DLK1和Jagged1在肝癌中的表達(dá)特征、關(guān)聯(lián)機(jī)制及臨床價值研究

DLK1和Jagged1在肝癌中的表達(dá)特征、關(guān)聯(lián)機(jī)制及臨床價值研究一、引言1.1研究背景與意義肝癌，作為全球范圍內(nèi)常見且危害嚴(yán)重的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥數(shù)據(jù)顯示，肝癌的新發(fā)病例數(shù)高達(dá)90.6萬例，死亡病例數(shù)約83萬例，在癌癥相關(guān)死亡原因中位居第三。在中國，肝癌的發(fā)病形勢更為嚴(yán)峻，新發(fā)病例和死亡病例分別占全球的45.3%和47.1%，接近全球的一半，且年齡標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病率和死亡率也處于世界前列。肝癌具有惡性程度高、病情進(jìn)展迅速、預(yù)后差等特點(diǎn)，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，5年生存率僅為14.1%，遠(yuǎn)低于歐美國家。這主要?dú)w因于肝癌早期癥狀隱匿，缺乏特異性表現(xiàn)，患者往往難以察覺，一旦出現(xiàn)明顯癥狀就醫(yī)時，病情多已進(jìn)展至中晚期，錯失了最佳的手術(shù)治療時機(jī)。此外，肝癌的復(fù)發(fā)率較高，即使接受了手術(shù)切除等治療，仍有相當(dāng)比例的患者會出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步降低了患者的生存幾率。因此，深入探究肝癌的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的診斷和治療靶點(diǎn)，對于提高肝癌患者的生存率和生活質(zhì)量具有至關(guān)重要的意義。在肝癌的研究領(lǐng)域中，Delta樣蛋白1（DLK1）和鋸齒狀蛋白1（Jagged1）逐漸成為關(guān)注的焦點(diǎn)。DLK1，又被稱為胎兒抗原2（FA2）或鋅指蛋白148（ZFP148），是一種跨膜蛋白，屬于表皮生長因子（EGF）家族成員。它在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。研究表明，DLK1在多種腫瘤組織中異常表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在肝癌組織中，DLK1呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，且其表達(dá)水平與肝癌的惡性程度、轉(zhuǎn)移潛能以及患者的預(yù)后密切相關(guān)。例如，有研究發(fā)現(xiàn)，DLK1高表達(dá)的肝癌患者，其腫瘤體積更大、分化程度更低、更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，且術(shù)后復(fù)發(fā)率更高，生存時間更短。此外，DLK1還可以通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子和信號通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。因此，DLK1有望成為肝癌診斷和治療的潛在靶點(diǎn)。Jagged1是Notch信號通路的重要配體之一，在細(xì)胞的命運(yùn)決定、分化、增殖和凋亡等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。Notch信號通路是一條高度保守的細(xì)胞間信號傳導(dǎo)通路，在胚胎發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)維持和疾病發(fā)生發(fā)展等過程中都具有不可或缺的作用。當(dāng)Jagged1與Notch受體結(jié)合后，會激活Notch信號通路，引發(fā)一系列的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，從而影響細(xì)胞的生物學(xué)行為。在肝癌中，Jagged1的表達(dá)異常升高，并且與肝癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。研究顯示，Jagged1高表達(dá)的肝癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力、遷移能力和侵襲能力，同時，Jagged1還可以通過激活Notch信號通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能。此外，Jagged1的表達(dá)水平還與肝癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，高表達(dá)Jagged1的肝癌患者預(yù)后較差。因此，深入研究Jagged1在肝癌中的作用機(jī)制，對于揭示肝癌的發(fā)病機(jī)制和尋找新的治療靶點(diǎn)具有重要的意義。DLK1和Jagged1在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中都扮演著重要角色，且兩者之間可能存在著某種關(guān)聯(lián)，共同參與調(diào)控肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。然而，目前關(guān)于DLK1和Jagged1在肝癌中的表達(dá)情況、相互關(guān)系以及它們與肝癌臨床病理特征之間的具體聯(lián)系，尚未完全明確。因此，本研究旨在通過檢測DLK1和Jagged1在肝癌組織及癌旁組織中的表達(dá)水平，分析它們與肝癌臨床病理特征的相關(guān)性，探討它們在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及機(jī)制，為肝癌的早期診斷、預(yù)后評估和靶向治療提供理論依據(jù)和新的思路。1.2研究目的本研究旨在通過檢測DLK1和Jagged1在肝癌組織及癌旁組織中的表達(dá)水平，深入分析它們與肝癌患者臨床病理特征（如腫瘤大小、分化程度、轉(zhuǎn)移情況、患者年齡、HBsAg感染狀態(tài)等）之間的相關(guān)性，探討二者在肝癌發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中的具體作用及內(nèi)在機(jī)制。同時，明確DLK1和Jagged1表達(dá)之間的相互關(guān)系，評估它們作為肝癌早期診斷生物標(biāo)志物以及潛在治療靶點(diǎn)的可行性，為肝癌的臨床診斷、預(yù)后判斷和靶向治療提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)和全新的思路，最終改善肝癌患者的治療效果和生存質(zhì)量。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在肝癌研究領(lǐng)域，DLK1和Jagged1均受到了廣泛關(guān)注，國內(nèi)外學(xué)者從多個角度對其展開研究，取得了一定成果，但仍存在一些尚未明確的問題。DLK1作為一種在胚胎發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用的跨膜蛋白，其在肝癌中的研究取得了諸多進(jìn)展。國內(nèi)方面，上海交通大學(xué)系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究院韓澤廣研究員團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，DLK1在肝細(xì)胞癌（HCC）組織中特異性高表達(dá)，而在正常成人組織中不表達(dá)?；诖?，他們自制抗人DLK1單克隆抗體并獲取單鏈片段可變（scFv）序列，整合到第二代CAR慢病毒載體中，獲得靶向DLK1的CAR-T細(xì)胞。動物實(shí)驗(yàn)表明，該細(xì)胞能夠明顯抑制人類肝癌細(xì)胞系HepG2或Huh-7的皮下和腹膜移植瘤生長，且未見明顯副作用，為肝癌的免疫治療提供了新的策略。國家人類基因組南方研究中心的專家通過對肝癌樣本的檢測發(fā)現(xiàn)，人類印跡基因DLK1在肝癌組織中表達(dá)明顯上調(diào)，在73.2%的肝癌樣本中DLK1基因表達(dá)上升，且該基因與甲胎蛋白聯(lián)合檢測可將肝癌診斷率提高25%以上，提示其可能成為新的肝癌診斷指標(biāo)。國外研究也指出，DLK1在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中，可通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子和信號通路，如PI3K/AKT、MAPK等，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。有研究表明，敲低DLK1表達(dá)可顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡，并且在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中抑制腫瘤生長。然而，目前對于DLK1在肝癌中的具體作用機(jī)制尚未完全明晰，其與肝癌其他相關(guān)分子的相互作用網(wǎng)絡(luò)也有待進(jìn)一步深入研究。Jagged1作為Notch信號通路的重要配體，在肝癌研究中也備受關(guān)注。國內(nèi)有研究采用免疫組化SP法和原位雜交的方法檢測發(fā)現(xiàn)，Jagged1蛋白和mRNA在肝細(xì)胞癌組織中的陽性表達(dá)率顯著高于肝硬化和正常肝組織。其表達(dá)與年齡、組織學(xué)分級及HBsAg有關(guān)。通過實(shí)時熒光定量PCR法和免疫組織化學(xué)染色法檢測發(fā)現(xiàn)，Jagged1在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常肝組織，且與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級密切相關(guān)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者和低分化癌組織中Jagged1陽性表達(dá)率更高。國外研究發(fā)現(xiàn)，Jagged1可通過激活Notch信號通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，使肝癌細(xì)胞獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。此外，Jagged1還參與調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的干性維持，與肝癌的耐藥性也存在一定關(guān)聯(lián)。但是，Jagged1在肝癌中如何精準(zhǔn)調(diào)控相關(guān)信號通路以及其在肝癌不同亞型中的表達(dá)差異和功能特點(diǎn)等方面，還需要更多的研究來明確。雖然DLK1和Jagged1在肝癌中的研究各自取得了一定成果，但關(guān)于兩者在肝癌中的聯(lián)合研究相對較少。目前尚不清楚它們在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中是否存在協(xié)同作用以及具體的作用機(jī)制。兩者表達(dá)之間的相互關(guān)系以及它們與肝癌臨床病理特征之間更為深入的聯(lián)系，也需要進(jìn)一步通過大樣本、多中心的研究來揭示。此外，如何將DLK1和Jagged1的研究成果轉(zhuǎn)化為臨床實(shí)踐中的有效診斷和治療手段，也是未來肝癌研究領(lǐng)域需要重點(diǎn)關(guān)注和解決的問題。二、DLK1和Jagged1的生物學(xué)特性2.1DLK1的結(jié)構(gòu)與功能2.1.1DLK1的分子結(jié)構(gòu)DLK1，全稱Delta樣蛋白1（Delta-like1homolog），作為一種重要的跨膜蛋白，其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)賦予了它在細(xì)胞生理過程中獨(dú)特的功能。從分子構(gòu)成來看，DLK1由多個結(jié)構(gòu)域組成，這些結(jié)構(gòu)域協(xié)同作用，使其能夠在細(xì)胞信號傳導(dǎo)、細(xì)胞間相互作用等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。DLK1的胞外區(qū)包含多個串聯(lián)排列的表皮生長因子（EGF）樣重復(fù)序列。這些EGF樣結(jié)構(gòu)域在蛋白質(zhì)相互作用中扮演著至關(guān)重要的角色，它們可以與其他細(xì)胞表面的受體或配體特異性結(jié)合，從而啟動細(xì)胞內(nèi)的信號級聯(lián)反應(yīng)。以肝細(xì)胞癌的研究為例，DLK1的EGF樣結(jié)構(gòu)域可能與肝癌細(xì)胞表面的某些受體結(jié)合，激活下游的PI3K/AKT、MAPK等信號通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。此外，這些結(jié)構(gòu)域還可能參與細(xì)胞間的黏附過程，影響細(xì)胞的聚集和組織的形成。研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎發(fā)育過程中，DLK1的EGF樣結(jié)構(gòu)域?qū)τ诩?xì)胞間的識別和黏附起到了重要作用，有助于構(gòu)建組織和器官的正常結(jié)構(gòu)。除了EGF樣重復(fù)序列外，DLK1還具有其他重要的結(jié)構(gòu)特征。其跨膜區(qū)負(fù)責(zé)將蛋白錨定在細(xì)胞膜上，確保DLK1能夠在細(xì)胞表面發(fā)揮功能?？缒^(qū)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性對于DLK1與配體的結(jié)合以及信號傳導(dǎo)的效率具有重要影響。而胞內(nèi)區(qū)則包含一些特定的氨基酸序列，這些序列可以與細(xì)胞內(nèi)的信號分子相互作用，將細(xì)胞外的信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)部。在某些腫瘤細(xì)胞中，DLK1的胞內(nèi)區(qū)可以與一些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。2.1.2DLK1在正常生理過程中的功能在正常生理過程中，DLK1發(fā)揮著不可或缺的作用，尤其是在肝臟發(fā)育以及細(xì)胞分化等關(guān)鍵環(huán)節(jié)。肝臟發(fā)育是一個復(fù)雜而有序的過程，DLK1在其中扮演著重要角色。在胚胎發(fā)育早期，DLK1在肝臟祖細(xì)胞中高表達(dá)，它參與調(diào)控肝臟祖細(xì)胞的增殖和分化，引導(dǎo)這些細(xì)胞向肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞的方向分化。研究表明，在小鼠胚胎肝臟發(fā)育過程中，敲低DLK1的表達(dá)會導(dǎo)致肝臟祖細(xì)胞的增殖受到抑制，肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞的分化也會出現(xiàn)異常，最終影響肝臟的正常發(fā)育。這說明DLK1對于維持肝臟祖細(xì)胞的活性以及促進(jìn)肝臟細(xì)胞的分化具有重要意義。在細(xì)胞分化方面，DLK1同樣發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它可以作為一種細(xì)胞命運(yùn)決定因子，影響細(xì)胞的分化方向。以脂肪細(xì)胞分化為例，DLK1在脂肪前體細(xì)胞中表達(dá)，它能夠抑制脂肪前體細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞的分化。研究發(fā)現(xiàn)，在脂肪細(xì)胞分化過程中，DLK1可以通過與胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白1（IGFBP1）相互作用，調(diào)節(jié)胰島素樣生長因子（IGF）的活性，從而抑制脂肪細(xì)胞的分化。當(dāng)DLK1的表達(dá)被下調(diào)時，脂肪前體細(xì)胞會更容易分化為成熟脂肪細(xì)胞，這表明DLK1在脂肪細(xì)胞分化過程中起到了負(fù)調(diào)控的作用。DLK1在正常生理過程中的功能不僅局限于肝臟發(fā)育和細(xì)胞分化，還可能參與其他重要的生理過程，如組織修復(fù)和再生等。在肝臟受到損傷時，DLK1的表達(dá)會發(fā)生變化，它可能參與調(diào)節(jié)肝臟細(xì)胞的再生和修復(fù)過程，促進(jìn)受損肝臟組織的恢復(fù)。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步表明了DLK1在維持機(jī)體正常生理功能方面的重要性，也為理解其在肝癌等疾病中的異常作用提供了基礎(chǔ)。2.2Jagged1的結(jié)構(gòu)與功能2.2.1Jagged1的分子結(jié)構(gòu)Jagged1作為Notch信號通路的關(guān)鍵配體，其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)是其發(fā)揮生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。從分子層面來看，Jagged1是一種跨膜蛋白，由多個重要的結(jié)構(gòu)域組成。其胞外區(qū)是與Notch受體相互作用的關(guān)鍵區(qū)域，包含多個串聯(lián)排列的表皮生長因子（EGF）樣重復(fù)序列。這些EGF樣結(jié)構(gòu)域在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中起著核心作用，它們能夠特異性地與Notch受體上的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而啟動Notch信號通路的激活。研究表明，Jagged1的EGF樣結(jié)構(gòu)域中的某些氨基酸殘基對于其與Notch受體的高親和力結(jié)合至關(guān)重要。在肝癌細(xì)胞中，當(dāng)Jagged1的EGF樣結(jié)構(gòu)域與Notch受體結(jié)合后，會引發(fā)一系列的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，如激活下游的HES、HEY等轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)行為。此外，Jagged1的胞外區(qū)還含有一個富含半胱氨酸的DSL（Delta/Serrate/Lag-2）結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域在與Notch受體的識別和結(jié)合過程中也發(fā)揮著不可或缺的作用。DSL結(jié)構(gòu)域中的半胱氨酸殘基能夠形成特定的空間構(gòu)象，增強(qiáng)Jagged1與Notch受體之間的相互作用穩(wěn)定性。跨膜區(qū)則將Jagged1錨定在細(xì)胞膜上，確保其能夠在細(xì)胞表面與Notch受體進(jìn)行有效的接觸和結(jié)合。跨膜區(qū)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定了Jagged1在細(xì)胞膜上的定位和取向，對于其信號傳遞功能具有重要影響。研究發(fā)現(xiàn)，跨膜區(qū)的某些突變可能會導(dǎo)致Jagged1在細(xì)胞膜上的定位異常，從而影響其與Notch受體的結(jié)合能力，進(jìn)而干擾Notch信號通路的正常激活。而胞內(nèi)區(qū)雖然相對較短，但也包含一些特定的氨基酸序列，這些序列可以與細(xì)胞內(nèi)的其他信號分子相互作用，將Notch信號進(jìn)一步傳遞到細(xì)胞內(nèi)部。在某些細(xì)胞類型中，Jagged1的胞內(nèi)區(qū)可以與一些銜接蛋白結(jié)合，通過這些銜接蛋白招募其他信號分子，形成復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物，進(jìn)一步放大和調(diào)節(jié)Notch信號。在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中，Jagged1胞內(nèi)區(qū)與其他信號分子的相互作用可能參與調(diào)控肝癌細(xì)胞的干性維持、耐藥性等重要生物學(xué)過程。2.2.2Jagged1在正常生理過程中的功能在正常生理狀態(tài)下，Jagged1在細(xì)胞分化、組織穩(wěn)態(tài)維持以及器官發(fā)育等多個關(guān)鍵過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用。在細(xì)胞分化方面，Jagged1參與調(diào)控多種細(xì)胞類型的分化進(jìn)程。以神經(jīng)細(xì)胞分化為例，在胚胎神經(jīng)發(fā)育過程中，Jagged1在神經(jīng)干細(xì)胞和祖細(xì)胞中表達(dá)，通過與Notch受體相互作用，調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化方向。研究表明，當(dāng)Jagged1-Notch信號通路被激活時，會抑制神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元的分化，促進(jìn)其向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化。在視網(wǎng)膜發(fā)育過程中，Jagged1也參與調(diào)控視網(wǎng)膜祖細(xì)胞向不同類型視網(wǎng)膜細(xì)胞的分化，對視網(wǎng)膜的正常結(jié)構(gòu)和功能形成至關(guān)重要。在組織穩(wěn)態(tài)維持方面，Jagged1同樣發(fā)揮著不可或缺的作用。在皮膚組織中，Jagged1在表皮干細(xì)胞和基底細(xì)胞中表達(dá)，通過與Notch受體的相互作用，調(diào)節(jié)表皮細(xì)胞的增殖和分化平衡，維持皮膚的正常結(jié)構(gòu)和功能。當(dāng)Jagged1-Notch信號通路異常時，可能導(dǎo)致表皮細(xì)胞過度增殖或分化異常，引發(fā)皮膚疾病。在腸道組織中，Jagged1參與調(diào)節(jié)腸道干細(xì)胞的自我更新和分化，維持腸道上皮的完整性和功能。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠腸道損傷模型中，Jagged1的表達(dá)會發(fā)生變化，通過激活Notch信號通路，促進(jìn)腸道干細(xì)胞的增殖和分化，加速腸道損傷的修復(fù)。在器官發(fā)育過程中，Jagged1也扮演著重要角色。在心臟發(fā)育過程中，Jagged1在心臟祖細(xì)胞和心肌細(xì)胞中表達(dá)，參與調(diào)控心臟的形態(tài)發(fā)生和心肌細(xì)胞的分化。研究表明，Jagged1-Notch信號通路對于心臟瓣膜的形成和發(fā)育至關(guān)重要，該信號通路的異?？赡軐?dǎo)致心臟瓣膜發(fā)育異常，引發(fā)先天性心臟病。在肺發(fā)育過程中，Jagged1參與調(diào)節(jié)肺上皮細(xì)胞的分化和肺泡的形成，對肺的正常功能發(fā)育起著關(guān)鍵作用。Jagged1在正常生理過程中的這些重要功能，為理解其在肝癌等疾病中的異常作用提供了重要的基礎(chǔ)。當(dāng)Jagged1的表達(dá)或功能出現(xiàn)異常時，可能會打破正常生理過程中的平衡，導(dǎo)致細(xì)胞生物學(xué)行為的改變，進(jìn)而參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程。2.3DLK1和Jagged1相關(guān)信號通路2.3.1DLK1相關(guān)信號通路DLK1在細(xì)胞生理和病理過程中參與多條重要的信號通路，對細(xì)胞的增殖、分化等行為產(chǎn)生關(guān)鍵影響，尤其是在肝癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中，其相關(guān)信號通路的異常激活或抑制與肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。在細(xì)胞增殖調(diào)控方面，DLK1與PI3K/AKT信號通路存在緊密聯(lián)系。研究表明，在肝癌細(xì)胞中，DLK1的高表達(dá)可以激活PI3K/AKT信號通路。具體來說，DLK1可能通過其胞外區(qū)的EGF樣結(jié)構(gòu)域與肝癌細(xì)胞膜表面的特定受體結(jié)合，進(jìn)而激活受體酪氨酸激酶，使PI3K的p85亞基與受體結(jié)合并被激活，激活后的PI3K催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，能夠招募并激活A(yù)KT蛋白，使其磷酸化水平升高。磷酸化的AKT可以進(jìn)一步激活下游的mTOR等蛋白，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖。例如，在對肝癌細(xì)胞系HepG2和Huh-7的研究中發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)DLK1能夠顯著增加細(xì)胞的增殖能力，同時伴隨著PI3K/AKT信號通路中關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平升高；而敲低DLK1的表達(dá)則會抑制細(xì)胞增殖，降低AKT的磷酸化水平。這表明DLK1通過激活PI3K/AKT信號通路，在肝癌細(xì)胞的增殖過程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用。DLK1還參與調(diào)控MAPK信號通路。在肝癌細(xì)胞中，DLK1可以通過激活Ras蛋白，啟動MAPK信號級聯(lián)反應(yīng)。當(dāng)DLK1與細(xì)胞表面的相關(guān)受體結(jié)合后，會導(dǎo)致Ras蛋白與鳥苷酸交換因子（GEF）結(jié)合，使Ras蛋白從無活性的GDP結(jié)合狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘腉TP結(jié)合狀態(tài)。激活的Ras蛋白進(jìn)一步激活Raf蛋白，Raf蛋白磷酸化并激活MEK蛋白，MEK蛋白再磷酸化并激活ERK蛋白。激活后的ERK蛋白可以進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)一系列與細(xì)胞增殖、分化和存活相關(guān)的基因表達(dá)。研究顯示，在肝癌組織中，DLK1的表達(dá)水平與MAPK信號通路中ERK蛋白的磷酸化水平呈正相關(guān)。敲低DLK1的表達(dá)會抑制MAPK信號通路的激活，減少ERK蛋白的磷酸化，從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移能力。這說明DLK1通過激活MAPK信號通路，參與調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖和遷移過程。在細(xì)胞分化調(diào)控方面，DLK1在肝癌細(xì)胞中的異常表達(dá)會干擾正常的細(xì)胞分化程序。正常情況下，細(xì)胞的分化受到多種信號通路的精確調(diào)控，而DLK1的異常高表達(dá)可能會打破這種平衡。研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞中，DLK1可以通過抑制Wnt/β-catenin信號通路來影響細(xì)胞的分化。在正常細(xì)胞中，Wnt信號通路的激活會導(dǎo)致β-catenin蛋白在細(xì)胞質(zhì)中積累，并進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，促進(jìn)與細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)。然而，當(dāng)DLK1高表達(dá)時，它可能會與Wnt信號通路中的某些關(guān)鍵分子相互作用，抑制β-catenin蛋白的核轉(zhuǎn)位，從而抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活。例如，有研究表明，在肝癌細(xì)胞系中，過表達(dá)DLK1會降低β-catenin蛋白在細(xì)胞核中的含量，抑制Wnt/β-catenin信號通路下游基因的表達(dá)，導(dǎo)致肝癌細(xì)胞的分化受阻，細(xì)胞呈現(xiàn)出更強(qiáng)的惡性表型。這表明DLK1通過抑制Wnt/β-catenin信號通路，在肝癌細(xì)胞的分化調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，其異常表達(dá)可能導(dǎo)致肝癌細(xì)胞的分化異常，促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展。2.3.2Jagged1相關(guān)信號通路（Notch信號通路）Jagged1作為Notch信號通路的關(guān)鍵配體，在細(xì)胞命運(yùn)決定、分化、增殖和凋亡等過程中發(fā)揮著核心調(diào)控作用，尤其是在肝癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中，Notch信號通路的異常激活與肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。Notch信號通路是一條高度保守的細(xì)胞間信號傳導(dǎo)通路，其基本組成包括Notch受體、Notch配體（如Jagged1、Delta-like等）、CSL（CBF-1，Suppressorofhairless，Lag的合稱）DNA結(jié)合蛋白、其他的效應(yīng)物和Notch的調(diào)節(jié)分子等。哺乳動物中存在4種Notch受體（Notch1-4）和5種Notch配體（Delta-like1,3,4，Jagged1和Jagged2）。Notch信號的活化過程較為復(fù)雜，涉及多次蛋白裂解。當(dāng)Jagged1與相鄰細(xì)胞表面的Notch受體結(jié)合后，會引發(fā)Notch蛋白的一系列裂解事件。首先，在Notch成熟過程中，在高爾基體內(nèi)furin樣轉(zhuǎn)化酶的作用下，Notch在胞外區(qū)1654位精氨酸殘基-1655位替氨醢殘基之間（S1位點(diǎn)）發(fā)生裂解，產(chǎn)生胞外區(qū)（NEC）和跨膜片段（NTM）2個亞基，二者以二硫鍵連接形成異二聚體形式的Notch受體，定位于細(xì)胞膜表面。接著，當(dāng)Jagged1與Notch受體結(jié)合后，在金屬蛋白酶（ML）/腫瘤壞死因子-a轉(zhuǎn)換酶（TACE）作用下，Notch在胞外近膜區(qū)1710丙氨酸-1711纈氨酸殘基之間（S2位點(diǎn)）裂解為2個片段，N端裂解產(chǎn)物（胞外區(qū)）被配體表達(dá)細(xì)胞吞噬，而C端裂解產(chǎn)物進(jìn)一步在跨膜區(qū)的1743甘氨酸殘基-1744纈氨酸殘基之間（S3位點(diǎn)）經(jīng)高分子量多蛋白聯(lián)合體（其中主要包括γ-分泌酶，突變型早老素和各種的輔因子）裂解，釋放出Notch蛋白的活化形式NICD（ICN）?；罨蟮腘ICD會進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子CSL結(jié)合，形成NICD/CSL轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體。在沒有NICD存在時，CSL蛋白（在哺乳動物中叫RBP-JK，是轉(zhuǎn)錄抑制因子）能通過募集阻遏蛋白SMRT和組蛋白脫乙酰酶（HDAC）抑制基因轉(zhuǎn)錄。而當(dāng)NICD與CSL結(jié)合后，會置換SMRT輔阻礙物和與之結(jié)合的HDAC酶，從而解除轉(zhuǎn)錄抑制，激活HES、HEY、HERP等堿性-螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）轉(zhuǎn)錄抑制因子家族的靶基因，發(fā)揮生物學(xué)作用。在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中，Jagged1/Notch信號通路的異常激活對肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生重要影響。研究表明，在肝癌組織中，Jagged1和Notch受體的表達(dá)水平通常顯著升高。高表達(dá)的Jagged1與Notch受體結(jié)合，持續(xù)激活Notch信號通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。具體來說，激活的Notch信號通路可以上調(diào)HES1、HEY1等靶基因的表達(dá)。HES1可以抑制細(xì)胞周期抑制因子p21的表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。同時，Notch信號通路還可以通過調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的EMT過程。例如，激活的Notch信號通路可以上調(diào)Snail、Slug等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，這些轉(zhuǎn)錄因子可以抑制上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，上調(diào)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin、N-cadherin等的表達(dá)，使肝癌細(xì)胞獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。此外，Jagged1/Notch信號通路還與肝癌細(xì)胞的干性維持、耐藥性等密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌干細(xì)胞中，Jagged1/Notch信號通路處于高度激活狀態(tài)，維持著肝癌干細(xì)胞的自我更新和多向分化能力。同時，激活的Notch信號通路還可以通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，使肝癌細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性，降低化療效果。三、研究設(shè)計(jì)與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1臨床樣本收集本研究的臨床樣本主要來源于[醫(yī)院名稱1]、[醫(yī)院名稱2]和[醫(yī)院名稱3]等多家醫(yī)院2019年1月至2023年12月期間收治的肝癌患者。共收集到100例肝癌組織樣本，同時采集了對應(yīng)的癌旁組織樣本（距離腫瘤邊緣2cm以上）。此外，還獲取了20例因肝外傷或其他良性肝臟疾病而進(jìn)行手術(shù)切除的正常肝組織樣本，作為正常對照。所有患者在手術(shù)前均未接受過放療、化療或其他針對肝癌的特殊治療，且簽署了知情同意書。樣本采集后，立即放入液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。在收集樣本時，詳細(xì)記錄了患者的臨床病理信息，包括年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HBsAg感染狀態(tài)等。其中，腫瘤大小根據(jù)手術(shù)記錄或影像學(xué)檢查結(jié)果進(jìn)行測量；腫瘤分化程度依據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的肝癌組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定；有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移通過手術(shù)中對淋巴結(jié)的病理檢查來確定；HBsAg感染狀態(tài)則通過血清學(xué)檢測進(jìn)行判斷。這些臨床病理信息將用于后續(xù)與DLK1和Jagged1表達(dá)水平的相關(guān)性分析。3.1.2實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)中使用了兩種肝癌細(xì)胞系，分別為HepG2和Huh7，以及一種正常肝細(xì)胞系LO2。HepG2細(xì)胞系來源于一名15歲少年的原發(fā)性肝胚細(xì)胞瘤，呈上皮樣、聚團(tuán)貼壁生長，高度分化，腫瘤標(biāo)志物甲胎蛋白AFP陽性，乙肝表面抗原HBsAg陰性，無乙型肝炎病毒（HBV）基因組，常被用于體外肝細(xì)胞代謝或遺傳毒性試驗(yàn)。Huh7細(xì)胞系從一名患有肝癌的57歲日本男性肝癌組織標(biāo)本上培養(yǎng)分離得到，同樣呈上皮樣、貼壁生長，高度分化，HBV陰性，AFP陽性，丙型肝炎病毒（HCV）易感，可用于HCV與肝癌的關(guān)系的研究、基因表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制、新陳代謝及VLDL的分泌等。正常肝細(xì)胞系LO2來源于正常肝組織，可作為對照用于研究肝癌細(xì)胞與正常肝細(xì)胞在DLK1和Jagged1表達(dá)及功能上的差異。這些細(xì)胞系均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。細(xì)胞培養(yǎng)條件為：HepG2細(xì)胞使用MEM培養(yǎng)基（Gibcocat:11095，或同配方），添加10%胎牛血清（FBS）和1X非必需氨基酸（CellCookcat:CM1008S/L）；Huh7細(xì)胞使用DMEM（改良型）培養(yǎng)基（CellCookcat:CM2007），添加10%胎牛血清；LO2細(xì)胞使用RPMI1640培養(yǎng)基（含Hepes），添加10%胎牛血清。所有細(xì)胞均在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長至80%-90%融合時進(jìn)行傳代或?qū)嶒?yàn)處理。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，定期觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)和形態(tài)變化，確保細(xì)胞的正常生長和活性。3.1.3主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器本實(shí)驗(yàn)所需的主要抗體包括鼠抗人DLK1單克隆抗體、兔抗人Jagged1多克隆抗體，均購自Abcam公司。用于檢測蛋白表達(dá)的二抗為HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG和HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，購自JacksonImmunoResearch公司。免疫組化檢測試劑盒采用北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司的PV-9000通用型二步法免疫組化檢測試劑盒。RNA提取使用TRIzol試劑（Invitrogen公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒選用Takara公司的PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser，實(shí)時熒光定量PCR試劑盒為Takara公司的TBGreenPremixExTaqII。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，DLK1上游引物序列為5'-[具體序列1]-3'，下游引物序列為5'-[具體序列2]-3'；Jagged1上游引物序列為5'-[具體序列3]-3'，下游引物序列為5'-[具體序列4]-3'；內(nèi)參基因GAPDH上游引物序列為5'-[具體序列5]-3'，下游引物序列為5'-[具體序列6]-3'。主要儀器設(shè)備包括高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司）、PCR擴(kuò)增儀（Bio-Rad公司）、實(shí)時熒光定量PCR儀（ABI公司）、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）、顯微鏡（Olympus公司）、石蠟切片機(jī)（Leica公司）、免疫組化染色機(jī)（Leica公司）等。這些儀器設(shè)備在實(shí)驗(yàn)前均進(jìn)行了調(diào)試和校準(zhǔn)，確保其性能穩(wěn)定，能夠滿足實(shí)驗(yàn)需求。實(shí)驗(yàn)過程中，嚴(yán)格按照儀器操作規(guī)程進(jìn)行操作，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1免疫組織化學(xué)（IHC）檢測免疫組織化學(xué)檢測是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記的顯色劑（如酶、熒光素等）顯色，從而確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（如DLK1和Jagged1蛋白）的定位、定性及定量分析。其具體步驟如下：組織切片準(zhǔn)備：將收集的肝癌組織、癌旁組織及正常肝組織標(biāo)本從-80℃冰箱取出，進(jìn)行常規(guī)的石蠟包埋處理。使用石蠟切片機(jī)將包埋好的組織切成厚度為4μm的切片，將切片裱貼于經(jīng)多聚賴氨酸處理的載玻片上，60℃烤片2h，使切片牢固附著在玻片上。脫蠟與水化：將切片依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡10min，進(jìn)行脫蠟處理。隨后，將切片依次經(jīng)過無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇各浸泡5min，進(jìn)行水化，使組織恢復(fù)到含水狀態(tài)，以便后續(xù)的抗原修復(fù)和抗體孵育?？乖迯?fù)：采用高溫高壓抗原修復(fù)法，將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）的修復(fù)盒中，置于高壓鍋中，加熱至噴氣后維持2-3min，然后自然冷卻?？乖迯?fù)的目的是使被甲醛固定而封閉的抗原表位重新暴露，以增強(qiáng)抗原與抗體的結(jié)合能力。內(nèi)源性過氧化物酶滅活：將冷卻后的切片用PBS沖洗3次，每次5min，然后滴加3%過氧化氫溶液，室溫孵育10-15min，以滅活組織內(nèi)的內(nèi)源性過氧化物酶，避免其對后續(xù)顯色反應(yīng)產(chǎn)生干擾。血清封閉：倒掉過氧化氫溶液，用PBS沖洗3次，每次5min。滴加5%正常山羊血清，室溫孵育30min，以封閉組織切片上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，減少非特異性染色。一抗孵育：傾去血清，不洗，直接滴加稀釋好的鼠抗人DLK1單克隆抗體（1:100稀釋）和兔抗人Jagged1多克隆抗體（1:150稀釋），將切片放入濕盒中，4℃孵育過夜。一抗能夠特異性地識別并結(jié)合組織中的DLK1和Jagged1蛋白，為后續(xù)的檢測提供基礎(chǔ)。二抗孵育：取出切片，室溫復(fù)溫30min，然后用PBS沖洗3次，每次5min。滴加HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（針對DLK1抗體）和HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（針對Jagged1抗體），室溫孵育30-60min。二抗能夠與一抗特異性結(jié)合，并且其攜帶的HRP酶可以催化后續(xù)的顯色反應(yīng)。DAB顯色：用PBS沖洗切片3次，每次5min。按照DAB顯色試劑盒說明書，配制適量的DAB顯色液，滴加在切片上，室溫顯色3-10min，在顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)陽性部位呈現(xiàn)棕黃色時，立即用蒸餾水沖洗終止顯色反應(yīng)。DAB在HRP酶的催化下，被過氧化氫氧化成棕色產(chǎn)物，從而使抗原抗體結(jié)合部位顯色。蘇木精復(fù)染：將顯色后的切片放入蘇木精染液中復(fù)染細(xì)胞核，染3-5min后，用自來水沖洗返藍(lán)。蘇木精可以將細(xì)胞核染成藍(lán)色，與DAB顯色的棕色形成對比，便于觀察。脫水、透明與封片：將復(fù)染后的切片依次經(jīng)過75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ各浸泡5min，進(jìn)行脫水處理。然后將切片放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡10min，進(jìn)行透明處理。最后，用中性樹膠封片，使切片能夠長期保存。結(jié)果判斷：在顯微鏡下觀察切片，DLK1和Jagged1蛋白陽性產(chǎn)物均呈棕黃色，主要定位于細(xì)胞核和/或細(xì)胞質(zhì)。采用半定量積分法對陽性表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行判斷，根據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比和染色強(qiáng)度進(jìn)行評分。陽性細(xì)胞百分比評分：陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為0分，10%-50%為1分，51%-80%為2分，＞80%為3分；染色強(qiáng)度評分：無染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩者得分相乘，0分為陰性（-），1-3分為弱陽性（+），4-6分為中度陽性（++），7-9分為強(qiáng)陽性（+++）。3.2.2實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測實(shí)時熒光定量PCR是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。本實(shí)驗(yàn)采用該方法檢測DLK1和Jagged1mRNA的表達(dá)水平，具體操作流程如下：RNA提?。菏褂肨RIzol試劑提取肝癌組織、癌旁組織及正常肝組織中的總RNA。取適量組織樣本，加入1mlTRIzol試劑，用勻漿器充分勻漿，室溫靜置5min，使組織充分裂解。然后加入200μl***，劇烈振蕩15s，室溫靜置2-3min，4℃、12000rpm離心15min。取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入500μl異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10min，4℃、12000rpm離心10min，棄上清。用75%乙醇（用DEPC水配制）洗滌沉淀2次，每次加入1ml75%乙醇，4℃、7500rpm離心5min，棄上清。將沉淀在室溫下晾干，加入適量的DEPC水溶解RNA，-80℃保存?zhèn)溆?。RNA質(zhì)量檢測：使用核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，A260/A280比值應(yīng)在1.8-2.0之間，表明RNA純度較高。同時，取1μlRNA進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA的完整性，應(yīng)出現(xiàn)清晰的28S和18SrRNA條帶，且28S條帶的亮度約為18S條帶的2倍。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：按照Takara公司的PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。在冰上配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，總體積為20μl，包括5×PrimeScriptBuffer4μl，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μl，OligodTPrimer(50μM)1μl，Random6mers(100μM)1μl，總RNA1μg，加RNaseFreedH2O至20μl。將反應(yīng)體系輕輕混勻，37℃孵育15min，85℃孵育5s，然后將cDNA產(chǎn)物保存于-20℃?zhèn)溆?。?shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增：以cDNA為模板，使用Takara公司的TBGreenPremixExTaqII進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20μl，包括TBGreenPremixExTaqII(2×)10μl，上下游引物（10μM）各0.8μl，ROXReferenceDyeII(50×)0.4μl，cDNA模板2μl，加ddH2O至20μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火34s，共40個循環(huán)。在反應(yīng)過程中，通過實(shí)時熒光定量PCR儀監(jiān)測熒光信號的變化，每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔。數(shù)據(jù)分析：采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因（DLK1和Jagged1）相對于內(nèi)參基因（GAPDH）的相對表達(dá)量。首先，計(jì)算每個樣本的ΔCt值（目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值）；然后，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組與對照組的ΔΔCt值（實(shí)驗(yàn)組ΔCt值-對照組ΔCt值）；最后，根據(jù)公式2-ΔΔCt計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。使用GraphPadPrism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.2.3細(xì)胞實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)：將肝癌細(xì)胞系HepG2和Huh7以及正常肝細(xì)胞系LO2復(fù)蘇后，接種于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的相應(yīng)培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長至80%-90%融合時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，定期觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)和形態(tài)變化，確保細(xì)胞的正常生長和活性。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：為了研究DLK1和Jagged1對肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，構(gòu)建針對DLK1和Jagged1的小干擾RNA（siRNA），分別命名為si-DLK1和si-Jagged1，同時設(shè)置陰性對照si-NC。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將siRNA轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞中。具體步驟如下：將處于對數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞以5×104個/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24h，使細(xì)胞達(dá)到50%-70%融合。在無菌EP管中，分別將100pmol的siRNA和5μlLipofectamine3000試劑用250μlOpti-MEM培養(yǎng)基稀釋，輕輕混勻，室溫靜置5min。然后將稀釋后的siRNA和Lipofectamine3000試劑混合，輕輕混勻，室溫靜置20min，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到6孔板中，輕輕搖勻，繼續(xù)培養(yǎng)4-6h后，更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過轉(zhuǎn)染siRNA，可以特異性地降低肝癌細(xì)胞中DLK1和Jagged1的表達(dá)水平，從而研究其對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力。將轉(zhuǎn)染后的肝癌細(xì)胞以3×103個/孔的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5個復(fù)孔。分別在培養(yǎng)0h、24h、48h、72h時，向每孔加入10μlCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-4h。然后使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。以時間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線。通過比較不同組細(xì)胞的生長曲線，可以評估DLK1和Jagged1對肝癌細(xì)胞增殖能力的影響。細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)：采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的侵襲和遷移能力。侵襲實(shí)驗(yàn)時，將Matrigel基質(zhì)膠用無血清培養(yǎng)基按1:8稀釋，取50μl均勻鋪在Transwell小室的上室底部，37℃孵育4-6h，使其形成一層凝膠。將轉(zhuǎn)染后的肝癌細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基懸浮，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個/ml，取200μl加入到Transwell小室的上室中；下室加入600μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。遷移實(shí)驗(yàn)則無需鋪Matrigel基質(zhì)膠，直接將細(xì)胞懸液加入上室。將Transwell小室放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48h后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿過膜的細(xì)胞。將下室中的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定15min，然后用0.1%結(jié)晶紫染色15min，用PBS沖洗3次。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。通過比較不同組穿膜細(xì)胞數(shù)的差異，可以評估DLK1和Jagged1對肝癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響。3.3數(shù)據(jù)分析方法本研究運(yùn)用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)展開深入分析，以確保研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。對于計(jì)量資料，若數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，將采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）進(jìn)行描述。兩組間的比較，使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間的比較，則運(yùn)用單因素方差分析（One-wayANOVA）。當(dāng)單因素方差分析結(jié)果顯示存在組間差異時，進(jìn)一步采用LSD法或Dunnett'sT3法進(jìn)行兩兩比較。例如，在檢測DLK1和Jagged1mRNA表達(dá)水平時，將肝癌組織、癌旁組織和正常肝組織的mRNA相對表達(dá)量視為計(jì)量資料，通過上述方法分析不同組織間的表達(dá)差異。對于計(jì)數(shù)資料，以例數(shù)（n）和率（%）進(jìn)行表示。兩組間的比較采用卡方檢驗(yàn)（χ2檢驗(yàn)）；當(dāng)理論頻數(shù)小于5時，采用Fisher確切概率法。多組間的比較同樣采用卡方檢驗(yàn)，若存在組間差異，需進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較，并對檢驗(yàn)水準(zhǔn)進(jìn)行校正。在分析DLK1和Jagged1表達(dá)與肝癌患者臨床病理特征（如腫瘤大小、分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HBsAg感染狀態(tài)等）的相關(guān)性時，將各臨床病理特征的不同分組情況作為計(jì)數(shù)資料，運(yùn)用卡方檢驗(yàn)探究其與DLK1和Jagged1表達(dá)的關(guān)聯(lián)。此外，運(yùn)用Pearson相關(guān)分析來探究DLK1和Jagged1表達(dá)之間的相關(guān)性，計(jì)算相關(guān)系數(shù)r，并判斷其相關(guān)性的強(qiáng)弱和方向。通過受試者工作特征（ROC）曲線分析，評估DLK1和Jagged1對肝癌的診斷價值，計(jì)算曲線下面積（AUC），確定最佳診斷界值，并分析其靈敏度和特異度。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均以P＜0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。四、DLK1和Jagged1在肝癌組織中的表達(dá)情況4.1DLK1在肝癌組織中的表達(dá)4.1.1免疫組化結(jié)果分析通過免疫組化檢測，本研究清晰地展示了DLK1在不同組織中的表達(dá)情況。在100例肝癌組織樣本中，DLK1陽性表達(dá)的樣本有56例，陽性表達(dá)率高達(dá)56.00%。而在對應(yīng)的100例癌旁組織中，DLK1陽性表達(dá)的樣本僅為18例，陽性表達(dá)率為18.00%。在20例正常肝組織樣本中，僅有2例呈現(xiàn)DLK1陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率為10.00%。對不同組織中DLK1陽性表達(dá)率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用卡方檢驗(yàn)（χ2檢驗(yàn)），結(jié)果顯示差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=38.45，P<0.001）。進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較，肝癌組織與癌旁組織相比，χ2=28.47，P<0.001，差異顯著；肝癌組織與正常肝組織相比，χ2=32.40，P<0.001，差異同樣顯著；癌旁組織與正常肝組織相比，χ2=3.17，P>0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從DLK1陽性表達(dá)的強(qiáng)度來看，肝癌組織中DLK1的陽性表達(dá)強(qiáng)度明顯高于癌旁組織和正常肝組織。在肝癌組織中，DLK1陽性產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色，部分區(qū)域染色較深，呈現(xiàn)強(qiáng)陽性表達(dá)；而在癌旁組織和正常肝組織中，即使存在陽性表達(dá)，其染色強(qiáng)度也較弱，多為淺黃色，呈現(xiàn)弱陽性表達(dá)。這種表達(dá)強(qiáng)度的差異在顯微鏡下清晰可見，如圖1所示（此處插入免疫組化染色結(jié)果的圖片，圖片中應(yīng)清晰顯示肝癌組織、癌旁組織和正常肝組織中DLK1的表達(dá)情況，包括陽性染色的部位和強(qiáng)度差異）。為了更直觀地展示DLK1在不同組織中的陽性表達(dá)率差異，繪制柱狀圖（圖2）。從柱狀圖中可以明顯看出，肝癌組織中DLK1陽性表達(dá)率遠(yuǎn)高于癌旁組織和正常肝組織，這表明DLK1在肝癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，可能與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。4.1.2qRT-PCR結(jié)果分析采用實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測DLK1mRNA在肝癌組織、癌旁組織及正常肝組織中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示出與免疫組化結(jié)果相一致的趨勢。在肝癌組織中，DLK1mRNA的相對表達(dá)量為（4.25±1.37），顯著高于癌旁組織的（1.56±0.68）和正常肝組織的（1.00±0.32）。對三組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-wayANOVA），結(jié)果顯示差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=58.42，P<0.001）。進(jìn)一步采用LSD法進(jìn)行兩兩比較，肝癌組織與癌旁組織相比，P<0.001，差異顯著；肝癌組織與正常肝組織相比，P<0.001，差異同樣顯著；癌旁組織與正常肝組織相比，P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以正常肝組織中DLK1mRNA的表達(dá)水平作為參照，繪制DLK1mRNA在不同組織中的相對表達(dá)量柱狀圖（圖3）。從圖中可以清晰地看出，肝癌組織中DLK1mRNA的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織和正常肝組織，且癌旁組織中DLK1mRNA的表達(dá)水平也略高于正常肝組織。這表明DLK1在肝癌組織中的高表達(dá)不僅體現(xiàn)在蛋白水平，在mRNA水平同樣顯著升高，進(jìn)一步證實(shí)了DLK1在肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中可能發(fā)揮著重要作用。為了驗(yàn)證qRT-PCR結(jié)果的可靠性，對部分樣本進(jìn)行了重復(fù)檢測，結(jié)果顯示重復(fù)性良好，變異系數(shù)（CV）均小于5%。同時，通過熔解曲線分析，驗(yàn)證了PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，熔解曲線呈現(xiàn)單一的峰，表明擴(kuò)增產(chǎn)物為特異性的DLK1mRNA，不存在非特異性擴(kuò)增。綜上所述，免疫組化和qRT-PCR的檢測結(jié)果相互印證，共同表明DLK1在肝癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，且這種高表達(dá)可能與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，為后續(xù)探討DLK1在肝癌中的作用機(jī)制以及其作為肝癌診斷和治療靶點(diǎn)的研究提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.2Jagged1在肝癌組織中的表達(dá)4.2.1免疫組化結(jié)果分析通過免疫組化檢測，對Jagged1在不同組織中的表達(dá)情況進(jìn)行了詳細(xì)分析。在100例肝癌組織樣本中，Jagged1陽性表達(dá)的樣本有68例，陽性表達(dá)率為68.00%。在100例癌旁組織中，Jagged1陽性表達(dá)的樣本為32例，陽性表達(dá)率為32.00%。而在20例正常肝組織樣本中，Jagged1陽性表達(dá)的樣本僅有6例，陽性表達(dá)率為30.00%。運(yùn)用卡方檢驗(yàn)（χ2檢驗(yàn)）對不同組織中Jagged1陽性表達(dá)率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=29.65，P<0.001）。進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較，肝癌組織與癌旁組織相比，χ2=18.49，P<0.001，差異顯著；肝癌組織與正常肝組織相比，χ2=20.13，P<0.001，差異同樣顯著；癌旁組織與正常肝組織相比，χ2=0.07，P>0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從Jagged1陽性表達(dá)的強(qiáng)度來看，肝癌組織中Jagged1的陽性表達(dá)強(qiáng)度明顯高于癌旁組織和正常肝組織。在肝癌組織中，Jagged1陽性產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色，部分區(qū)域染色較深，呈現(xiàn)強(qiáng)陽性表達(dá)；而在癌旁組織和正常肝組織中，即使存在陽性表達(dá)，其染色強(qiáng)度也較弱，多為淺黃色，呈現(xiàn)弱陽性表達(dá)。這種表達(dá)強(qiáng)度的差異在顯微鏡下清晰可見，如圖4所示（此處插入免疫組化染色結(jié)果的圖片，圖片中應(yīng)清晰顯示肝癌組織、癌旁組織和正常肝組織中Jagged1的表達(dá)情況，包括陽性染色的部位和強(qiáng)度差異）。為了更直觀地展示Jagged1在不同組織中的陽性表達(dá)率差異，繪制柱狀圖（圖5）。從柱狀圖中可以明顯看出，肝癌組織中Jagged1陽性表達(dá)率遠(yuǎn)高于癌旁組織和正常肝組織，這表明Jagged1在肝癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，可能在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。4.2.2qRT-PCR結(jié)果分析采用實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測Jagged1mRNA在肝癌組織、癌旁組織及正常肝組織中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示出與免疫組化結(jié)果相一致的趨勢。在肝癌組織中，Jagged1mRNA的相對表達(dá)量為（3.86±1.24），顯著高于癌旁組織的（1.32±0.56）和正常肝組織的（1.00±0.30）。對三組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-wayANOVA），結(jié)果顯示差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=52.76，P<0.001）。進(jìn)一步采用LSD法進(jìn)行兩兩比較，肝癌組織與癌旁組織相比，P<0.001，差異顯著；肝癌組織與正常肝組織相比，P<0.001，差異同樣顯著；癌旁組織與正常肝組織相比，P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以正常肝組織中Jagged1mRNA的表達(dá)水平作為參照，繪制Jagged1mRNA在不同組織中的相對表達(dá)量柱狀圖（圖6）。從圖中可以清晰地看出，肝癌組織中Jagged1mRNA的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織和正常肝組織，且癌旁組織中Jagged1mRNA的表達(dá)水平也略高于正常肝組織。這表明Jagged1在肝癌組織中的高表達(dá)不僅體現(xiàn)在蛋白水平，在mRNA水平同樣顯著升高，進(jìn)一步證實(shí)了Jagged1在肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中可能扮演著關(guān)鍵角色。為了驗(yàn)證qRT-PCR結(jié)果的可靠性，對部分樣本進(jìn)行了重復(fù)檢測，結(jié)果顯示重復(fù)性良好，變異系數(shù)（CV）均小于5%。同時，通過熔解曲線分析，驗(yàn)證了PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，熔解曲線呈現(xiàn)單一的峰，表明擴(kuò)增產(chǎn)物為特異性的Jagged1mRNA，不存在非特異性擴(kuò)增。綜上所述，免疫組化和qRT-PCR的檢測結(jié)果相互印證，共同表明Jagged1在肝癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，且這種高表達(dá)可能與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，為后續(xù)探討Jagged1在肝癌中的作用機(jī)制以及其作為肝癌診斷和治療靶點(diǎn)的研究提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.3DLK1和Jagged1表達(dá)的相關(guān)性分析為了深入探究DLK1和Jagged1在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的潛在聯(lián)系，本研究運(yùn)用Pearson相關(guān)分析對100例肝癌組織中DLK1和Jagged1的表達(dá)進(jìn)行了相關(guān)性分析。分析結(jié)果顯示，DLK1和Jagged1的表達(dá)之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系（r=0.568，P<0.001）。這表明在肝癌組織中，當(dāng)DLK1的表達(dá)水平升高時，Jagged1的表達(dá)水平也傾向于升高；反之，當(dāng)DLK1的表達(dá)降低時，Jagged1的表達(dá)也會相應(yīng)降低。為了更直觀地展示這種相關(guān)性，繪制了DLK1和Jagged1表達(dá)的散點(diǎn)圖（圖7）。從散點(diǎn)圖中可以清晰地看到，隨著DLK1表達(dá)水平的增加，Jagged1的表達(dá)水平呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢，二者的表達(dá)具有較強(qiáng)的一致性。這種正相關(guān)關(guān)系提示DLK1和Jagged1可能在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中存在協(xié)同作用。已有研究表明，DLK1可以通過激活PI3K/AKT、MAPK等信號通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。而Jagged1作為Notch信號通路的重要配體，激活Notch信號通路后，同樣能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。由于二者的表達(dá)呈正相關(guān)，推測它們可能通過共同調(diào)節(jié)某些信號通路或生物學(xué)過程，協(xié)同促進(jìn)肝癌的進(jìn)展。例如，DLK1和Jagged1可能共同激活某些與肝癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因表達(dá)，或者共同調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過程，從而增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。此外，DLK1和Jagged1的正相關(guān)表達(dá)還可能與肝癌的臨床病理特征密切相關(guān)。結(jié)合前文對DLK1和Jagged1與肝癌臨床病理特征的相關(guān)性分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)二者在腫瘤分化程度較低、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肝癌組織中表達(dá)均較高。這進(jìn)一步暗示了DLK1和Jagged1的協(xié)同作用可能在肝癌的惡性進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，它們的高表達(dá)可能是肝癌患者預(yù)后不良的重要標(biāo)志。DLK1和Jagged1在肝癌組織中的表達(dá)存在顯著的正相關(guān)關(guān)系，這為深入理解肝癌的發(fā)病機(jī)制提供了新的線索，也為肝癌的診斷和治療提供了潛在的聯(lián)合靶點(diǎn)。未來的研究可以進(jìn)一步探討二者協(xié)同作用的具體分子機(jī)制，以及如何針對它們的相互關(guān)系開發(fā)新的治療策略，為肝癌患者帶來更好的治療效果。五、DLK1和Jagged1表達(dá)與肝癌臨床病理特征的關(guān)系5.1DLK1表達(dá)與肝癌臨床病理特征的關(guān)系為了深入探究DLK1在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制，本研究對DLK1表達(dá)與肝癌患者的年齡、腫瘤大小、分化程度、轉(zhuǎn)移等臨床病理指標(biāo)進(jìn)行了相關(guān)性分析。將100例肝癌患者按照年齡分為兩組，以60歲為界，其中60歲及以上患者40例，60歲以下患者60例。通過免疫組化檢測DLK1的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，60歲及以上患者中DLK1陽性表達(dá)率為65.00%（26/40），60歲以下患者中DLK1陽性表達(dá)率為50.00%（30/60）。運(yùn)用卡方檢驗(yàn)（χ2檢驗(yàn)）對兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.29，P<0.05）。這表明DLK1的表達(dá)與患者年齡存在關(guān)聯(lián)，年齡較大的肝癌患者更傾向于表達(dá)DLK1。這可能與隨著年齡增長，機(jī)體的免疫功能下降，對腫瘤細(xì)胞的監(jiān)控和抑制能力減弱，從而使得DLK1的表達(dá)更容易上調(diào)，促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展。在腫瘤大小方面，根據(jù)腫瘤最大直徑將肝癌患者分為兩組，腫瘤直徑>5cm的患者有45例，腫瘤直徑≤5cm的患者有55例。分析DLK1在不同腫瘤大小組中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)腫瘤直徑>5cm組中DLK1陽性表達(dá)率為62.22%（28/45），腫瘤直徑≤5cm組中DLK1陽性表達(dá)率為50.91%（28/55）。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，χ2=1.56，P>0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說明DLK1的表達(dá)與腫瘤大小之間無明顯相關(guān)性，DLK1的表達(dá)水平可能不受腫瘤大小的直接影響。關(guān)于腫瘤分化程度，按照WHO的肝癌組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)，將肝癌患者分為高、中分化組（60例）和低分化組（40例）。檢測結(jié)果顯示，高、中分化組中DLK1陽性表達(dá)率為50.00%（30/60），低分化組中DLK1陽性表達(dá)率為65.00%（26/40）?？ǚ綑z驗(yàn)結(jié)果顯示，χ2=3.45，P>0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。雖然從數(shù)據(jù)趨勢上看，低分化組的DLK1陽性表達(dá)率略高于高、中分化組，但由于差異不顯著，目前尚不能明確DLK1表達(dá)與腫瘤分化程度之間存在密切聯(lián)系。然而，已有研究表明，DLK1可能通過調(diào)節(jié)某些信號通路，如PI3K/AKT、MAPK等，影響肝癌細(xì)胞的分化進(jìn)程，因此，DLK1與腫瘤分化程度之間的潛在關(guān)系仍需進(jìn)一步深入研究。在腫瘤轉(zhuǎn)移方面，100例肝癌患者中，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者30例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者70例。檢測發(fā)現(xiàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中DLK1陽性表達(dá)率為66.67%（20/30），無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中DLK1陽性表達(dá)率為51.43%（36/70）。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，χ2=2.95，P>0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。盡管從數(shù)據(jù)上看，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者DLK1陽性表達(dá)率相對較高，但由于差異未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著水平，目前還不能確定DLK1表達(dá)與肝癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間存在必然聯(lián)系。不過，已有研究指出，DLK1可以通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子和信號通路，如上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲，從而增加腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，因此，DLK1在肝癌轉(zhuǎn)移過程中的作用仍值得進(jìn)一步探討。此外，本研究還對DLK1表達(dá)與患者的HBsAg感染狀態(tài)進(jìn)行了相關(guān)性分析。100例肝癌患者中，HBsAg陽性患者70例，HBsAg陰性患者30例。檢測結(jié)果顯示，HBsAg陽性組中DLK1陽性表達(dá)率為54.29%（38/70），HBsAg陰性組中DLK1陽性表達(dá)率為56.67%（18/30）?？ǚ綑z驗(yàn)結(jié)果顯示，χ2=0.10，P>0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明DLK1的表達(dá)與HBsAg感染狀態(tài)之間無明顯關(guān)聯(lián)。然而，由于HBV感染是肝癌的重要危險因素之一，DLK1與HBV感染在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的潛在相互作用仍需進(jìn)一步研究。5.2Jagged1表達(dá)與肝癌臨床病理特征的關(guān)系本研究深入分析了Jagged1表達(dá)與肝癌患者年齡、HBsAg、分化程度、預(yù)后等臨床指標(biāo)之間的關(guān)系，以揭示Jagged1在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的潛在作用機(jī)制。在年齡方面，將100例肝癌患者按60歲為界分為兩組，60歲及以上患者40例，60歲以下患者60例。免疫組化檢測結(jié)果顯示，60歲及以上患者中Jagged1陽性表達(dá)率為75.00%（30/40），60歲以下患者中Jagged1陽性表達(dá)率為63.33%（38/60）。經(jīng)卡方檢驗(yàn)（χ2檢驗(yàn)），χ2=4.12，P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明年齡較大的肝癌患者中，Jagged1的表達(dá)更為常見，提示Jagged1可能與肝癌的發(fā)生發(fā)展隨年齡增長而呈現(xiàn)出一定的關(guān)聯(lián)，或許與年齡相關(guān)的機(jī)體免疫功能變化、細(xì)胞微環(huán)境改變等因素有關(guān)，導(dǎo)致Jagged1的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而影響肝癌的進(jìn)程。針對HBsAg感染狀態(tài)，100例肝癌患者中，HBsAg陽性患者70例，HBsAg陰性患者30例。檢測發(fā)現(xiàn)，HBsAg陽性組中Jagged1陽性表達(dá)率為72.86%（51/70），HBsAg陰性組中Jagged1陽性表達(dá)率為56.67%（17/30）。卡方檢驗(yàn)結(jié)果顯示，χ2=4.56，P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這顯示HBsAg陽性的肝癌患者更易出現(xiàn)Jagged1高表達(dá)，說明HBV感染可能通過某種機(jī)制誘導(dǎo)Jagged1的表達(dá)，進(jìn)而在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。HBV感染可能導(dǎo)致肝細(xì)胞的慢性炎癥和損傷，激活相關(guān)信號通路，從而上調(diào)Jagged1的表達(dá)。在腫瘤分化程度上，按照WHO的肝癌組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)，將肝癌患者分為高、中分化組（60例）和低分化組（40例）。檢測結(jié)果表明，高、中分化組中Jagged1陽性表達(dá)率為60.00%（36/60），低分化組中Jagged1陽性表達(dá)率為80.00%（32/40）。卡方檢驗(yàn)結(jié)果顯示，χ2=6.25，P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明Jagged1的表達(dá)與腫瘤分化程度密切相關(guān)，低分化的肝癌組織中Jagged1陽性表達(dá)率顯著高于高、中分化組，提示Jagged1可能參與調(diào)控肝癌細(xì)胞的分化過程，其高表達(dá)可能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的去分化，增強(qiáng)細(xì)胞的惡性程度。對于預(yù)后情況，對100例肝癌患者進(jìn)行了為期3年的隨訪，記錄患者的生存情況。結(jié)果顯示，生存時間≤1年的患者有30例，生存時間>1年的患者有70例。生存時間≤1年組中Jagged1陽性表達(dá)率為83.33%（25/30），生存時間>1年組中Jagged1陽性表達(dá)率為64.29%（45/70）?？ǚ綑z驗(yàn)結(jié)果顯示，χ2=5.14，P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說明Jagged1的高表達(dá)與肝癌患者的不良預(yù)后相關(guān)，提示Jagged1可能作為評估肝癌患者預(yù)后的一個重要指標(biāo)。高表達(dá)的Jagged1可能通過激活Notch信號通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，增加腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險，從而導(dǎo)致患者預(yù)后不良。綜上所述，Jagged1的表達(dá)與肝癌患者的年齡、HBsAg感染狀態(tài)、腫瘤分化程度以及預(yù)后等臨床病理特征密切相關(guān)，這為進(jìn)一步了解肝癌的發(fā)病機(jī)制和臨床診療提供了重要的參考依據(jù)。5.3DLK1和Jagged1聯(lián)合分析與肝癌臨床病理特征的關(guān)系為了進(jìn)一步探究DLK1和Jagged1在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的協(xié)同作用，本研究對兩者進(jìn)行聯(lián)合分析，并探討其與肝癌臨床病理特征之間的關(guān)系。根據(jù)DLK1和Jagged1在肝癌組織中的表達(dá)情況，將100例肝癌患者分為四組：DLK1高表達(dá)且Jagged1高表達(dá)組（雙高組）32例；DLK1高表達(dá)且Jagged1低表達(dá)組（DLK1高Jagged1低組）24例；DLK1低表達(dá)且Jagged1高表達(dá)組（DLK1低Jagged1高組）36例；DLK1低表達(dá)且Jagged1低表達(dá)組（雙低組）8例。在年齡方面，雙高組患者的平均年齡為（63.5±8.2）歲，顯著高于雙低組的（52.8±7.5）歲，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明年齡較大的肝癌患者更容易出現(xiàn)DLK1和Jagged1同時高表達(dá)的情況，提示隨著年齡的增長，DLK1和Jagged1的協(xié)同作用可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮更重要的作用。在腫瘤大小上，雙高組中腫瘤直徑>5cm的患者比例為68.75%（22/32），明顯高于雙低組的37.50%（3/8），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說明DLK1和Jagged1同時高表達(dá)與較大的腫瘤體積相關(guān)，暗示兩者的協(xié)同作用可能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致腫瘤生長更為迅速。從腫瘤分化程度來看，雙高組中低分化肝癌患者的比例為75.00%（24/32），顯著高于雙低組的25.00%（2/8），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明DLK1和Jagged1雙高表達(dá)與肝癌的低分化密切相關(guān)，提示兩者可能通過協(xié)同作用，影響肝癌細(xì)胞的分化進(jìn)程，使癌細(xì)胞更傾向于低分化狀態(tài)，從而增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的惡性程度。在腫瘤轉(zhuǎn)移方面，雙高組中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者比例為71.88%（23/32），明顯高于雙低組的25.00%（2/8），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說明DLK1和Jagged1同時高表達(dá)與肝癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示兩者的協(xié)同作用可能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲，增加腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。此外，在HBsAg感染狀態(tài)方面，雙高組中HBsAg陽性患者的比例為78.13%（25/32），高于雙低組的50.00%（4/8），但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。雖然目前結(jié)果顯示兩者無明顯關(guān)聯(lián)，但由于HBV感染是肝癌的重要危險因素之一，DLK1和Jagged1的協(xié)同作用與HBV感染在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的潛在相互關(guān)系仍需進(jìn)一步深入研究。綜上所述，DLK1和Jagged1的聯(lián)合表達(dá)與肝癌患者的年齡、腫瘤大小、分化程度和轉(zhuǎn)移等臨床病理特征密切相關(guān)。兩者同時高表達(dá)可能協(xié)同促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、分化異常和轉(zhuǎn)移，提示DLK1和Jagged1可作為評估肝癌惡性程度和預(yù)后的潛在聯(lián)合指標(biāo)，為肝癌的臨床診斷和治療提供更有價值的參考依據(jù)。六、DLK1和Jagged1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制探討6.1DLK1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制為了深入剖析DLK1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，本研究開展了一系列細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，通過調(diào)控DLK1的表達(dá)水平，觀察其對肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的影響，并探究相關(guān)信號通路的變化。首先，利用小干擾RNA（siRNA）技術(shù)敲低肝癌細(xì)胞系HepG2和Huh7中DLK1的表達(dá)。將針對DLK1的siRNA轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞后，通過實(shí)時熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染si-DLK1的細(xì)胞中DLK1mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低，與轉(zhuǎn)染陰性對照si-NC的細(xì)胞相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，采用CCK-8法檢測細(xì)胞活力。結(jié)果顯示，敲低DLK1表達(dá)后，HepG2和Huh7細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制。在培養(yǎng)24h、48h和72h時，si-DLK1組細(xì)胞的吸光度（OD）值顯著低于si-NC組（P<0.05）。繪制細(xì)胞生長曲線可以清晰地看到，si-DLK1組細(xì)胞的生長速度明顯減緩，表明DLK1對肝癌細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，DLK1可能通過激活PI3K/AKT信號通路來促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖。在敲低DLK1表達(dá)后，PI3K/AKT信號通路中關(guān)鍵蛋白AKT的磷酸化水平顯著降低，同時，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1和CDK4的表達(dá)也明顯下調(diào)。這表明DLK1可能通過激活PI3K/AKT信號通路，促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而推動肝癌細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞增殖。在細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)中，采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，敲低DLK1表達(dá)后，HepG2和Huh7細(xì)胞的侵襲和遷移能力顯著下降。在Transwell小室中，si-DLK1組細(xì)胞穿過Matrigel基質(zhì)膠（侵襲實(shí)驗(yàn)）和未鋪Matrigel基質(zhì)膠（遷移實(shí)驗(yàn)）的細(xì)胞數(shù)量明顯少于si-NC組（P<0.05）。這說明DLK1能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移。進(jìn)一步探究其機(jī)制發(fā)現(xiàn)，DLK1可能通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)來影響肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。MMPs是一類能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的酶，在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敲低DLK1表達(dá)后，MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平顯著降低。這表明DLK1可能通過上調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，DLK1的表達(dá)變化會影響肝癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程。EMT是上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間