結(jié)果

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C.2GGTA1基因表達(dá)鑒定

C.2.1原理

GGTA1基因是體內(nèi)合成a-gal抗原的關(guān)鍵陋，敲除GGTA1基因后，a-gal抗原表達(dá)量顯著下降，因此

可以使用流式細(xì)胞術(shù)，通過標(biāo)記a-gal抗原，檢測(cè)PBMC中a-gal抗原表達(dá)量，來反映GGTA1的表達(dá)情況。

C.2.2試劑

PBMC分離液,BS-IB4

C.2.3樣品采集

使用紫色采血管采集豬全血，

C.2.4流式細(xì)胞術(shù)

使用PBMC分離液分離豬外周血淋巴細(xì)胞（PBMC）,經(jīng)BS-IB4孵育，通過流式細(xì)胞儀完成豬a-gal的

檢測(cè)。

C.2.4.1結(jié)果判定

如圖B.8所示GTKO豬167、3076、3175的PBUC標(biāo)記的熒光強(qiáng)度顯著低于野生型豬，因此可判定GTK0豬

167、3076、3175無a-gal抗原,說明GGTA1基因不表達(dá),敲除成功。

SampleH?mc

供”1?3076

AGAL.107les

nc

o

Q

圖B.8a-gaI抗原流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果

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參考文獻(xiàn)

[1]《基因修飾細(xì)胞治療產(chǎn)品非臨床研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》

[2]《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)管理辦法》

[3]ISO5058:1-2021Biotcchnology-Gcnom