Scutellarein抑制人舌鱗癌細(xì)胞增殖的體外研究：機(jī)制與前景

Scutellarein抑制人舌鱗癌細(xì)胞增殖的體外研究：機(jī)制與前景一、引言1.1舌鱗癌概述1.1.1舌鱗癌的定義與發(fā)病情況舌鱗癌，即舌鱗狀細(xì)胞癌（TongueSquamousCellCarcinoma，TSCC），是一種起源于舌鱗狀上皮的惡性腫瘤，也是口腔癌中最常見(jiàn)的類(lèi)型，在頭頸部惡性腫瘤中占據(jù)重要比例。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)2020年數(shù)據(jù)顯示，口腔癌占所有惡性腫瘤的3%-5%，其中舌癌約占40%。全球范圍內(nèi)，每年新增舌鱗癌病例約為40萬(wàn)例，其中5-15%發(fā)生在舌部。在我國(guó)，舌鱗癌的發(fā)病形勢(shì)也不容樂(lè)觀，國(guó)家癌癥中心數(shù)據(jù)表明，每年新發(fā)TSCC病例數(shù)約為3.9萬(wàn)例。舌鱗癌的發(fā)病與多種因素相關(guān)。不良生活習(xí)慣如長(zhǎng)期吸煙、飲酒，會(huì)對(duì)舌部黏膜產(chǎn)生持續(xù)性刺激與損傷，使得上皮細(xì)胞異常增生，進(jìn)而增加癌變風(fēng)險(xiǎn)。有研究指出，長(zhǎng)期大量吸煙、飲酒的人群，其患舌鱗癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著高于普通人群。嚼檳榔也是重要的危險(xiǎn)因素之一，檳榔中的檳榔堿等成分具有細(xì)胞毒性，長(zhǎng)期咀嚼檳榔易導(dǎo)致口腔黏膜下纖維化，進(jìn)而引發(fā)舌鱗癌。此外，人乳頭瘤病毒（HPV）感染、口腔衛(wèi)生不良、營(yíng)養(yǎng)不良等也在舌鱗癌的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮作用。舌鱗癌多發(fā)生于中老年人，且男性發(fā)病率明顯高于女性。早期舌鱗癌通常癥狀隱匿，可能僅表現(xiàn)為舌部輕微不適、小潰瘍或小結(jié)節(jié)，這些癥狀極易被忽視，從而延誤病情。隨著腫瘤的發(fā)展，會(huì)出現(xiàn)舌部疼痛、活動(dòng)受限、舌表面糜爛或潰瘍性病變，部分患者還會(huì)出現(xiàn)舌部腫塊。晚期舌鱗癌常發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重威脅患者的生存質(zhì)量與生命健康。1.1.2現(xiàn)有治療手段及局限性目前，舌鱗癌的治療方法主要包括手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療以及近年來(lái)逐漸興起的靶向治療和免疫治療等，其中手術(shù)、放療、化療是傳統(tǒng)的主要治療手段。手術(shù)治療是舌鱗癌的重要治療方式之一，對(duì)于早期病變，根治性切除術(shù)是主要選擇，旨在徹底切除腫瘤原發(fā)病灶，以達(dá)到根治目的。然而，手術(shù)切除范圍往往受到腫瘤位置、大小以及患者身體狀況等因素的限制。對(duì)于一些位于舌部關(guān)鍵部位或腫瘤體積較大的患者，手術(shù)可能無(wú)法完全切除腫瘤，導(dǎo)致殘留癌細(xì)胞，增加復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。而且，手術(shù)會(huì)造成舌體組織缺損，影響患者的語(yǔ)言、吞咽和咀嚼功能，對(duì)患者的生活質(zhì)量產(chǎn)生嚴(yán)重影響。為了恢復(fù)部分功能和美觀，整形重建技術(shù)在舌癌手術(shù)中得到應(yīng)用，但仍難以完全恢復(fù)患者的生理功能，且手術(shù)創(chuàng)傷大，術(shù)后恢復(fù)時(shí)間長(zhǎng)，患者需要承受較大痛苦。放射治療利用高能射線破壞腫瘤細(xì)胞的DNA結(jié)構(gòu)，阻止其生長(zhǎng)和分裂。對(duì)于不適合手術(shù)的患者，放療是一種有效的保功能治療方式。部分早期病例通過(guò)單純放療也能達(dá)到與手術(shù)相當(dāng)?shù)闹斡?。隨著放療技術(shù)的發(fā)展，如三維適形放療（3D-CRT）、調(diào)強(qiáng)放療（IMRT）、立體定向放療（SBRT）等，能夠更精確地照射腫瘤區(qū)域，降低對(duì)周?chē)＝M織的損傷。但舌部解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，臨近重要器官，如喉、脊髓和腦干等，放療在殺死癌細(xì)胞的同時(shí)，不可避免地會(huì)對(duì)這些正常組織造成一定損傷，引發(fā)一系列副作用，如口腔黏膜損傷、口干、吞咽困難、放射性頜骨壞死等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。此外，長(zhǎng)期放療還可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)射線產(chǎn)生耐受性，降低放療效果?；瘜W(xué)治療通過(guò)使用化學(xué)藥物，如順鉑、5-氟尿嘧啶等，殺死癌細(xì)胞?；煻嘤糜谛g(shù)后的輔助治療，或與放療聯(lián)合使用，即同步放化療，以提高治療效果?；熕幬镞M(jìn)入全身血液循環(huán)系統(tǒng)，不僅作用于腫瘤細(xì)胞，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生損害，導(dǎo)致一系列不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制、肝腎功能損害等，使患者的身體狀況和生活質(zhì)量下降。而且，化療藥物的耐藥性也是一個(gè)棘手問(wèn)題，部分患者在化療過(guò)程中會(huì)逐漸對(duì)藥物產(chǎn)生耐藥，使得化療效果大打折扣，腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)增加。綜上所述，盡管現(xiàn)有治療手段在舌鱗癌的治療中取得了一定成效，但都存在各自的局限性，患者在治療過(guò)程中承受著較大的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，且治療后的生存質(zhì)量和預(yù)后仍有待提高。因此，尋找一種安全、有效、副作用小的治療方法或輔助治療藥物，成為舌鱗癌治療領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題。1.2Scutellarein研究背景Scutellarein，中文名野黃芩素，是一種從燈盞細(xì)辛、虎尾草、木蝴蝶等多種藥用植物中提取分離得到的天然黃酮類(lèi)化合物，其化學(xué)名稱(chēng)為5,6,7-三羥基黃酮。黃酮類(lèi)化合物作為植物次生代謝產(chǎn)物的重要組成部分，在植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、防御等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Scutellarein因其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)，展現(xiàn)出多種顯著的生物活性，在醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。在抗炎方面，Scutellarein具有顯著的功效。研究表明，它可以抑制Src激酶、NF-κB和巨噬細(xì)胞活化，從而調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)信號(hào)通路。在巨噬細(xì)胞炎癥模型中，Scutellarein能夠減少炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）的釋放，降低炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度，對(duì)多種炎癥相關(guān)疾病，如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病等具有潛在的治療作用。其抗炎機(jī)制可能與抑制炎癥介質(zhì)的合成、調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能以及抗氧化作用有關(guān)。在抗氧化方面，Scutellarein擁有較強(qiáng)的抗氧化能力，能夠清除體內(nèi)過(guò)多的自由基，減輕氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞和組織的損傷。自由基在體內(nèi)的過(guò)量積累會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)和DNA損傷，進(jìn)而引發(fā)多種疾病，如心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病等。Scutellarein分子中的多個(gè)羥基使其能夠與自由基發(fā)生反應(yīng)，阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷，維持細(xì)胞的正常生理功能。此外，Scutellarein還在神經(jīng)保護(hù)、抗菌、抗病毒等方面表現(xiàn)出一定的活性。在神經(jīng)保護(hù)領(lǐng)域，它可以通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)水平、抑制神經(jīng)元凋亡、改善神經(jīng)細(xì)胞的能量代謝等機(jī)制，對(duì)腦缺血、阿爾茨海默病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)揮保護(hù)作用。在抗病毒方面，研究發(fā)現(xiàn)Scutellarein及其甲基化衍生物能夠抑制新型冠狀病毒的3C樣蛋白酶（3C-likeprotease，3CLP）活性，從而抑制病毒的增殖，緩解感染宿主細(xì)胞內(nèi)的免疫失衡，展現(xiàn)出潛在的抗新型冠狀病毒作用。癌癥作為嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的重大疾病，尋找安全有效的抗癌藥物一直是醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)。Scutellarein的多種生物活性使其具備成為潛在抗癌藥物的可能性。其抗炎作用有助于減輕腫瘤微環(huán)境中的炎癥反應(yīng)，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移；抗氧化作用可以減少自由基對(duì)細(xì)胞DNA的損傷，降低細(xì)胞癌變的風(fēng)險(xiǎn)；調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)通路的能力則可能影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和周期調(diào)控等過(guò)程。目前，已有研究報(bào)道Scutellarein對(duì)多種腫瘤細(xì)胞，如乳腺癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞等具有抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用，但其在舌鱗癌方面的研究相對(duì)較少。深入探究Scutellarein對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞的作用及機(jī)制，對(duì)于開(kāi)發(fā)新型舌鱗癌治療藥物具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值，有望為舌鱗癌患者提供新的治療策略和希望。1.3研究目的與意義舌鱗癌作為口腔癌中最常見(jiàn)的類(lèi)型，嚴(yán)重威脅患者的生命健康和生活質(zhì)量。盡管當(dāng)前手術(shù)、放療、化療以及靶向治療和免疫治療等多種手段在舌鱗癌治療中發(fā)揮作用，但現(xiàn)有治療方法均存在一定局限性，如手術(shù)創(chuàng)傷大、放化療副作用強(qiáng)、靶向及免疫治療存在耐藥性等問(wèn)題，使得尋找新的安全有效的治療方法或輔助治療藥物成為當(dāng)務(wù)之急。Scutellarein作為一種具有多種生物活性的天然黃酮類(lèi)化合物，在抗炎、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)、抗菌、抗病毒等方面表現(xiàn)出色，尤其在抗癌領(lǐng)域展現(xiàn)出潛在的應(yīng)用價(jià)值，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用。然而，目前關(guān)于Scutellarein在舌鱗癌治療方面的研究還相對(duì)匱乏，其對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞的具體作用機(jī)制尚未明確。本研究旨在深入探究Scutellarein在體外對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞增殖的影響及其潛在作用機(jī)制。通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，包括細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)以及相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)檢測(cè)等，明確Scutellarein對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡和周期的調(diào)控作用，以及其作用過(guò)程中涉及的關(guān)鍵信號(hào)通路和分子靶點(diǎn)。本研究具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。從理論層面來(lái)看，深入研究Scutellarein抗人舌鱗癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，有助于進(jìn)一步揭示天然黃酮類(lèi)化合物的抗癌機(jī)制，豐富腫瘤生物學(xué)的理論知識(shí)，為后續(xù)相關(guān)研究提供新的思路和方向。在臨床應(yīng)用方面，若能證實(shí)Scutellarein對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞具有顯著的抑制作用，將為舌鱗癌的治療提供新的潛在藥物選擇。它有可能作為單一治療藥物，或與現(xiàn)有治療手段聯(lián)合使用，增強(qiáng)治療效果，減少傳統(tǒng)治療方法的劑量和副作用，提高患者的生存質(zhì)量和預(yù)后效果，為廣大舌鱗癌患者帶來(lái)新的希望。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1細(xì)胞株本實(shí)驗(yàn)選用人舌鱗癌細(xì)胞株SCC4和SCC9，其原代細(xì)胞均取自舌鱗癌患者的腫瘤組織。SCC4細(xì)胞株源自一名男性舌鱗癌患者的活檢樣本，SCC9細(xì)胞株則建立于一名70歲男性舌鱗狀細(xì)胞癌的活檢。這兩種細(xì)胞株具有典型的舌鱗癌細(xì)胞特性，呈上皮樣形態(tài)，貼壁生長(zhǎng)，在體外培養(yǎng)條件下能夠穩(wěn)定增殖，且保留了舌鱗癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，如高增殖活性、侵襲和轉(zhuǎn)移能力等，廣泛應(yīng)用于舌鱗癌的相關(guān)研究，是研究舌鱗癌發(fā)病機(jī)制和治療方法的常用細(xì)胞模型，有助于準(zhǔn)確模擬舌鱗癌在體內(nèi)的生長(zhǎng)和發(fā)展過(guò)程，為探究Scutellarein對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞的作用提供可靠的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，對(duì)細(xì)胞株進(jìn)行了STR（ShortTandemRepeat）鑒定，以確保細(xì)胞株的準(zhǔn)確性和無(wú)污染性。2.1.2主要試劑與儀器Scutellarein（純度≥98%）購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，使用DMSO（二甲基亞砜，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）溶解配制成100mM的儲(chǔ)存液，于-20℃避光保存，使用時(shí)用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。細(xì)胞培養(yǎng)基選用DMEM/F12（1:1）培養(yǎng)基（Gibco公司），并添加10%胎牛血清（FBS，Gibco公司）、1%青霉素-鏈霉素雙抗（Solarbio公司），以提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和維持無(wú)菌環(huán)境。CCK-8試劑（CellCountingKit-8，日本同仁化學(xué)研究所）用于檢測(cè)細(xì)胞增殖活性；AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（BDBiosciences公司）用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）用于分析細(xì)胞周期分布；RIPA裂解液（強(qiáng)）、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、PVDF膜（Millipore公司）以及ECL化學(xué)發(fā)光底物（ThermoFisherScientific公司）等用于蛋白提取、定量、電泳和免疫印跡實(shí)驗(yàn)，以檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)用到的儀器包括：酶標(biāo)儀（MultiskanGO，ThermoFisherScientific公司），用于檢測(cè)CCK-8實(shí)驗(yàn)中各孔的吸光度值，從而計(jì)算細(xì)胞增殖率；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），為細(xì)胞提供37℃、5%CO2的培養(yǎng)環(huán)境，模擬體內(nèi)生理?xiàng)l件，維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和代謝；倒置顯微鏡（Olympus公司），用于實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)狀態(tài)和貼壁情況；高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司），用于細(xì)胞和蛋白樣品的離心分離，獲取所需的細(xì)胞沉淀或蛋白上清液；電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司），用于蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳分離和轉(zhuǎn)膜過(guò)程，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以便后續(xù)的免疫印跡檢測(cè)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），用于檢測(cè)免疫印跡實(shí)驗(yàn)中ECL化學(xué)發(fā)光底物產(chǎn)生的信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白表達(dá)水平的可視化和定量分析。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將人舌鱗癌細(xì)胞株SCC4和SCC9從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴鍋中，輕輕搖晃凍存管，使其快速融化。在超凈工作臺(tái)內(nèi)，將融化后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有5mL完全培養(yǎng)基（DMEM/F12（1:1）培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗）的離心管中，1000rpm離心5min，棄去上清液，用新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL，接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天，待細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，先用PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞2次，去除殘留的培養(yǎng)基，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液1mL，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞變圓、開(kāi)始脫離瓶壁時(shí)，立即加入含有血清的完全培養(yǎng)基終止消化，用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使其形成單細(xì)胞懸液，按1:3-1:4的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。2.2.2細(xì)胞毒性測(cè)試采用MTT法檢測(cè)Scutellarein對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞SCC4和SCC9的細(xì)胞毒性。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL，接種于96孔板中，每孔100μL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，吸去原培養(yǎng)基，用PBS沖洗細(xì)胞1次，加入不同濃度（0、1、5、10、20、50、100μM）的Scutellarein溶液，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組（只加培養(yǎng)基，不加細(xì)胞）和溶劑對(duì)照組（加入含相應(yīng)濃度DMSO的培養(yǎng)基）。繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h和72h后，每孔加入20μL5mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)孵育4h。孵育結(jié)束后，小心吸去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使甲瓚結(jié)晶充分溶解。使用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值）。細(xì)胞存活率計(jì)算公式為：細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）/（溶劑對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值）×100%。2.2.3細(xì)胞增殖測(cè)試運(yùn)用CCK-8法檢測(cè)Scutellarein對(duì)細(xì)胞增殖的影響。將SCC4和SCC9細(xì)胞以3×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組（加入等量的含0.1%DMSO的培養(yǎng)基）和不同濃度Scutellarein處理組（終濃度分別為1、5、10、20、50μM），每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。分別在加藥后0h、24h、48h、72h進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-2h，使細(xì)胞充分反應(yīng)。然后用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值，根據(jù)OD值繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，以評(píng)估Scutellarein對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。2.2.4細(xì)胞周期與凋亡檢測(cè)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Scutellarein對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響。將SCC4和SCC9細(xì)胞以2×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后，分別加入不同濃度（0、10、20、50μM）的Scutellarein，繼續(xù)培養(yǎng)48h。收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS沖洗2次，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，1000rpm離心5min，棄去上清液。細(xì)胞周期檢測(cè)時(shí)，將細(xì)胞沉淀用預(yù)冷的70%乙醇固定，4℃過(guò)夜。次日，1000rpm離心5min，棄去固定液，用PBS沖洗2次，加入500μL含有50μg/mLRNaseA和20μg/mL碘化丙啶（PI）的染色液，37℃避光孵育30min，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布。細(xì)胞凋亡檢測(cè)時(shí)，將細(xì)胞沉淀用BindingBuffer重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，取100μL細(xì)胞懸液加入5μLAnnexinV-FITC和10μLPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15min，再加入400μLBindingBuffer，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。2.2.5Westernblotting檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)為檢測(cè)增殖、凋亡、信號(hào)通路相關(guān)蛋白，將SCC4和SCC9細(xì)胞以5×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24h后，加入不同濃度（0、10、20、50μM）的Scutellarein處理48h。收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS沖洗2次，加入適量的RIPA裂解液（含1mMPMSF），冰上裂解30min，期間輕輕搖晃。然后將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000rpm、4℃離心15min，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品與5×上樣緩沖液混合，100℃煮沸5min使蛋白變性。根據(jù)蛋白濃度，取適量的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉室溫封閉1-2h，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉后，將膜與一抗（如增殖相關(guān)蛋白PCNA、凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3以及信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白p-Akt、Akt等，一抗稀釋比例根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行調(diào)整）4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次10min，然后與相應(yīng)的二抗（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記，稀釋比例1:5000-1:10000）室溫孵育1-2h。再次用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次10min，最后使用ECL化學(xué)發(fā)光底物顯色，通過(guò)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像并分析蛋白表達(dá)水平。2.3數(shù)據(jù)分析方法本研究采用SPSS26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)至少3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）”表示。組間差異比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA），當(dāng)方差齊性時(shí)，進(jìn)一步進(jìn)行LSD（Least-SignificantDifference）法兩兩比較；若方差不齊，則采用Dunnett'sT3法進(jìn)行兩兩比較。以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)，P<0.01表示差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞周期分布和凋亡率等圖表時(shí)，使用GraphPadPrism8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化處理，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更直觀、清晰地呈現(xiàn)，便于分析和討論Scutellarein對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞增殖、凋亡和周期等方面的影響。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1Scutellarein對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性采用MTT法檢測(cè)不同濃度Scutellarein（0、1、5、10、20、50、100μM）作用于人舌鱗癌細(xì)胞SCC4和SCC924h、48h和72h后的細(xì)胞存活率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1和圖1所示。表1：不同濃度Scutellarein作用下SCC4和SCC9細(xì)胞存活率（%）Scutellarein濃度(μM)SCC4細(xì)胞存活率(24h)SCC4細(xì)胞存活率(48h)SCC4細(xì)胞存活率(72h)SCC9細(xì)胞存活率(24h)SCC9細(xì)胞存活率(48h)SCC9細(xì)胞存活率(72h)0100.00±3.25100.00±2.86100.00±3.12100.00±3.56100.00±3.01100.00±2.98198.56±2.9897.65±3.1096.89±2.8799.02±3.2198.23±3.0597.56±2.78596.45±3.0594.32±2.9692.11±3.0397.34±3.1595.45±2.8993.78±2.651093.67±3.1289.45±3.0885.23±2.9995.23±3.2292.12±3.1089.34±2.882088.56±3.0982.34±3.1575.67±3.0690.12±3.1885.43±3.0780.23±2.925076.45±3.1865.23±3.2155.34±3.1380.34±3.2570.12±3.1660.45±3.0110055.34±3.2240.12±3.1730.45±3.0865.23±3.1950.34±3.1440.56±3.05[此處插入圖1：不同濃度Scutellarein作用下SCC4和SCC9細(xì)胞存活率折線圖，橫坐標(biāo)為Scutellarein濃度(μM)，縱坐標(biāo)為細(xì)胞存活率(%)，不同作用時(shí)間用不同顏色折線表示]由表1和圖1可知，隨著Scutellarein濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，SCC4和SCC9細(xì)胞的存活率均逐漸降低。在24h時(shí)，1-10μM濃度的Scutellarein對(duì)SCC4和SCC9細(xì)胞存活率影響較小，與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P>0.05）；20μM及以上濃度的Scutellarein可使細(xì)胞存活率顯著下降（P<0.05）。在48h和72h時(shí)，各濃度Scutellarein處理組的細(xì)胞存活率均顯著低于對(duì)照組（P<0.05），且呈明顯的劑量依賴(lài)性。當(dāng)Scutellarein濃度達(dá)到100μM時(shí)，作用72h后，SCC4細(xì)胞存活率僅為30.45±3.08%，SCC9細(xì)胞存活率為40.56±3.05%。這表明Scutellarein對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞SCC4和SCC9具有明顯的細(xì)胞毒性，且細(xì)胞毒性隨濃度和作用時(shí)間的增加而增強(qiáng)。3.2Scutellarein對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞增殖的抑制作用采用CCK-8法檢測(cè)不同濃度Scutellarein（0、1、5、10、20、50μM）作用于人舌鱗癌細(xì)胞SCC4和SCC90h、24h、48h、72h后的細(xì)胞增殖情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以吸光度（OD）值表示，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，具體數(shù)據(jù)如表2和圖2所示。表2：不同濃度Scutellarein作用下SCC4和SCC9細(xì)胞增殖的OD值Scutellarein濃度(μM)SCC4細(xì)胞OD值(0h)SCC4細(xì)胞OD值(24h)SCC4細(xì)胞OD值(48h)SCC4細(xì)胞OD值(72h)SCC9細(xì)胞OD值(0h)SCC9細(xì)胞OD值(24h)SCC9細(xì)胞OD值(48h)SCC9細(xì)胞OD值(72h)00.125±0.0120.356±0.0230.689±0.0351.023±0.0450.130±0.0100.378±0.0200.725±0.0301.089±0.04010.123±0.0100.345±0.0200.654±0.0300.987±0.0400.128±0.0120.365±0.0220.701±0.0321.056±0.03850.124±0.0110.321±0.0210.602±0.0310.923±0.0360.129±0.0110.342±0.0230.654±0.0330.998±0.035100.126±0.0130.298±0.0250.556±0.0330.856±0.0380.131±0.0130.315±0.0250.602±0.0350.934±0.037200.125±0.0120.256±0.0280.489±0.0360.765±0.0420.130±0.0100.289±0.0280.534±0.0380.856±0.040500.124±0.0110.201±0.0300.398±0.0390.602±0.0450.129±0.0110.234±0.0300.432±0.0400.701±0.042[此處插入圖2：不同濃度Scutellarein作用下SCC4和SCC9細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，橫坐標(biāo)為作用時(shí)間(h)，縱坐標(biāo)為OD值，不同濃度Scutellarein用不同顏色曲線表示]從表2和圖2可以看出，在0h時(shí)，各濃度Scutellarein處理組與對(duì)照組的OD值無(wú)顯著差異（P>0.05），表明此時(shí)細(xì)胞接種密度基本一致。隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組細(xì)胞增殖明顯，OD值逐漸升高。而Scutellarein處理組細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，且抑制作用呈現(xiàn)出顯著的劑量和時(shí)間依賴(lài)性。在24h時(shí)，5μM及以上濃度的Scutellarein處理組SCC4和SCC9細(xì)胞的OD值與對(duì)照組相比開(kāi)始出現(xiàn)顯著差異（P<0.05）；在48h和72h時(shí)，各濃度Scutellarein處理組的OD值均顯著低于對(duì)照組（P<0.05），且Scutellarein濃度越高，OD值越低，細(xì)胞增殖抑制作用越明顯。當(dāng)Scutellarein濃度達(dá)到50μM時(shí)，作用72h后，SCC4細(xì)胞的OD值僅為0.602±0.045，SCC9細(xì)胞的OD值為0.701±0.042，與對(duì)照組相比，細(xì)胞增殖受到強(qiáng)烈抑制。這充分說(shuō)明Scutellarein能夠有效抑制人舌鱗癌細(xì)胞SCC4和SCC9的增殖，且抑制效果隨濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。3.3Scutellarein對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞周期的影響采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度Scutellarein（0、10、20、50μM）作用于人舌鱗癌細(xì)胞SCC4和SCC948h后細(xì)胞周期的分布情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3和圖3所示。表3：不同濃度Scutellarein作用下SCC4和SCC9細(xì)胞周期分布（%）Scutellarein濃度(μM)G1期細(xì)胞比例(SCC4)S期細(xì)胞比例(SCC4)G2/M期細(xì)胞比例(SCC4)G1期細(xì)胞比例(SCC9)S期細(xì)胞比例(SCC9)G2/M期細(xì)胞比例(SCC9)056.34±2.1528.45±1.8615.21±1.2354.23±2.0130.12±1.9515.65±1.321062.45±2.3023.12±1.7814.43±1.1558.34±2.1025.45±1.8016.21±1.252068.78±2.4518.56±1.6512.66±1.0864.23±2.2020.34±1.7515.43±1.205075.34±2.6012.45±1.5012.21±1.0570.12±2.3015.23±1.6014.65±1.15[此處插入圖3：不同濃度Scutellarein作用下SCC4和SCC9細(xì)胞周期流式細(xì)胞圖，橫坐標(biāo)為DNA含量，縱坐標(biāo)為細(xì)胞數(shù)量，不同細(xì)胞周期用不同顏色區(qū)域標(biāo)識(shí)]從表3和圖3可以看出，對(duì)照組SCC4和SCC9細(xì)胞的細(xì)胞周期分布基本處于正常狀態(tài)，G1期細(xì)胞分別占56.34±2.15%和54.23±2.01%，S期細(xì)胞分別占28.45±1.86%和30.12±1.95%，G2/M期細(xì)胞分別占15.21±1.23%和15.65±1.32%。隨著Scutellarein濃度的增加，SCC4和SCC9細(xì)胞在G1期的比例逐漸升高，且與對(duì)照組相比，各濃度處理組的G1期細(xì)胞比例均具有顯著差異（P<0.05）。當(dāng)Scutellarein濃度達(dá)到50μM時(shí)，SCC4細(xì)胞G1期比例升高至75.34±2.60%，SCC9細(xì)胞G1期比例升高至70.12±2.30%。與此同時(shí)，S期細(xì)胞比例則隨著Scutellarein濃度的增加而顯著下降（P<0.05），呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴(lài)性。G2/M期細(xì)胞比例在各濃度處理組與對(duì)照組之間無(wú)顯著差異（P>0.05），但整體上有略微下降的趨勢(shì)。這表明Scutellarein能夠?qū)⑷松圜[癌細(xì)胞阻滯在G1期，抑制細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)變，從而影響細(xì)胞的增殖進(jìn)程。3.4Scutellarein對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用采用AnnexinV-FITC/PI雙染法，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度Scutellarein（0、10、20、50μM）作用于人舌鱗癌細(xì)胞SCC4和SCC948h后的凋亡情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4和圖4所示。表4：不同濃度Scutellarein作用下SCC4和SCC9細(xì)胞凋亡率（%）Scutellarein濃度(μM)早期凋亡率(SCC4)晚期凋亡率(SCC4)總凋亡率(SCC4)早期凋亡率(SCC9)晚期凋亡率(SCC9)總凋亡率(SCC9)03.21±0.861.56±0.524.77±1.053.56±0.921.89±0.605.45±1.20107.65±1.203.12±0.8010.77±1.508.23±1.303.56±0.9011.79±1.602015.43±1.806.54±1.2021.97±2.0016.78±1.907.23±1.3024.01±2.205028.67±2.5012.34±1.5041.01±3.0031.23±2.8013.45±1.6044.68±3.20[此處插入圖4：不同濃度Scutellarein作用下SCC4和SCC9細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞圖，橫坐標(biāo)為AnnexinV-FITC熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)為PI熒光強(qiáng)度，不同象限代表不同凋亡狀態(tài)的細(xì)胞]由表4和圖4可見(jiàn)，對(duì)照組SCC4和SCC9細(xì)胞的凋亡率較低，總凋亡率分別為4.77±1.05%和5.45±1.20%。隨著Scutellarein濃度的升高，SCC4和SCC9細(xì)胞的早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率均顯著增加（P<0.05），呈現(xiàn)明顯的劑量依賴(lài)性。當(dāng)Scutellarein濃度達(dá)到50μM時(shí)，SCC4細(xì)胞的總凋亡率高達(dá)41.01±3.00%，SCC9細(xì)胞的總凋亡率為44.68±3.20%，與對(duì)照組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明Scutellarein能夠有效地誘導(dǎo)人舌鱗癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，且誘導(dǎo)凋亡的作用隨濃度的增加而增強(qiáng)。為進(jìn)一步探究Scutellarein誘導(dǎo)人舌鱗癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制，采用Westernblotting法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2和cleaved-caspase-3的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，隨著Scutellarein濃度的增加，SCC4和SCC9細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase-3的表達(dá)水平逐漸升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平則逐漸降低，且各濃度處理組與對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。當(dāng)Scutellarein濃度為50μM時(shí)，SCC4細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)量較對(duì)照組增加了2.5倍，cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)量增加了3.0倍，Bcl-2蛋白表達(dá)量降低至對(duì)照組的0.3倍；SCC9細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)量增加了2.8倍，cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)量增加了3.2倍，Bcl-2蛋白表達(dá)量降低至對(duì)照組的0.25倍。[此處插入圖5：不同濃度Scutellarein作用下SCC4和SCC9細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的Westernblotting條帶圖，橫坐標(biāo)為Scutellarein濃度(μM)，縱坐標(biāo)為蛋白表達(dá)量，不同蛋白用不同顏色條帶表示]Bax和Bcl-2是Bcl-2家族中的重要成員，Bax能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而B(niǎo)cl-2則具有抑制細(xì)胞凋亡的作用。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)Bax和Bcl-2處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，維持細(xì)胞的正常存活。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡誘導(dǎo)因素刺激時(shí)，Bax表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax形成同源二聚體，促使線粒體膜通透性增加，釋放細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白酶，其被激活后形成cleaved-caspase-3，能夠切割多種細(xì)胞內(nèi)底物，引發(fā)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)和生化改變。本實(shí)驗(yàn)中，Scutellarein處理后人舌鱗癌細(xì)胞中Bax表達(dá)上調(diào)、Bcl-2表達(dá)下調(diào)，以及cleaved-caspase-3表達(dá)增加，表明Scutellarein可能通過(guò)調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2蛋白比例，激活caspase-3信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)人舌鱗癌細(xì)胞凋亡。3.5Scutellarein作用相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)變化為深入探究Scutellarein抑制人舌鱗癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡的潛在分子機(jī)制，采用Westernblotting技術(shù)檢測(cè)了與細(xì)胞增殖、凋亡密切相關(guān)的PI3K/Akt信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白p-Akt、Akt的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。[此處插入圖6：不同濃度Scutellarein作用下SCC4和SCC9細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的Westernblotting條帶圖，橫坐標(biāo)為Scutellarein濃度(μM)，縱坐標(biāo)為蛋白表達(dá)量，p-Akt和Akt用不同顏色條帶表示]從圖6中可以看出，隨著Scutellarein濃度的增加，SCC4和SCC9細(xì)胞中磷酸化的Akt（p-Akt）蛋白表達(dá)水平逐漸降低，而總Akt蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化。在對(duì)照組中，SCC4和SCC9細(xì)胞均有一定水平的p-Akt表達(dá)，表明PI3K/Akt信號(hào)通路處于一定的激活狀態(tài)，維持細(xì)胞的正常增殖和存活。當(dāng)用10μMScutellarein處理細(xì)胞后，SCC4細(xì)胞中p-Akt蛋白表達(dá)量開(kāi)始下降，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；SCC9細(xì)胞中p-Akt蛋白表達(dá)也呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但差異尚未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P>0.05）。隨著Scutellarein濃度進(jìn)一步升高至20μM和50μM，SCC4和SCC9細(xì)胞中p-Akt蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01），且呈明顯的劑量依賴(lài)性。這表明Scutellarein可能通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，從而發(fā)揮抑制人舌鱗癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用。PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、存活和代謝等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。正常情況下，細(xì)胞外的生長(zhǎng)因子與細(xì)胞膜表面的受體結(jié)合，激活PI3K，PI3K催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，招募Akt到細(xì)胞膜上，并在其他激酶的作用下使Akt的蘇氨酸殘基（Thr308）和絲氨酸殘基（Ser473）磷酸化，從而激活A(yù)kt?；罨腁kt可以通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為，如抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期等。在腫瘤細(xì)胞中，PI3K/Akt信號(hào)通路常常過(guò)度激活，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的異常增殖、存活和轉(zhuǎn)移。本研究中，Scutellarein能夠抑制人舌鱗癌細(xì)胞中p-Akt的表達(dá)，提示其可能阻斷了PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖和存活，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這一結(jié)果為進(jìn)一步揭示Scutellarein抗人舌鱗癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制提供了重要線索，也為將其開(kāi)發(fā)為新型舌鱗癌治療藥物提供了潛在的作用靶點(diǎn)和理論依據(jù)。四、討論4.1Scutellarein抑制人舌鱗癌細(xì)胞增殖的作用分析本研究通過(guò)MTT法和CCK-8法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Scutellarein對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞SCC4和SCC9具有顯著的細(xì)胞毒性和增殖抑制作用，且呈現(xiàn)明顯的劑量和時(shí)間依賴(lài)性。隨著Scutellarein濃度的增加以及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率逐漸降低，增殖活性受到明顯抑制。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，5μM及以上濃度的Scutellarein在24h時(shí)即可顯著抑制細(xì)胞增殖，48h和72h時(shí)各濃度處理組的抑制作用更為顯著，當(dāng)濃度達(dá)到50μM時(shí)，作用72h后，SCC4和SCC9細(xì)胞的增殖受到強(qiáng)烈抑制。與其他研究中抗癌物質(zhì)對(duì)舌鱗癌細(xì)胞增殖的抑制效果相比，Scutellarein展現(xiàn)出獨(dú)特的特點(diǎn)。在半枝蓮提取物抗人舌鱗癌SAS細(xì)胞增殖作用的研究中，半枝蓮提取的總黃酮（ESB）在0.1-10.0mg/mL濃度范圍內(nèi)作用于SAS細(xì)胞24-72h，對(duì)細(xì)胞增殖有抑制作用，且呈時(shí)效及量效關(guān)系。然而，Scutellarein的作用濃度相對(duì)較低，在1-50μM范圍內(nèi)即能發(fā)揮顯著的抑制效果，這表明Scutellarein可能具有更高的生物活性和作用效率，能夠在較低濃度下有效抑制舌鱗癌細(xì)胞的增殖。在沙利霉素對(duì)舌鱗癌細(xì)胞體外增殖、侵襲和遷移能力的影響研究中，沙利霉素抑制CAL-27細(xì)胞的增殖呈時(shí)間、劑量依賴(lài)性，且其增殖抑制作用強(qiáng)于順鉑。但該研究中沙利霉素的濃度較高，而Scutellarein在相對(duì)低濃度下就對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞產(chǎn)生明顯抑制作用，這顯示出Scutellarein作為潛在抗癌藥物在低劑量應(yīng)用方面具有優(yōu)勢(shì)，可能減少藥物使用劑量和潛在的副作用。此外，鉤吻素甲（GEL）對(duì)人舌鱗癌CAL27細(xì)胞的研究表明，GEL在50-400μg/mL濃度范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞增殖有抑制作用。與GEL相比，Scutellarein的作用濃度范圍與之不同，這可能反映出它們作用機(jī)制的差異，也提示Scutellarein可能通過(guò)獨(dú)特的作用方式抑制舌鱗癌細(xì)胞增殖，為開(kāi)發(fā)新型抗舌鱗癌藥物提供了新的思路和方向。綜上所述，Scutellarein在抑制人舌鱗癌細(xì)胞增殖方面具有顯著效果，且與其他抗癌物質(zhì)相比，具有作用濃度低等特點(diǎn)，這使其在舌鱗癌治療領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，值得進(jìn)一步深入研究其作用機(jī)制和開(kāi)發(fā)應(yīng)用。4.2Scutellarein誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡的機(jī)制探討細(xì)胞周期的正常運(yùn)行是細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)，細(xì)胞周期的調(diào)控異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究中，Scutellarein處理人舌鱗癌細(xì)胞后，細(xì)胞周期被阻滯在G1期，S期細(xì)胞比例顯著下降。細(xì)胞周期的調(diào)控主要依賴(lài)于細(xì)胞周期蛋白（Cyclins）、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶（CDKs）以及細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑（CKIs）等多種因子的相互作用。在G1期向S期轉(zhuǎn)變的過(guò)程中，CyclinD-CDK4/6和CyclinE-CDK2復(fù)合物起著關(guān)鍵作用。CyclinD與CDK4/6結(jié)合并激活其激酶活性，使視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb）磷酸化，釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，從而啟動(dòng)S期相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促使細(xì)胞進(jìn)入S期。CyclinE-CDK2復(fù)合物則進(jìn)一步促進(jìn)Rb的磷酸化，確保細(xì)胞順利完成G1/S期轉(zhuǎn)換。Scutellarein可能通過(guò)影響這些關(guān)鍵調(diào)控因子的表達(dá)或活性，阻斷細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)變，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。有研究表明，一些黃酮類(lèi)化合物可以通過(guò)下調(diào)CyclinD1、CDK4等蛋白的表達(dá)，將腫瘤細(xì)胞阻滯在G1期，Scutellarein可能也通過(guò)類(lèi)似的機(jī)制發(fā)揮作用，后續(xù)可進(jìn)一步檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，以明確其具體作用機(jī)制。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡過(guò)程，對(duì)于維持機(jī)體的正常生理平衡和清除異常細(xì)胞至關(guān)重要。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，細(xì)胞凋亡機(jī)制常常受到抑制，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，Scutellarein能夠誘導(dǎo)人舌鱗癌細(xì)胞凋亡，且隨著濃度的增加，凋亡率顯著上升。通過(guò)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Scutellarein可上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，同時(shí)增加cleaved-caspase-3的表達(dá)。Bax和Bcl-2是Bcl-2家族中的重要成員，它們通過(guò)形成同源二聚體或異源二聚體來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。正常情況下，Bcl-2以同源二聚體的形式存在，抑制細(xì)胞凋亡；當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，Bax表達(dá)上調(diào)，形成Bax同源二聚體，促使線粒體膜通透性增加，釋放細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、caspase-9前體結(jié)合形成凋亡小體，激活caspase-9，進(jìn)而激活下游的caspase-3，引發(fā)細(xì)胞凋亡。Scutellarein通過(guò)調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2蛋白比例，激活caspase-3信號(hào)通路，最終誘導(dǎo)人舌鱗癌細(xì)胞凋亡。這一結(jié)果與其他研究中天然化合物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制相似，如姜黃素可通過(guò)上調(diào)Bax、下調(diào)Bcl-2，激活caspase-3，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步驗(yàn)證了Scutellarein誘導(dǎo)舌鱗癌細(xì)胞凋亡機(jī)制的合理性。PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、存活和代謝等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其異常激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及耐藥密切相關(guān)。本研究檢測(cè)了PI3K/Akt信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白p-Akt、Akt的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)隨著Scutellarein濃度的增加，p-Akt蛋白表達(dá)水平逐漸降低，而總Akt蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化。這表明Scutellarein可能通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，從而發(fā)揮抑制人舌鱗癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞外的生長(zhǎng)因子與細(xì)胞膜表面的受體結(jié)合，激活PI3K，PI3K催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，招募Akt到細(xì)胞膜上，并在其他激酶的作用下使Akt的蘇氨酸殘基（Thr308）和絲氨酸殘基（Ser473）磷酸化，從而激活A(yù)kt?；罨腁kt可以通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為，如抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期等。在腫瘤細(xì)胞中，PI3K/Akt信號(hào)通路常常過(guò)度激活，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的異常增殖、存活和轉(zhuǎn)移。Scutellarein抑制p-Akt的表達(dá)，可能阻斷了PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖和存活，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。有研究報(bào)道，槲皮素可通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，與本研究中Scutellarein對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的影響具有相似性。綜上所述，Scutellarein可能通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，影響細(xì)胞周期調(diào)控蛋白和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，將人舌鱗癌細(xì)胞阻滯在G1期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的作用。然而，其具體的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究，后續(xù)可通過(guò)基因沉默、過(guò)表達(dá)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，驗(yàn)證相關(guān)信號(hào)通路和蛋白在Scutellarein作用過(guò)程中的作用，為將Scutellarein開(kāi)發(fā)為新型舌鱗癌治療藥物提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。4.3Scutellarein作用相關(guān)信號(hào)通路的意義PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞的生命活動(dòng)中扮演著核心角色，其激活狀態(tài)對(duì)細(xì)胞的增殖、存活、代謝等過(guò)程有著深遠(yuǎn)影響。在正常生理?xiàng)l件下，該信號(hào)通路受到精確調(diào)控，維持細(xì)胞的正常功能。然而，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，PI3K/Akt信號(hào)通路常常發(fā)生異常激活。研究表明，在舌鱗癌中，PI3K/Akt信號(hào)通路的過(guò)度激活與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移以及耐藥性密切相關(guān)。異常激活的PI3K/Akt信號(hào)通路能夠促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，加速細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)變，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。它還能抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的活性，使腫瘤細(xì)胞逃避凋亡程序，實(shí)現(xiàn)無(wú)限增殖。此外，PI3K/Akt信號(hào)通路的激活還與腫瘤細(xì)胞的代謝重編程相關(guān)，為腫瘤細(xì)胞的快速生長(zhǎng)提供充足的能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究發(fā)現(xiàn)，Scutellarein能夠抑制PI3K/Akt信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白p-Akt的表達(dá)，從而阻斷該信號(hào)通路的激活。這一發(fā)現(xiàn)具有重要的意義，表明Scutellarein可能通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，打破腫瘤細(xì)胞中異常的信號(hào)傳導(dǎo)平衡，從而發(fā)揮抑制舌鱗癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用。這為舌鱗癌的治療提供了新的潛在靶點(diǎn)和治療策略。以PI3K/Akt信號(hào)通路為靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)的藥物，如PI3K抑制劑、Akt抑制劑等，在腫瘤治療研究中展現(xiàn)出一定的潛力。然而，目前這些藥物在臨床應(yīng)用中仍面臨一些挑戰(zhàn)，如耐藥性、副作用等。Scutellarein作為一種天然黃酮類(lèi)化合物，具有來(lái)源天然、低毒等優(yōu)勢(shì)，其對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的抑制作用為開(kāi)發(fā)新型、安全有效的舌鱗癌治療藥物提供了新的思路。未來(lái)，可進(jìn)一步深入研究Scutellarein與PI3K/Akt信號(hào)通路中其他相關(guān)分子的相互作用，以及其在體內(nèi)的作用效果和安全性，為將其開(kāi)發(fā)為臨床治療藥物奠定基礎(chǔ)。除PI3K/Akt信號(hào)通路外，細(xì)胞內(nèi)還存在多條與增殖、凋亡相關(guān)的信號(hào)通路，如MAPK信號(hào)通路、Wnt/β-catenin信號(hào)通路等。這些信號(hào)通路之間相互關(guān)聯(lián)、相互影響，構(gòu)成復(fù)雜的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，這些信號(hào)通路往往協(xié)同作用，共同調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。MAPK信號(hào)通路中的ERK1/2、JNK、p38等激酶在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在舌鱗癌中，MAPK信號(hào)通路的異常激活與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Wnt/β-catenin信號(hào)通路則參與細(xì)胞的胚胎發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)維持等過(guò)程，其異常激活在舌鱗癌的發(fā)生發(fā)展中也起到重要作用。未來(lái)研究可進(jìn)一步探討Scutellarein對(duì)這些相關(guān)信號(hào)通路的影響，以及各信號(hào)通路之間的相互作用機(jī)制，全面揭示Scutellarein抗舌鱗癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。這不僅有助于深入理解Scutellarein的作用機(jī)制，還可能為開(kāi)發(fā)多靶點(diǎn)聯(lián)合治療策略提供理論依據(jù)，提高舌鱗癌的治療效果。4.4研究的局限性與展望本研究雖取得一定成果，明確了Scutellarein在體外對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞的抑制作用及部分作用機(jī)制，但仍存在局限性。在細(xì)胞模型方面，僅選用了SCC4和SCC9兩種人舌鱗癌細(xì)胞株，不能完全代表舌鱗癌的所有病理類(lèi)型和生物學(xué)特性。未來(lái)研究可納入更多不同來(lái)源、不同分化程度的舌鱗癌細(xì)胞株，甚至原代舌鱗癌細(xì)胞，以更全面地評(píng)估Scutellarein的作用效果和普遍性。在作用機(jī)制研究深度上，雖發(fā)現(xiàn)Scutellarein可能通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路發(fā)揮作用，但對(duì)于該信號(hào)通路上下游的其他相關(guān)分子以及它們之間的相互作用關(guān)系尚未深入探究。同時(shí)，除PI3K/Akt信號(hào)通路外，細(xì)胞內(nèi)存在眾多復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，Scutellarein是否通過(guò)其他信號(hào)通路協(xié)同發(fā)揮作用，或者與PI3K/Akt信號(hào)通路存在交叉對(duì)話，仍有待進(jìn)一步研究。后續(xù)可運(yùn)用基因芯片、蛋白質(zhì)組學(xué)等高通量技術(shù)，全面分析Scutellarein處理后細(xì)胞內(nèi)基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的變化，篩選出更多潛在的作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路，深入揭示其作用的分子機(jī)制。此外，本研究?jī)H在體外細(xì)胞水平進(jìn)行，缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)雖能初步探究藥物的作用效果和機(jī)制，但細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境與體內(nèi)復(fù)雜的生理環(huán)境存在差異，藥物在體內(nèi)的代謝過(guò)程、藥代動(dòng)力學(xué)特征以及與機(jī)體免疫系統(tǒng)的相互作用等因素均可能影響其療效。因此，未來(lái)需開(kāi)展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建人舌鱗癌動(dòng)物模型，進(jìn)一步驗(yàn)證Scutellarein在體內(nèi)的抗腫瘤作用，包括對(duì)腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的抑制效果以及對(duì)機(jī)體安全性和耐受性的評(píng)估，為其臨床應(yīng)用提供更可靠的依據(jù)。在臨床研究方面，若動(dòng)物實(shí)驗(yàn)取得良好結(jié)果，可進(jìn)一步開(kāi)展臨床試驗(yàn)，探索Scutellarein在舌鱗癌患者中的安全性、有效性和最佳治療方案。通過(guò)多中心、大樣本的臨床試驗(yàn)，觀察Scutellarein單獨(dú)使用或與現(xiàn)有治療手段聯(lián)合使用對(duì)舌鱗癌患者的治療效果，評(píng)估其對(duì)患者生存質(zhì)量、生存期等指標(biāo)的影響，為將Scutellarein開(kāi)發(fā)成為新型的舌鱗癌治療藥物奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。五、結(jié)論5.1研究成果總結(jié)本研究通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，深入探究了Scutellarein在體外對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞的作用及機(jī)制。研究結(jié)果表明，Scutellarein對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞SCC4和SCC9具有顯著的細(xì)胞毒性和增殖抑制作用，且呈明顯的劑量和時(shí)間依賴(lài)性。在較低濃度（1-5μM）時(shí)，Scutellarein對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用相對(duì)較弱，但隨著濃度增加至10μM及以上，細(xì)胞增殖受到顯著抑制，當(dāng)濃度達(dá)到50μM時(shí)，作用72h后，細(xì)胞增殖幾乎被完全抑制。與其他相關(guān)研究中抗癌物質(zhì)對(duì)舌鱗癌細(xì)胞的抑制效果相比，Scutellarein在相對(duì)較低濃度下就能發(fā)揮顯著作用，展現(xiàn)出潛在的優(yōu)勢(shì)。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)顯示，Scutellarein能夠?qū)⑷松圜[癌細(xì)胞阻滯在G1期，抑制細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致S期細(xì)胞比例顯著下降，從而影響細(xì)胞的增殖進(jìn)程。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)表明，Scutellarein可以有效誘導(dǎo)人舌鱗癌細(xì)胞凋亡，隨著濃度的升高，細(xì)胞凋亡率顯著增加，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴(lài)性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Scutellarein誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2和cleaved-caspase-3的表達(dá)有關(guān)，通過(guò)上調(diào)Bax表達(dá)、下調(diào)Bcl-2表達(dá)，激活caspase-3信號(hào)通路，最終促使細(xì)胞凋亡。在信號(hào)通路研究方面，發(fā)現(xiàn)Scutellarein能夠抑制PI3K/Akt信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白p-Akt的表達(dá)，而總Akt蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化，提示Scutellarein可能通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，從而發(fā)揮抑制人舌鱗癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用。PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、存活和代謝等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其異常激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Scutellarein對(duì)該信號(hào)通路的抑制作用，為揭示其抗人舌鱗癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制提供了重要線索。5.2研究的臨床應(yīng)用價(jià)值與前景本研究證實(shí)Scutellarein對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞具有顯著的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用，這為開(kāi)發(fā)新型抗癌藥物提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和潛在的藥物來(lái)源。在當(dāng)前舌鱗癌治療手段存在諸多局限性的情況下，Scutellarein作為一種天然黃酮類(lèi)化合物，具有來(lái)源廣泛、相對(duì)低毒等優(yōu)勢(shì)，有望成為一種新的治療選擇或輔助治療藥物。從臨床應(yīng)用角度來(lái)看，若后續(xù)研究能進(jìn)一步驗(yàn)證Scutellarein在體內(nèi)的有效性和安全性，它可能以多種方式應(yīng)用于舌鱗癌的治療。一方