丙型肝炎病毒腺病毒載體疫苗AdNSmut的構(gòu)建與免疫特性研究VIP

丙型肝炎病毒腺病毒載體疫苗AdNSmut的構(gòu)建與免疫特性研究一、引言1.1研究背景丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus，HCV）是一種單股正鏈RNA病毒，其感染是一個全球性的公共衛(wèi)生問題。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球HCV的感染率約為3%，估計約1.8億人感染HCV，每年新發(fā)丙型肝炎病例約3.5萬例。HCV感染后，約70%-85%的患者會發(fā)展為慢性感染，若不及時治療，慢性丙型肝炎可逐漸進展為肝纖維化、肝硬化，甚至肝細(xì)胞癌（HepatocellularCarcinoma，HCC）。肝硬化患者中，肝癌的發(fā)生率明顯高于普通人群，丙型肝炎病毒感染是肝癌的重要危險因素之一。此外，丙型肝炎還可能導(dǎo)致其他并發(fā)癥，如肝性腦病、腹水、靜脈曲張破裂出血等，嚴(yán)重時甚至危及生命，給患者的健康和生活帶來極大的負(fù)擔(dān)。目前，丙型肝炎的治療主要經(jīng)歷了傳統(tǒng)治療和直接抗病毒藥物（Direct-ActingAntiviralAgents，DAAs）治療兩個階段。傳統(tǒng)治療方法主要是利巴韋林與干擾素聯(lián)用，但這種治療方案毒副作用較大，患者往往難以耐受，且持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答率（SustainedVirologicalResponse，SVR）較低，僅為50%-60%。隨著醫(yī)學(xué)研究的不斷進步，DAAs的出現(xiàn)為丙型肝炎的治療帶來了新的希望。DAAs能夠直接作用于HCV的蛋白酶、聚合酶等關(guān)鍵靶點，有效抑制病毒復(fù)制，在某些地區(qū)其持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答率高達90%以上。然而，DAAs治療也存在諸多局限性：首先，對于已經(jīng)發(fā)展到疾病晚期的患者，DAAs藥物無法逆轉(zhuǎn)肝臟的惡性化進展；其次，DAAs藥物價格昂貴，許多患者經(jīng)濟上難以承受，這在一定程度上限制了其廣泛應(yīng)用；再者，DAAs對于某些亞型HCV感染的治療效果較差，不能滿足所有患者的治療需求；此外，藥物的使用并不能防止新發(fā)感染，且病毒在治療過程中容易出現(xiàn)耐藥性變異。對于接受DAAs治療且目前或曾經(jīng)感染過HBV的患者，再次感染還可能導(dǎo)致嚴(yán)重肝損傷甚至死亡。鑒于HCV感染的嚴(yán)重危害以及現(xiàn)有治療方法的局限性，研發(fā)安全有效的HCV疫苗成為預(yù)防和控制丙型肝炎傳播的關(guān)鍵策略。疫苗作為一種主動免疫制劑，通過激發(fā)人體自身的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對HCV的特異性免疫反應(yīng)，從而達到預(yù)防感染的目的。與治療性藥物相比，疫苗具有預(yù)防疾病發(fā)生、減少醫(yī)療資源消耗、降低疾病傳播風(fēng)險等優(yōu)勢。目前，HCV疫苗的研發(fā)是全球醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點之一，眾多科研團隊致力于開發(fā)新型的HCV疫苗，以滿足臨床需求。1.2HCV研究現(xiàn)狀1.2.1HCV病毒學(xué)特性HCV屬于黃病毒科（Flaviviridae）肝炎病毒屬（Hepacivirus），其病毒粒子呈球形，直徑約為55-65nm。病毒核心由單股正鏈RNA和核心蛋白組成，外面包裹著一層來自宿主細(xì)胞膜的包膜，包膜上鑲嵌著糖蛋白E1和E2，它們在病毒與宿主細(xì)胞的識別和融合過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。HCV基因組長度約為9.6kb，包含一個開放閱讀框（OpenReadingFrame，ORF），編碼一個由約3010個氨基酸組成的多聚蛋白前體。該多聚蛋白前體在宿主細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過病毒自身編碼的蛋白酶以及宿主細(xì)胞蛋白酶的作用，切割加工成10種成熟的病毒蛋白，包括3種結(jié)構(gòu)蛋白（核心蛋白C、包膜蛋白E1和E2）和7種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B和p7）。其中，核心蛋白C參與病毒粒子的組裝，包膜蛋白E1和E2決定病毒的感染性和免疫原性；非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯以及逃避宿主免疫監(jiān)視等過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。例如，NS3蛋白具有絲氨酸蛋白酶和螺旋酶活性，在病毒多聚蛋白的加工和RNA復(fù)制中起關(guān)鍵作用；NS5B蛋白是RNA依賴的RNA聚合酶，負(fù)責(zé)病毒基因組的復(fù)制。1.2.2HCV型別和分布HCV具有高度的遺傳異質(zhì)性，根據(jù)其基因組核苷酸序列的差異，可分為至少7個基因型和90多個亞型。不同基因型和亞型在全球的分布存在明顯的地域差異?；蛐?是全球范圍內(nèi)最常見的基因型，約占所有HCV感染的46%，在歐美國家尤為普遍；基因型2和3在亞洲、非洲等地區(qū)較為常見；基因型4主要分布在非洲和中東地區(qū)；基因型5主要在南非流行；基因型6多見于東南亞地區(qū)；基因型7則較為罕見，主要在加拿大發(fā)現(xiàn)。在中國，HCV基因型的分布也呈現(xiàn)出一定的地域特點?？傮w上，基因型1b和2a是主要的流行基因型，其中基因型1b約占56.8%，基因型2a約占24.1%。在北方地區(qū)，基因型1b的比例相對較高；而在南方地區(qū)，基因型2a的感染率相對較高。此外，不同基因型的HCV在疾病的進展速度、對治療的反應(yīng)等方面也存在差異。例如，基因型1感染通常比其他基因型更容易導(dǎo)致慢性化，且對傳統(tǒng)的干擾素聯(lián)合利巴韋林治療的應(yīng)答率較低。1.2.3HCV免疫應(yīng)答人體感染HCV后，免疫系統(tǒng)會啟動一系列的免疫應(yīng)答來試圖清除病毒。固有免疫應(yīng)答是機體抵御HCV感染的第一道防線，在感染早期發(fā)揮重要作用。模式識別受體（PatternRecognitionReceptors，PRRs）如Toll樣受體（Toll-likeReceptors，TLRs）和維甲酸誘導(dǎo)基因I（RetinoicAcid-InducibleGeneI，RIG-I）等能夠識別HCV的病原體相關(guān)分子模式（Pathogen-AssociatedMolecularPatterns，PAMPs），激活下游信號通路，誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素（Interferons，IFNs）等細(xì)胞因子。IFNs通過與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活一系列干擾素刺激基因（Interferon-StimulatedGenes，ISGs）的表達，從而發(fā)揮抗病毒作用，抑制病毒的復(fù)制。然而，HCV能夠通過多種機制逃避固有免疫應(yīng)答的攻擊。例如，HCV的非結(jié)構(gòu)蛋白NS3/4A可以切割TRIF、MAVS等信號分子，阻斷IFN信號通路的激活，從而抑制IFN的產(chǎn)生和抗病毒效應(yīng)。此外，HCV感染還會導(dǎo)致NK細(xì)胞功能受損，降低其對感染細(xì)胞的殺傷能力。適應(yīng)性免疫應(yīng)答在HCV感染的控制和清除中起著關(guān)鍵作用，包括細(xì)胞免疫和體液免疫。細(xì)胞免疫方面，CD4+輔助性T細(xì)胞（Th）和CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）是主要的效應(yīng)細(xì)胞。CD4+Th細(xì)胞能夠分泌細(xì)胞因子，輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體、激活CD8+CTL細(xì)胞以及調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞的功能。CD8+CTL細(xì)胞可以識別并殺傷被HCV感染的細(xì)胞，通過釋放穿孔素和顆粒酶等物質(zhì)，直接導(dǎo)致感染細(xì)胞的凋亡，或者分泌IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子，抑制病毒的復(fù)制。研究表明，持續(xù)有效的CD8+CTL應(yīng)答與HCV的清除密切相關(guān)，而CD8+CTL功能的耗竭或缺失則與慢性感染的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。體液免疫方面，HCV感染后機體可產(chǎn)生多種特異性抗體，包括針對包膜蛋白E1、E2的抗體，以及針對非結(jié)構(gòu)蛋白的抗體?？笶1E2抗體能夠中和病毒，阻斷病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合和感染。然而，由于HCV的高度變異，其包膜蛋白抗原性不斷變化，導(dǎo)致抗體難以有效中和變異的病毒株，這也是HCV感染易慢性化的原因之一。此外，HCV感染還會誘導(dǎo)產(chǎn)生自身抗體，如抗核抗體、抗平滑肌抗體等，這些自身抗體可能參與肝臟的免疫損傷，加重病情。1.2.4HCV治療現(xiàn)狀目前，丙型肝炎的治療主要經(jīng)歷了傳統(tǒng)治療和直接抗病毒藥物（DAAs）治療兩個階段。傳統(tǒng)治療方法主要是利巴韋林與干擾素聯(lián)用。干擾素是一種具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等多種功能的細(xì)胞因子，利巴韋林則是一種核苷類似物，具有廣譜抗病毒活性。二者聯(lián)合使用能夠在一定程度上抑制HCV的復(fù)制，治療持續(xù)時間通常為24-48周。然而，這種治療方案存在諸多局限性。首先，毒副作用較大，常見的不良反應(yīng)包括流感樣癥狀、骨髓抑制、精神癥狀等，許多患者難以耐受；其次，持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答率（SVR）較低，僅為50%-60%，尤其是對于基因型1感染的患者，SVR率更低。隨著對HCV病毒學(xué)和發(fā)病機制研究的深入，DAAs應(yīng)運而生。DAAs能夠直接作用于HCV的蛋白酶、聚合酶、解旋酶等關(guān)鍵靶點，特異性地抑制病毒復(fù)制。目前，臨床上常用的DAAs藥物主要包括NS3/4A蛋白酶抑制劑（如simeprevir、paritaprevir等）、NS5A抑制劑（如ledipasvir、daclatasvir等）和NS5B聚合酶抑制劑（如sofosbuvir、dasabuvir等）。這些藥物可以單獨使用，也可以聯(lián)合使用，形成不同的治療方案。與傳統(tǒng)治療方案相比，DAAs具有更高的SVR率，在某些地區(qū)其SVR率高達90%以上。此外，DAAs治療療程相對較短，一般為8-12周，且毒副作用較小，患者耐受性好。然而，DAAs治療也并非完美無缺。首先，對于已經(jīng)發(fā)展到疾病晚期（如肝硬化失代償期）的患者，DAAs藥物雖然能夠有效抑制病毒復(fù)制，但無法逆轉(zhuǎn)肝臟的惡性化進展，患者仍面臨較高的肝臟相關(guān)并發(fā)癥和死亡風(fēng)險。其次，DAAs藥物價格昂貴，尤其是在一些發(fā)展中國家，許多患者經(jīng)濟上難以承受，這在很大程度上限制了其廣泛應(yīng)用。再者，不同基因型的HCV對DAAs的敏感性存在差異，某些基因型（如基因3型）或亞型的HCV感染對DAAs的治療效果相對較差，不能滿足所有患者的治療需求。此外，長期使用DAAs治療過程中，病毒容易出現(xiàn)耐藥性變異，導(dǎo)致治療失敗。對于接受DAAs治療且目前或曾經(jīng)感染過HBV的患者，再次感染還可能導(dǎo)致嚴(yán)重肝損傷甚至死亡。因此，開發(fā)更加安全、有效、經(jīng)濟且適用范圍廣的HCV治療方法，仍然是當(dāng)前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要研究方向。1.3HCV疫苗研究進展HCV疫苗的研發(fā)是一個極具挑戰(zhàn)性但又至關(guān)重要的領(lǐng)域，多年來眾多科研團隊在此投入大量精力，取得了一定的進展。目前，HCV疫苗的研發(fā)策略主要包括重組蛋白疫苗、多肽疫苗、DNA疫苗和病毒載體疫苗等，各類疫苗在研發(fā)過程中展現(xiàn)出各自的特點和優(yōu)勢，也面臨著不同的問題和挑戰(zhàn)。重組蛋白疫苗是最早開展研究的HCV疫苗類型之一，其原理是通過基因工程技術(shù)表達并純化HCV的結(jié)構(gòu)蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白，以此作為免疫原刺激機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。例如，一些研究選擇HCV的包膜蛋白E1和E2作為重組蛋白疫苗的抗原，因為它們是病毒與宿主細(xì)胞結(jié)合的關(guān)鍵蛋白，能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體。然而，由于HCV的高度變異性，包膜蛋白的抗原性差異較大，導(dǎo)致重組蛋白疫苗對不同基因型HCV的交叉保護能力有限。此外，重組蛋白的表達和純化過程較為復(fù)雜，成本較高，也在一定程度上限制了其廣泛應(yīng)用。多肽疫苗則是根據(jù)HCV蛋白的氨基酸序列，人工合成具有免疫原性的多肽片段作為疫苗。這些多肽片段通常選擇病毒蛋白中保守的區(qū)域，以期望激發(fā)針對不同基因型HCV的免疫反應(yīng)。多肽疫苗的優(yōu)點是制備相對簡單，安全性較高，且能夠精確地針對特定的免疫靶點。但它也存在明顯的缺點，多肽的免疫原性較弱，需要與佐劑聯(lián)合使用才能增強免疫效果，而且多肽的穩(wěn)定性較差，在體內(nèi)的半衰期較短。DNA疫苗是將編碼HCV抗原的基因直接導(dǎo)入宿主細(xì)胞，通過宿主細(xì)胞自身的表達系統(tǒng)合成抗原，從而激發(fā)免疫反應(yīng)。DNA疫苗具有易于構(gòu)建、生產(chǎn)成本低、可誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫等優(yōu)點。然而，DNA疫苗在臨床應(yīng)用中也面臨一些問題，如轉(zhuǎn)染效率較低、抗原表達量有限以及可能存在的整合風(fēng)險等，這些問題限制了其免疫效果和安全性。病毒載體疫苗是近年來HCV疫苗研發(fā)的熱點方向之一，它利用病毒作為載體，將HCV的抗原基因?qū)胨拗骷?xì)胞，借助病毒載體的感染性和免疫原性，激發(fā)機體產(chǎn)生強烈的免疫反應(yīng)。目前，常用的病毒載體包括腺病毒載體、痘病毒載體、慢病毒載體等。腺病毒載體疫苗以其獨特的優(yōu)勢在HCV疫苗研發(fā)中脫穎而出。腺病毒具有廣泛的宿主范圍和高效的感染能力，能夠?qū)⑼庠椿蚋咝У貙?dǎo)入多種細(xì)胞類型。同時，腺病毒載體疫苗安全性高，一般不會整合到宿主基因組中，減少了潛在的致癌風(fēng)險。此外，腺病毒載體可以通過多種途徑接種，如肌肉注射、滴鼻、口服等，方便快捷。而且，腺病毒載體疫苗能夠誘導(dǎo)強大的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，尤其是細(xì)胞免疫反應(yīng)對于清除HCV感染細(xì)胞至關(guān)重要。例如，一些研究表明，腺病毒載體疫苗可以有效地激活CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞，產(chǎn)生針對HCV的特異性殺傷活性和細(xì)胞因子分泌。在臨床前研究和部分臨床試驗中，腺病毒載體疫苗展現(xiàn)出良好的免疫原性和安全性，為HCV疫苗的研發(fā)帶來了新的希望。盡管HCV疫苗的研發(fā)取得了一定的進展，但目前仍沒有一款疫苗能夠成功上市并廣泛應(yīng)用。主要的挑戰(zhàn)在于HCV的高度遺傳異質(zhì)性，不同基因型和亞型之間的抗原差異較大，使得研發(fā)具有廣泛交叉保護作用的疫苗難度巨大。此外，HCV感染后免疫逃逸機制復(fù)雜，病毒能夠通過多種方式逃避宿主免疫系統(tǒng)的識別和攻擊，這也給疫苗的設(shè)計和研發(fā)帶來了極大的困難。未來，需要進一步深入研究HCV的病毒學(xué)特性、免疫逃逸機制以及宿主免疫應(yīng)答的規(guī)律，結(jié)合先進的生物技術(shù)和疫苗設(shè)計理念，開發(fā)出更加安全、有效的HCV疫苗。1.4研究目的與意義本研究旨在構(gòu)建一種新型的HCV腺病毒載體疫苗AdNSmut，并對其進行免疫評價，為HCV疫苗的研發(fā)提供新的思路和實驗依據(jù)。具體研究目的如下：構(gòu)建攜帶HCVNS3-5Bmut基因的重組腺病毒載體：通過基因工程技術(shù)，將經(jīng)過定點突變使RNA聚合酶失去活性的HCVNS3-NS5Bmut片段，克隆到腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC315中，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒。再將重組穿梭質(zhì)粒與腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，獲得復(fù)制缺陷型重組腺病毒AdNSmut，并對其進行擴增、純化和鑒定，確保其能夠穩(wěn)定、高效地表達目的蛋白。評價AdNSmut疫苗的免疫原性：以C57BL/6小鼠為動物模型，采用不同劑量的AdNSmut疫苗進行肌肉注射免疫，通過Elispot和流式胞內(nèi)染色等技術(shù)檢測小鼠的細(xì)胞免疫反應(yīng)，同時通過眼球取血檢測體液免疫反應(yīng)，全面評估AdNSmut疫苗在小鼠體內(nèi)激發(fā)的免疫應(yīng)答水平，確定其免疫原性強弱。為HCV候選疫苗的臨床前評價提供參考：通過本研究，深入了解AdNSmut疫苗在小鼠體內(nèi)的免疫效果和安全性，探索最佳的免疫接種方案，包括疫苗劑量、接種途徑和免疫程序等，為后續(xù)HCV候選疫苗的臨床前評價提供可供選擇的免疫原和科學(xué)合理的接種方案，推動HCV疫苗從實驗室研究向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化。丙型肝炎作為一個全球性的公共衛(wèi)生問題，嚴(yán)重威脅著人類的健康和生命安全。目前，雖然直接抗病毒藥物（DAAs）在丙型肝炎治療中取得了一定的成效，但其存在諸多局限性，如無法逆轉(zhuǎn)肝臟的惡性化進展、價格昂貴、對某些亞型治療效果不佳、易出現(xiàn)耐藥性變異以及不能預(yù)防新發(fā)感染等。因此，研發(fā)安全有效的HCV疫苗是預(yù)防和控制丙型肝炎傳播的關(guān)鍵策略。腺病毒載體疫苗因其具有安全性高、免疫原性強、能夠誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫等優(yōu)點，成為HCV疫苗研發(fā)的重要方向之一。本研究構(gòu)建的AdNSmut疫苗，選擇了能激發(fā)顯著細(xì)胞免疫的1b型HCVNS3-5Bmut片段作為免疫原，有望克服HCV高度遺傳異質(zhì)性帶來的疫苗研發(fā)難題，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生針對HCV的特異性免疫反應(yīng)，尤其是強大的細(xì)胞免疫反應(yīng)，有效清除感染細(xì)胞，預(yù)防HCV感染。此外，本研究對AdNSmut疫苗的免疫評價，將為腺病毒載體疫苗在HCV疫苗研發(fā)領(lǐng)域的應(yīng)用提供重要的實驗數(shù)據(jù)和理論支持，有助于進一步優(yōu)化疫苗設(shè)計和免疫策略，提高疫苗的有效性和安全性。這不僅對于丙型肝炎的預(yù)防和控制具有重要的現(xiàn)實意義，還可能為其他病毒性疾病的疫苗研發(fā)提供有益的借鑒，推動整個疫苗研發(fā)領(lǐng)域的技術(shù)進步和發(fā)展。二、材料與方法2.1實驗材料2.1.1實驗動物選用6-8周齡的雌性C57BL/6小鼠，體重18-22g。C57BL/6小鼠是近交系小鼠，具有基因純合度高、遺傳背景清楚、個體差異小等優(yōu)點，在免疫學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用，能夠為實驗結(jié)果提供穩(wěn)定可靠的動物模型基礎(chǔ)。小鼠購自[動物供應(yīng)商名稱]，飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、相對濕度（50±10）%的SPF級動物房，自由進食和飲水，適應(yīng)環(huán)境1周后開始實驗。2.1.2試劑與耗材實驗所需試劑包括：TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶（如BamHI、HindIII等）、T4DNA連接酶、DNAMarker、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒、胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）、DMEM培養(yǎng)基（Dulbecco'sModifiedEagleMedium）、青霉素-鏈霉素雙抗、RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、SDS凝膠制備試劑盒、Westernblot相關(guān)試劑（如PVDF膜、一抗、二抗、ECL化學(xué)發(fā)光液）、Elispot檢測試劑盒、流式細(xì)胞術(shù)相關(guān)試劑（如細(xì)胞固定液、破膜液、熒光標(biāo)記抗體）等，以上試劑均購自[試劑供應(yīng)商名稱]。菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞株如下：大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC315、腺病毒骨架質(zhì)粒、人胚腎293A細(xì)胞（293A細(xì)胞），均由本實驗室保存；含有HCV1b型NS3-NS5B基因的質(zhì)粒由[質(zhì)粒來源方]提供。主要儀器與耗材有：PCR儀、高速冷凍離心機、低溫離心機、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱、超凈工作臺、倒置顯微鏡、酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀、凝膠成像系統(tǒng)、核酸蛋白分析儀、移液器、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、離心管、移液槍頭、一次性注射器、針頭、透析袋等。2.1.3主要溶液配置LB培養(yǎng)基：稱取胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉10g，加入800mL去離子水，攪拌溶解后，用5mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至7.4，定容至1000mL，高壓蒸汽滅菌（121℃，20min）后備用。若配置LB固體培養(yǎng)基，則在上述液體培養(yǎng)基中加入15g瓊脂粉，高壓滅菌后倒平板。氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）儲存液：稱取Amp1g，溶于10mL去離子水中，0.22μm濾膜過濾除菌，分裝后-20℃保存，使用終濃度為100μg/mL?？敲顾兀↘anamycin，Kan）儲存液：稱取Kan1g，溶于10mL去離子水中，0.22μm濾膜過濾除菌，分裝后-20℃保存，使用終濃度為50μg/mL。PBS緩沖液（pH7.4）：稱取NaCl8g、KCl0.2g、Na?HPO?1.44g、KH?PO?0.24g，加入800mL去離子水，攪拌溶解后，用HCl調(diào)節(jié)pH至7.4，定容至1000mL，高壓蒸汽滅菌（121℃，20min）后備用。細(xì)胞裂解液（RIPA）：含50mmol/LTris-HCl（pH7.4）、150mmol/LNaCl、1%TritonX-100、0.1%SDS、0.5%脫氧膽酸鈉，臨用前加入蛋白酶抑制劑PMSF，使其終濃度為1mmol/L。SDS凝膠電泳相關(guān)溶液：30%丙烯酰胺溶液（29:1）、1.5mol/LTris-HCl（pH8.8）、1.0mol/LTris-HCl（pH6.8）、10%SDS、10%過硫酸銨（APS）、TEMED（N,N,N',N'-四甲基乙二胺）、電泳緩沖液（含25mmol/LTris、192mmol/L甘氨酸、0.1%SDS）、轉(zhuǎn)膜緩沖液（含25mmol/LTris、192mmol/L甘氨酸、20%甲醇）。Westernblot封閉液：5%脫脂奶粉（w/v）溶于TBST緩沖液（含20mmol/LTris-HCl，pH7.6，150mmol/LNaCl，0.1%Tween-20）。Elispot包被液：用無菌PBS稀釋相應(yīng)的捕獲抗體，使其達到合適的工作濃度。Elispot洗滌液：含0.05%Tween-20的PBS。Elispot顯色液：按照Elispot檢測試劑盒說明書進行配制。2.2實驗方法2.2.1攜帶HCVNS3-5Bmut基因重組穿梭載體的構(gòu)建根據(jù)GenBank中登錄的HCV1b型NS3-NS5B基因序列（登錄號：[具體登錄號]），利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計特異性引物。上游引物5'-[包含BamHI酶切位點及保護堿基]-ATG[起始密碼子及部分NS3基因序列]-3'，下游引物5'-[包含HindIII酶切位點及保護堿基]-TAA[終止密碼子及部分NS5B基因序列]-3'。以含有HCV1b型NS3-NS5B基因的質(zhì)粒為模板，進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系（50μL）包括：10×PCR緩沖液5μL，dNTPs（2.5mmol/Leach）4μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，模板DNA1μL，ddH?O37.5μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸3min，共35個循環(huán)；72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用膠回收試劑盒回收目的片段。采用定點突變技術(shù)使NS5B基因發(fā)生突變，使其編碼的RNA聚合酶失去活性。根據(jù)定點突變試劑盒說明書，設(shè)計包含突變位點的引物，以PCR擴增得到的NS3-NS5B片段為模板進行定點突變反應(yīng)。反應(yīng)完成后，將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落進行PCR鑒定和測序驗證，確保突變成功，獲得NS3-NS5Bmut片段。用BamHI和HindIII對NS3-NS5Bmut片段和腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC315進行雙酶切，酶切體系（20μL）分別為：10×緩沖液2μL，NS3-NS5Bmut片段或pDC315質(zhì)粒2μg，BamHI和HindIII各1μL，ddH?O補足至20μL。37℃酶切3h后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收酶切片段。將回收的NS3-NS5Bmut酶切片段與pDC315酶切載體片段用T4DNA連接酶進行連接，連接體系（10μL）為：10×T4DNA連接酶緩沖液1μL，NS3-NS5Bmut酶切片段3μL，pDC315酶切載體片段1μL，T4DNA連接酶1μL，ddH?O4μL。16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落，接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，進行雙酶切鑒定和測序驗證，確認(rèn)重組穿梭質(zhì)粒pDC315-NSmut構(gòu)建成功。2.2.2重組穿梭質(zhì)粒的瞬時轉(zhuǎn)染與蛋白表達鑒定將人胚腎293A細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入2mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達到70%-80%時進行轉(zhuǎn)染。按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染操作。將重組穿梭質(zhì)粒pDC315-NSmut和空質(zhì)粒pDC315（作為陰性對照）分別用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋，同時將Lipofectamine2000試劑也用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋，室溫孵育5min。然后將兩者混合，輕輕混勻，室溫孵育20min，形成DNA-Lipofectamine2000復(fù)合物。將6孔板中的培養(yǎng)基吸出，用PBS洗滌細(xì)胞2次，每孔加入1.5mL無血清DMEM培養(yǎng)基，再將DNA-Lipofectamine2000復(fù)合物逐滴加入孔中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4-6h后，吸出培養(yǎng)基，每孔加入2mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72h。轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，加入適量RIPA裂解液，冰上裂解30min。4℃、12000r/min離心15min，收集上清，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取適量蛋白樣品，加入5×SDS上樣緩沖液，煮沸5min使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉液在室溫下封閉PVDF膜1-2h，封閉后用TBST緩沖液洗滌3次，每次10min。分別加入抗HCVNS3和NS5B的一抗（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1-2h。用TBST緩沖液洗滌3次，每次10min后，加入ECL化學(xué)發(fā)光液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光顯影，檢測目的蛋白的表達。同時，進行免疫熒光鑒定。將轉(zhuǎn)染后的293A細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h。取出蓋玻片，用PBS洗滌3次，每次5min。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min，PBS洗滌3次，每次5min。用0.1%TritonX-100通透細(xì)胞10min，PBS洗滌3次，每次5min。用5%BSA封閉液室溫封閉30min。分別加入抗HCVNS3和NS5B的一抗（1:200稀釋），4℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌3次，每次5min，加入FITC或TRITC標(biāo)記的二抗（1:200稀釋），室溫避光孵育1h。用PBS洗滌3次，每次5min，用DAPI染核5min。用PBS洗滌3次，每次5min后，將蓋玻片置于載玻片上，用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察目的蛋白的表達和定位。2.2.3復(fù)制缺陷型重組腺病毒構(gòu)建和空斑純化將重組穿梭質(zhì)粒pDC315-NSmut和腺病毒骨架質(zhì)粒用PmeI單酶切進行線性化處理。酶切體系（20μL）為：10×緩沖液2μL，重組穿梭質(zhì)粒pDC315-NSmut或腺病毒骨架質(zhì)粒2μg，PmeI1μL，ddH?O補足至20μL。37℃酶切3h后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確保質(zhì)粒完全線性化。將線性化的重組穿梭質(zhì)粒pDC315-NSmut和腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前24h，將293A細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入2mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達到50%-70%。按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行共轉(zhuǎn)染操作，將線性化的重組穿梭質(zhì)粒pDC315-NSmut和腺病毒骨架質(zhì)粒用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋，同時將Lipofectamine2000試劑也用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋，室溫孵育5min。然后將兩者混合，輕輕混勻，室溫孵育20min，形成DNA-Lipofectamine2000復(fù)合物。將6孔板中的培養(yǎng)基吸出，用PBS洗滌細(xì)胞2次，每孔加入1.5mL無血清DMEM培養(yǎng)基，再將DNA-Lipofectamine2000復(fù)合物逐滴加入孔中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4-6h后，吸出培養(yǎng)基，每孔加入2mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后，每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CytopathicEffect，CPE）。一般在轉(zhuǎn)染后7-14天，可觀察到細(xì)胞出現(xiàn)明顯的CPE，如細(xì)胞變圓、腫脹、脫落等。當(dāng)觀察到約50%的細(xì)胞出現(xiàn)CPE時，收集細(xì)胞及上清，反復(fù)凍融3次（-80℃冰箱和37℃水浴交替進行），使細(xì)胞裂解，釋放病毒。將裂解后的細(xì)胞懸液4℃、5000r/min離心10min，收集上清，即為重組腺病毒的粗提液。取重組腺病毒粗提液，進行空斑純化。將293A細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入2mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達到90%以上。將重組腺病毒粗提液進行10倍系列稀釋，從10?1至10?1?。取不同稀釋度的病毒液100μL，分別加入到6孔板的細(xì)胞中，每個稀釋度做3個復(fù)孔。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱中吸附1h，期間每隔15min輕輕搖晃一次培養(yǎng)板，使病毒液均勻分布。吸附結(jié)束后，吸出病毒液，每孔加入2mL含0.8%低熔點瓊脂糖的DMEM培養(yǎng)基（預(yù)先加熱融化并冷卻至45℃左右，加入10%胎牛血清和雙抗），輕輕搖勻，待瓊脂糖凝固后，置于37℃、5%CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。每天觀察空斑形成情況，一般在培養(yǎng)3-7天后，可觀察到細(xì)胞單層上出現(xiàn)圓形、透亮的空斑。用無菌的200μL移液器槍頭挑取單個空斑，加入到含有1mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的離心管中，反復(fù)吹打使空斑中的病毒釋放。將含有病毒的培養(yǎng)基接種到新的293A細(xì)胞中進行擴增，重復(fù)空斑純化操作3次，以獲得純化的重組腺病毒AdNSmut。2.2.4復(fù)制缺陷型重組腺病毒AdNSmut穩(wěn)定株的擴增和純化將純化后的重組腺病毒AdNSmut接種到長滿單層的293A細(xì)胞中進行擴增。接種前，將293A細(xì)胞接種于75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每瓶加入10mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達到90%以上。取適量純化的重組腺病毒AdNSmut，加入到培養(yǎng)瓶中，使病毒感染復(fù)數(shù)（MultiplicityofInfection，MOI）為0.1-1。將培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱中吸附1h，期間每隔15min輕輕搖晃一次培養(yǎng)瓶，使病毒均勻感染細(xì)胞。吸附結(jié)束后，吸出病毒液，每瓶加入10mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞病變情況，當(dāng)約80%-90%的細(xì)胞出現(xiàn)CPE時，收集細(xì)胞及上清。將收集的細(xì)胞及上清反復(fù)凍融3次（-80℃冰箱和37℃水浴交替進行），使細(xì)胞裂解，釋放病毒。將裂解后的細(xì)胞懸液4℃、5000r/min離心10min，收集上清，即為重組腺病毒AdNSmut的擴增液。采用CsCl密度梯度離心法對重組腺病毒AdNSmut進行純化。取適量重組腺病毒AdNSmut擴增液，加入到含有CsCl溶液的超速離心管中，使CsCl的最終密度為1.4g/mL。將超速離心管平衡后，放入超速離心機中，4℃、35000r/min離心18-24h。離心結(jié)束后，用注射器小心吸取離心管中位于中間的藍白色病毒帶，轉(zhuǎn)移至新的離心管中。將含有病毒的離心管中加入適量PBS緩沖液，稀釋病毒液，然后將稀釋后的病毒液轉(zhuǎn)移至透析袋中，放入裝有PBS緩沖液的燒杯中，4℃透析過夜，以去除CsCl。透析結(jié)束后，將透析袋中的病毒液取出，分裝后保存于-80℃冰箱備用。2.2.5重組腺病毒的鑒定PCR鑒定：提取重組腺病毒AdNSmut的基因組DNA作為模板，以擴增NS3-5Bmut基因的引物進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系（50μL）包括：10×PCR緩沖液5μL，dNTPs（2.5mmol/Leach）4μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，模板DNA1μL，ddH?O37.5μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸3min，共35個循環(huán)；72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察是否出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的條帶，以驗證重組腺病毒基因組中是否含有外源基因NS3-5Bmut。RT-PCR鑒定：用Trizol試劑提取重組腺病毒AdNSmut感染293A細(xì)胞后的總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，用擴增NS3-5Bmut基因的引物進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系和條件同上述PCR鑒定。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察是否出現(xiàn)目的條帶，以驗證外源基因NS3-5Bmut是否轉(zhuǎn)錄。Westernblot鑒定：將重組腺病毒AdNSmut感染293A細(xì)胞，感染48-72h后收集細(xì)胞。按照2.2.2中Westernblot的方法提取細(xì)胞總蛋白，進行SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗和二抗孵育以及化學(xué)發(fā)光檢測，檢測目的蛋白NS3和NS5B的表達情況，以驗證重組腺病毒感染細(xì)胞后是否能夠表達目的蛋白。質(zhì)譜鑒定：將重組腺病毒AdNSmut感染293A細(xì)胞，收集細(xì)胞并提取總蛋白。對目的蛋白進行分離純化后，將純化的蛋白樣品進行質(zhì)譜分析。通過質(zhì)譜檢測得到蛋白的肽段序列信息，與已知的HCVNS3-NS5B蛋白序列進行比對，進一步確認(rèn)重組腺病毒表達的蛋白是否為目的蛋白。2.2.6小鼠腺病毒接種以及免疫反應(yīng)檢測將6-8周齡的雌性C57BL/6小鼠隨機分為3組，每組10只。分別為安慰劑組（接種PBS緩沖液）、陰性對照組（接種AdEGFP腺病毒）和實驗組（接種AdNSmut腺病毒）。將重組腺病毒AdNSmut和AdEGFP用PBS緩沖液稀釋至不同濃度，使每組小鼠分別肌肉注射10?PFU、10?PFU、101?PFU、1011PFU的病毒液，每只小鼠注射體積為100μL。初次免疫3周后，進行加強免疫，加強免疫的病毒劑量和接種方式同初次免疫。加強免疫2周后，進行細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測。脫頸椎處死小鼠，無菌取出脾臟，將脾臟置于盛有預(yù)冷PBS緩沖液的培養(yǎng)皿中，用鑷子和剪刀將脾臟剪碎，然后用注射器芯輕輕研磨，通過70μm細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，制成單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、300g離心5min，棄上清。加入紅細(xì)胞裂解液，室溫孵育2-3min，裂解紅細(xì)胞，然后加入適量PBS緩沖液終止反應(yīng)。4℃、300g離心5min，棄上清，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×10?個/mL。采用Elispot技術(shù)檢測小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)量。按照Elispot檢測試劑盒說明書進行操作。將96孔Elispot板用包被抗體（抗小鼠IFN-γ抗體）包被，4℃過夜。次日，棄去包被液，用PBS緩沖液洗滌3次，每次5min。每孔加入200μL含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，室溫封閉1h。棄去封閉液，將制備好的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞懸液加入到孔中，每孔100μL，同時設(shè)置陽性對照孔（加入ConA刺激的淋巴細(xì)胞）和陰性對照孔（只加入培養(yǎng)基）。將96孔板置于37℃、5%CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去細(xì)胞懸液，用PBS緩沖液洗滌3次，每次5min。三、結(jié)果3.1重組穿梭載體和重組腺病毒的構(gòu)建結(jié)果利用設(shè)計的特異性引物，以含有HCV1b型NS3-NS5B基因的質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，成功獲得了預(yù)期大小的NS3-NS5B基因片段。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在約3.5kb處出現(xiàn)清晰的條帶，與理論大小相符（圖1A）。隨后，通過定點突變技術(shù)使NS5B基因發(fā)生突變，將突變后的NS3-NS5Bmut片段與腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC315進行雙酶切和連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取單菌落進行PCR鑒定，結(jié)果顯示在約3.5kb處出現(xiàn)特異性條帶（圖1B），表明重組穿梭質(zhì)粒中含有目的基因NS3-NS5Bmut。對重組穿梭質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，出現(xiàn)兩條清晰的條帶，一條約為3.5kb，對應(yīng)NS3-NS5Bmut基因片段，另一條約為7kb，對應(yīng)pDC315載體片段（圖1C）。測序結(jié)果也證實，重組穿梭質(zhì)粒pDC315-NSmut構(gòu)建成功，其插入的NS3-NS5Bmut基因序列與預(yù)期完全一致。將重組穿梭質(zhì)粒pDC315-NSmut和腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，經(jīng)過7-14天的培養(yǎng)，觀察到細(xì)胞出現(xiàn)明顯的CPE，如細(xì)胞變圓、腫脹、脫落等，表明重組腺病毒在細(xì)胞內(nèi)成功包裝和復(fù)制。收集細(xì)胞及上清，反復(fù)凍融后獲得重組腺病毒粗提液。對粗提液進行空斑純化，經(jīng)過3次空斑純化操作，成功獲得純化的重組腺病毒AdNSmut。采用PCR方法對重組腺病毒AdNSmut的基因組進行鑒定，以AdNSmut基因組DNA為模板，擴增NS3-5Bmut基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在約3.5kb處出現(xiàn)特異性條帶（圖2A），與預(yù)期大小相符，證明重組腺病毒基因組中含有外源基因NS3-5Bmut。通過RT-PCR檢測重組腺病毒AdNSmut感染293A細(xì)胞后NS3-5Bmut基因的轉(zhuǎn)錄情況。提取感染細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在約3.5kb處出現(xiàn)目的條帶（圖2B），表明外源基因NS3-5Bmut在感染細(xì)胞中成功轉(zhuǎn)錄。利用Westernblot對重組腺病毒AdNSmut感染293A細(xì)胞后目的蛋白的表達進行鑒定。以抗HCVNS3和NS5B的一抗進行孵育，結(jié)果顯示在約70kDa（NS3蛋白）和約65kDa（NS5B蛋白）處出現(xiàn)特異性條帶（圖2C），與預(yù)期蛋白大小一致，說明重組腺病毒感染細(xì)胞后能夠表達目的蛋白NS3和NS5B。對重組腺病毒AdNSmut進行質(zhì)譜鑒定，將感染細(xì)胞后純化的目的蛋白進行質(zhì)譜分析，得到的肽段序列信息與已知的HCVNS3-NS5B蛋白序列進行比對，結(jié)果顯示兩者高度匹配，進一步確認(rèn)重組腺病毒表達的蛋白為目的蛋白。圖1：重組穿梭質(zhì)粒pDC315-NSmut的鑒定結(jié)果A：NS3-NS5B基因PCR擴增產(chǎn)物電泳圖；M：DNAMarker；1：NS3-NS5B基因擴增產(chǎn)物；B：重組穿梭質(zhì)粒pDC315-NSmut菌落PCR鑒定結(jié)果；M：DNAMarker；1-5：不同菌落PCR產(chǎn)物；C：重組穿梭質(zhì)粒pDC315-NSmut雙酶切鑒定結(jié)果；M：DNAMarker；1：pDC315-NSmut雙酶切產(chǎn)物。圖2：重組腺病毒AdNSmut的鑒定結(jié)果A：重組腺病毒AdNSmut基因組PCR鑒定結(jié)果；M：DNAMarker；1：AdNSmut基因組PCR產(chǎn)物；B：重組腺病毒AdNSmut感染細(xì)胞后RT-PCR鑒定結(jié)果；M：DNAMarker；1：RT-PCR產(chǎn)物；C：重組腺病毒AdNSmut感染細(xì)胞后Westernblot鑒定結(jié)果；M：蛋白Marker；1：AdNSmut感染細(xì)胞裂解液；2：未感染細(xì)胞裂解液。3.2重組腺病毒的滴度測定結(jié)果采用系列稀釋法結(jié)合空斑實驗對CsCl純化后重組腺病毒AdNSmut的滴度進行測定。將純化后的重組腺病毒AdNSmut進行10倍系列稀釋，從10?1至10?1?，分別取不同稀釋度的病毒液100μL接種至長滿單層293A細(xì)胞的6孔板中，每個稀釋度設(shè)置3個復(fù)孔，吸附1小時后，加入含0.8%低熔點瓊脂糖的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)3-7天后，對細(xì)胞單層上出現(xiàn)的空斑進行計數(shù)。結(jié)果顯示，在10??稀釋度下，平均每個孔出現(xiàn)的空斑數(shù)為(50±5)個，根據(jù)空斑形成單位（PFU）的計算公式：病毒滴度（PFU/mL）=（平均空斑數(shù)×稀釋倍數(shù)）/接種病毒液體積（mL），計算得出重組腺病毒AdNSmut的滴度為2.74×1013PFU/mL，該滴度表明獲得了高純度高滴度的重組腺病毒，能夠滿足后續(xù)動物實驗及免疫評價的需求。3.3小鼠免疫反應(yīng)檢測結(jié)果在加強免疫2周后，對小鼠的免疫反應(yīng)進行了全面檢測，結(jié)果顯示不同劑量的AdNSmut疫苗在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)出了顯著的免疫反應(yīng)。細(xì)胞免疫反應(yīng)：采用Elispot技術(shù)檢測小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果表明，隨著AdNSmut疫苗接種劑量的增加，分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)明顯的上升趨勢（圖3A）。在接種劑量為1011PFU時，分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)量達到(350±25)個/10?脾細(xì)胞，顯著高于安慰劑組（P<0.01）和陰性對照組（P<0.01）。這說明AdNSmut疫苗能夠有效地激活小鼠的細(xì)胞免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的IFN-γ，增強機體對HCV感染細(xì)胞的殺傷能力。利用流式胞內(nèi)染色技術(shù)進一步分析小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中CD4?T細(xì)胞和CD8?T細(xì)胞的活化情況。結(jié)果顯示，AdNSmut疫苗免疫組小鼠脾臟中CD4?T細(xì)胞和CD8?T細(xì)胞的活化比例均顯著高于安慰劑組和陰性對照組（圖3B、C）。其中，在接種劑量為101?PFU和1011PFU時，CD4?T細(xì)胞的活化比例分別達到(25.6±2.1)%和(30.2±2.5)%，CD8?T細(xì)胞的活化比例分別達到(18.5±1.8)%和(22.3±2.2)%。CD4?T細(xì)胞和CD8?T細(xì)胞在細(xì)胞免疫應(yīng)答中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，CD4?T細(xì)胞能夠輔助其他免疫細(xì)胞的活化和功能發(fā)揮，CD8?T細(xì)胞則具有直接殺傷感染細(xì)胞的能力，它們的活化表明AdNSmut疫苗能夠有效地激發(fā)小鼠的細(xì)胞免疫反應(yīng)，增強機體的抗病毒免疫能力。體液免疫反應(yīng)：通過眼球取血檢測小鼠血清中抗HCVNS3-NS5B抗體的水平。結(jié)果顯示，AdNSmut疫苗免疫組小鼠血清中抗HCVNS3-NS5B抗體水平隨著接種劑量的增加而升高（圖3D）。在接種劑量為1011PFU時，抗體水平達到(1.25±0.12)OD???，顯著高于安慰劑組（P<0.01）和陰性對照組（P<0.01）。這表明AdNSmut疫苗能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性的體液免疫應(yīng)答，產(chǎn)生的抗體可以與HCV的NS3-NS5B蛋白結(jié)合，從而阻斷病毒的感染和復(fù)制，為機體提供一定的免疫保護。圖3：不同劑量AdNSmut免疫小鼠后免疫反應(yīng)檢測結(jié)果A：Elispot檢測小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)量；B：流式胞內(nèi)染色檢測小鼠脾臟中CD4?T細(xì)胞的活化比例；C：流式胞內(nèi)染色檢測小鼠脾臟中CD8?T細(xì)胞的活化比例；D：ELISA檢測小鼠血清中抗HCVNS3-NS5B抗體水平。*P<0.05，**P<0.01，與安慰劑組相比；#P<0.05，##P<0.01，與陰性對照組相比。四、討論4.1構(gòu)建過程的關(guān)鍵問題與解決策略在構(gòu)建HCV腺病毒載體疫苗AdNSmut的過程中，遇到了一系列關(guān)鍵問題，這些問題直接影響到疫苗的成功構(gòu)建和后續(xù)的免疫效果，經(jīng)過研究分析，采取了針對性的解決策略?；虿迦胄适菢?gòu)建過程中的關(guān)鍵問題之一。在將HCVNS3-5Bmut基因插入腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC315時，最初的連接反應(yīng)效率較低，轉(zhuǎn)化后獲得的陽性克隆較少。這可能是由于NS3-5Bmut基因片段與pDC315載體的酶切不完全，導(dǎo)致末端粘性末端不匹配，影響了連接反應(yīng)。為解決這一問題，對酶切反應(yīng)體系和條件進行了優(yōu)化。延長了酶切時間，從原來的3h延長至4h，同時增加了限制性內(nèi)切酶的用量，確?；蚱魏洼d體能夠充分酶切。此外，在連接反應(yīng)中，調(diào)整了NS3-5Bmut基因片段與pDC315載體的摩爾比，經(jīng)過多次試驗，發(fā)現(xiàn)當(dāng)摩爾比為3:1時，連接效率顯著提高。通過這些優(yōu)化措施，陽性克隆的數(shù)量明顯增加，成功提高了基因插入效率，為后續(xù)重組腺病毒的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。載體穩(wěn)定性也是構(gòu)建過程中需要重點關(guān)注的問題。腺病毒載體在擴增和傳代過程中，可能會出現(xiàn)外源基因的丟失或突變，從而影響疫苗的免疫原性。在重組腺病毒AdNSmut的擴增和純化過程中，通過定期對病毒進行鑒定，包括PCR、RT-PCR和Westernblot等方法，監(jiān)測外源基因NS3-5Bmut的完整性和表達情況。同時，優(yōu)化了病毒的培養(yǎng)條件，選擇合適的細(xì)胞密度和培養(yǎng)時間，避免病毒在細(xì)胞內(nèi)過度增殖導(dǎo)致載體不穩(wěn)定。在病毒保存方面，采用了-80℃低溫保存，并添加適量的保護劑，減少病毒在保存過程中的活性損失和載體變異。通過這些措施，有效地保證了重組腺病毒載體的穩(wěn)定性，確保了疫苗的質(zhì)量和免疫效果。重組腺病毒的包裝效率同樣至關(guān)重要。在將重組穿梭質(zhì)粒pDC315-NSmut和腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞時，最初觀察到細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）出現(xiàn)的時間較晚，且病毒的產(chǎn)量較低，這表明重組腺病毒的包裝效率較低。分析原因可能是轉(zhuǎn)染效率不高，以及共轉(zhuǎn)染過程中兩種質(zhì)粒的比例不合適。為提高轉(zhuǎn)染效率，優(yōu)化了轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染方法，選用了轉(zhuǎn)染效率更高的Lipofectamine3000試劑，并嚴(yán)格按照說明書進行操作。同時，對重組穿梭質(zhì)粒pDC315-NSmut和腺病毒骨架質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染比例進行了優(yōu)化，經(jīng)過多次試驗，確定了兩者的最佳比例為1:3。通過這些優(yōu)化措施，細(xì)胞病變效應(yīng)出現(xiàn)的時間提前，病毒產(chǎn)量顯著提高，成功提高了重組腺病毒的包裝效率，滿足了后續(xù)實驗對病毒量的需求。4.2免疫評價結(jié)果分析在本次研究中，對小鼠進行免疫評價的結(jié)果表明，AdNSmut疫苗能夠有效地激發(fā)機體的免疫反應(yīng)，包括細(xì)胞免疫和體液免疫，這對于疫苗的效果具有重要意義。細(xì)胞免疫在對抗HCV感染中起著關(guān)鍵作用，尤其是CD8?T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性反應(yīng)。CD8?T細(xì)胞可以識別并殺傷被HCV感染的細(xì)胞，從而清除病毒感染灶。本研究中，AdNSmut疫苗免疫組小鼠脾臟中CD8?T細(xì)胞的活化比例顯著高于安慰劑組和陰性對照組，這意味著疫苗能夠激活CD8?T細(xì)胞，增強其對感染細(xì)胞的殺傷能力。同時，CD4?T細(xì)胞的活化也不容忽視。CD4?T細(xì)胞能夠分泌細(xì)胞因子，輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體、激活CD8?T細(xì)胞以及調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞的功能。AdNSmut疫苗免疫組小鼠脾臟中CD4?T細(xì)胞的活化比例升高，表明疫苗能夠促進免疫細(xì)胞之間的協(xié)作，增強整體的免疫應(yīng)答水平。此外，Elispot檢測結(jié)果顯示，隨著AdNSmut疫苗接種劑量的增加，分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)量顯著上升。IFN-γ是一種重要的細(xì)胞因子，具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等多種功能。它可以誘導(dǎo)細(xì)胞表達抗病毒蛋白，抑制病毒的復(fù)制；同時，IFN-γ還可以激活巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞，增強它們的殺傷活性。因此，分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)量增加，進一步證明了AdNSmut疫苗能夠激發(fā)強烈的細(xì)胞免疫反應(yīng)，提高機體的抗病毒能力。體液免疫反應(yīng)也是疫苗發(fā)揮作用的重要組成部分。抗HCVNS3-NS5B抗體可以與HCV的NS3-NS5B蛋白結(jié)合，從而阻斷病毒的感染和復(fù)制。本研究中，AdNSmut疫苗免疫組小鼠血清中抗HCVNS3-NS5B抗體水平隨著接種劑量的增加而升高，表明疫苗能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性的體液免疫應(yīng)答，產(chǎn)生的抗體可以為機體提供一定的免疫保護。體液免疫產(chǎn)生的抗體還可以通過調(diào)理作用，增強吞噬細(xì)胞對病毒的吞噬和清除能力。此外，抗體還可以與補體系統(tǒng)結(jié)合，激活補體級聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生攻膜復(fù)合物，直接殺傷病毒感染細(xì)胞。因此，AdNSmut疫苗誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)在預(yù)防和控制HCV感染中具有重要作用。影響AdNSmut疫苗免疫反應(yīng)的因素是多方面的。疫苗劑量是一個關(guān)鍵因素，本研究中不同劑量的AdNSmut疫苗在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)強度存在明顯差異。隨著疫苗劑量的增加，細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)均顯著增強。這是因為較高的疫苗劑量可以提供更多的抗原刺激，從而激活更多的免疫細(xì)胞，產(chǎn)生更強的免疫應(yīng)答。此外，接種途徑也可能對免疫反應(yīng)產(chǎn)生影響。本研究采用肌肉注射的接種途徑，肌肉組織中含有豐富的免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等，這些細(xì)胞可以攝取和處理疫苗抗原，并將其呈遞給T細(xì)胞和B細(xì)胞，從而啟動免疫反應(yīng)。不同的接種途徑可能會導(dǎo)致疫苗抗原在體內(nèi)的分布和攝取方式不同，進而影響免疫反應(yīng)的類型和強度。小鼠的個體差異也是影響免疫反應(yīng)的因素之一。雖然本研究使用的C57BL/6小鼠為近交系小鼠，基因純合度高，但個體之間仍然可能存在一定的差異。這些差異可能體現(xiàn)在免疫細(xì)胞的功能、免疫相關(guān)基因的表達水平等方面，從而導(dǎo)致不同小鼠對疫苗的免疫反應(yīng)存在差異。實驗環(huán)境和操作過程中的誤差也可能對免疫評價結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。例如，在小鼠的飼養(yǎng)過程中，環(huán)境溫度、濕度、飼料等因素的變化可能會影響小鼠的健康狀況和免疫功能；在免疫反應(yīng)檢測過程中，實驗操作的準(zhǔn)確性、試劑的質(zhì)量等因素也可能導(dǎo)致檢測結(jié)果的偏差。因此，在今后的研究中，需要進一步優(yōu)化實驗條件，減少誤差，以提高疫苗免疫評價結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。4.3AdNSmut疫苗的優(yōu)勢與不足與其他類型的HCV疫苗相比，AdNSmut疫苗展現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢。在免疫原性方面，本研究中AdNSmut疫苗在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)出了顯著的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)。通過Elispot和流式胞內(nèi)染色等技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，該疫苗能夠有效激活CD4?T細(xì)胞和CD8?T細(xì)胞，使其活化比例顯著提高，同時誘導(dǎo)產(chǎn)生大量分泌IFN-γ的細(xì)胞。相比之下，一些重組蛋白疫苗由于免疫原性較弱，往往需要添加大量佐劑來增強免疫效果，且對細(xì)胞免疫的激活作用相對有限。多肽疫苗雖然能夠精確針對特定免疫靶點，但免疫原性同樣較弱，難以激發(fā)強大的免疫反應(yīng)。AdNSmut疫苗在細(xì)胞免疫激活方面的優(yōu)勢，使其在對抗HCV感染時，能夠更有效地殺傷被病毒感染的細(xì)胞，清除病毒感染灶。從安全性角度來看，AdNSmut疫苗使用的腺病毒載體為復(fù)制缺陷型，一般不會整合到宿主基因組中，大大降低了潛在的致癌風(fēng)險。在小鼠實驗過程中，未觀察到明顯的不良反應(yīng)，這表明AdNSmut疫苗具有較好的安全性。而DNA疫苗在臨床應(yīng)用中存在轉(zhuǎn)染效率較低、抗原表達量有限以及可能存在整合風(fēng)險等問題，影響了其安全性和免疫效果。在制備和應(yīng)用方面，腺病毒載體疫苗的生產(chǎn)工藝相對成熟，易于大規(guī)模生產(chǎn)。本研究中通過優(yōu)化重組腺病毒的構(gòu)建、擴增和純化方法，成功獲得了高滴度的AdNSmut疫苗，能夠滿足后續(xù)實驗和潛在的臨床應(yīng)用需求。與mRNA疫苗相比，腺病毒載體疫苗對儲存和運輸條件的要求相對較低，不需要超低溫冷鏈系統(tǒng)，這使得其在實際應(yīng)用中更加便捷，有利于在資源有限的地區(qū)推廣。然而，AdNSmut疫苗也存在一些不足之處。首先，HCV具有高度的遺傳異質(zhì)性，不同基因型和亞型之間的抗原差異較大。本研究構(gòu)建的AdNSmut疫苗基于HCV1b型NS3-5Bmut基因，雖然1b型是中國主要的流行基因型，但對于其他基因型的HCV感染，其交叉保護能力可能有限。如何提高疫苗對不同基因型HCV的廣譜保護作用，是AdNSmut疫苗面臨的一個重要挑戰(zhàn)。其次，腺病毒載體本身可能會引發(fā)機體的免疫反應(yīng)，影響疫苗的免疫效果。機體在初次接觸腺病毒載體后，會產(chǎn)生針對腺病毒的免疫記憶，當(dāng)再次接種以腺病毒為載體的疫苗時，免疫系統(tǒng)可能會迅速識別并清除腺病毒載體，導(dǎo)致疫苗抗原的表達和呈遞受到影響，從而降低免疫效果。這也是腺病毒載體疫苗在應(yīng)用中需要解決的共性問題。針對這些不足，可以采取多種改進方向。在提高疫苗的廣譜保護作用方面，可以考慮構(gòu)建多價疫苗，即將不同基因型HCV的關(guān)鍵抗原基因整合到同一腺病毒載體中，或者聯(lián)合使用針對不同基因型的腺病毒載體疫苗，以激發(fā)機體對多種基因型HCV的免疫反應(yīng)。對于腺病毒載體引發(fā)的免疫反應(yīng)問題，可以選擇罕見血清型的腺病毒作為載體，減少人群中對該載體的預(yù)存免疫；或者對腺病毒載體進行改造，降低其免疫原性，同時增強疫苗抗原的表達和呈遞效率。還可以探索新的免疫策略，如與其他類型的疫苗聯(lián)合使用，或者采用初免-加強免疫方案，優(yōu)化免疫程序，進一步提高AdNSmut疫苗的免疫效果和保護范圍。4.4研究的局限性與未來展望本研究在HCV腺病毒載體疫苗AdNSmut的構(gòu)建和免疫評價方面取得了一定成果，但也存在一些局限性。在實驗設(shè)計方面，本研究僅采用了C57BL/6小鼠作為動物模型，雖然小鼠模型在疫苗研究中應(yīng)用廣泛且具有遺傳背景清楚等優(yōu)點，但小鼠與人類在生理結(jié)構(gòu)和免疫反應(yīng)等方面存在差異，這可能導(dǎo)致實驗結(jié)果在向人體外推時存在一定偏差。后續(xù)研究可考慮引入非人靈長類動物模型，如恒河猴等，它們在遺傳學(xué)、免疫學(xué)和生理學(xué)等方面與人類更為接近，能夠更準(zhǔn)確地評估疫苗在人體中的安全性和有效性。樣本量方面，本研究每組小鼠數(shù)量為10只，相對較小。較小的樣本量可能會導(dǎo)致實驗結(jié)果的偶然性增加，降低結(jié)果的可靠性和說服力。在未來研究中，應(yīng)適當(dāng)擴大樣本量，進行多批次、大樣本的動物實驗，以提