人工miRNA靶向豬流行性腹瀉病毒的效果及細胞應用研究

人工miRNA靶向豬流行性腹瀉病毒的效果及細胞應用研究一、引言1.1研究背景與意義豬流行性腹瀉（PorcineEpidemicDiarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（PorcineEpidemicDiarrheaVirus，PEDV）引發(fā)的一種高度傳染性腸道疾病，對全球養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。自1971年在英國首次報道以來，PEDV迅速傳播至世界各地，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的挑戰(zhàn)。PEDV主要感染豬的腸道上皮細胞，導致嚴重的腹瀉、嘔吐、脫水等癥狀，尤其對仔豬的危害最為嚴重，未斷奶仔豬的死亡率可高達100%。這不僅直接導致仔豬的死亡，還會影響母豬的繁殖性能和生產(chǎn)性能，如降低母豬的分娩率、增加返情率和流產(chǎn)率等，給豬場帶來了巨大的經(jīng)濟損失。此外，PEDV的傳播還會打亂豬場正常的生產(chǎn)節(jié)律，增加保育豬的死淘率，降低中大豬的生長性能，進一步加重了養(yǎng)豬業(yè)的負擔。目前，防控PEDV的主要手段是疫苗接種，但傳統(tǒng)疫苗存在諸多局限性。PEDV是一種RNA病毒，其基因組具有高突變率，這使得病毒能夠快速適應環(huán)境變化并逃避宿主的免疫監(jiān)視。傳統(tǒng)疫苗難以有效應對不斷出現(xiàn)的變異毒株，導致疫苗的保護效果不佳。傳統(tǒng)疫苗的研發(fā)周期長、生產(chǎn)工藝復雜且成本高，難以滿足大規(guī)模防控的需求。因此，尋找一種新的治療策略來治療PEDV感染是必要而且緊迫的。人工miRNA作為一種新興的基因沉默技術，為PEDV的防控提供了新的思路。RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是指細胞利用外源性或者內(nèi)源性的雙鏈小干擾RNA（siRNA或microRNA）激發(fā)相關的酶復合物對同源性mRNA進行切割、降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平阻斷基因的表達，達到同源基因的減效表達或不表達。在抗病毒感染方面，RNAi幾乎對所有的病毒復制都有抑制作用。與傳統(tǒng)的siRNA相比，miRNA僅僅需要和靶基因部分的結(jié)合即可以發(fā)揮作用，因而可以在很大程度上避免因為病毒變異導致的RNAi治療失敗。miRNA與其靶標不需要嚴格的堿基互補配對，病毒突變逃避miRNA特異性沉默可能更加難以實現(xiàn)，這將對容易發(fā)生變異的病毒的治療更有優(yōu)勢。因此，人工miRNA有望成為一種有效的抗PEDV策略。本研究旨在探討人工miRNA對PEDV的抑制效果及其在細胞上的初步應用，為PEDV的防控提供新的理論依據(jù)和技術支持。通過篩選出能有效抑制PEDV復制的人工miRNA，并研究其作用機制，有望開發(fā)出新型的抗PEDV生物制劑，為養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展做出貢獻。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀豬流行性腹瀉（PED）作為一種對養(yǎng)豬業(yè)危害巨大的疾病，一直是國內(nèi)外研究的重點。自1971年在英國首次報道以來，PEDV在全球范圍內(nèi)廣泛傳播，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了沉重的打擊。中國于1973年陸續(xù)有PED的相關報道，并于1984年鑒定出PEDV。此后，中國PEDV流行毒株一直是低致病性G1a亞型經(jīng)典毒株，直到2010年，PEDV變異毒株傳入我國，大量豬場爆發(fā)豬流行性腹瀉，造成產(chǎn)房仔豬大量死亡，嚴重影響豬場的生產(chǎn)成績和日常管理。根據(jù)PEDV的S基因或其N端高變區(qū)S1區(qū)序列的同源性，可將PEDV分為2個基因型——G1型和G2型，其中G1型又分為Gla和Glb亞型，G2型又分為G2a和G2b亞型。通常把以CV777毒株為代表的經(jīng)典毒株歸為G1a亞型；G1b(S-INEDL)、G2a和G2b亞型都屬于2010年以后新出現(xiàn)的毒株，其中G1b為低致病力變異毒株，G2a和G2b屬于高致病力變異毒株，而G2b為高致病力重組變異毒株。目前，防控PEDV的主要手段是疫苗接種，但傳統(tǒng)疫苗存在諸多局限性。PEDV是一種RNA病毒，其基因組具有高突變率，這使得病毒能夠快速適應環(huán)境變化并逃避宿主的免疫監(jiān)視。傳統(tǒng)疫苗難以有效應對不斷出現(xiàn)的變異毒株，導致疫苗的保護效果不佳。江蘇省農(nóng)科院李彬研究員團隊的研究表明，PEDVG2a和G2b兩種亞型毒株間的交叉攻毒保護水平很低，這意味著現(xiàn)有的疫苗可能無法對不同亞型的毒株提供全面的保護。傳統(tǒng)疫苗的研發(fā)周期長、生產(chǎn)工藝復雜且成本高，難以滿足大規(guī)模防控的需求。為了尋找更有效的防控手段，科研人員開始探索新的治療策略，人工miRNA作為一種新興的基因沉默技術，逐漸成為研究的熱點。RNA干擾（RNAi）是指細胞利用外源性或者內(nèi)源性的雙鏈小干擾RNA（siRNA或microRNA）激發(fā)相關的酶復合物對同源性mRNA進行切割、降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平阻斷基因的表達，達到同源基因的減效表達或不表達。在抗病毒感染方面，RNAi幾乎對所有的病毒復制都有抑制作用。與傳統(tǒng)的siRNA相比，miRNA僅僅需要和靶基因部分的結(jié)合即可以發(fā)揮作用，因而可以在很大程度上避免因為病毒變異導致的RNAi治療失敗。miRNA與其靶標不需要嚴格的堿基互補配對，病毒突變逃避miRNA特異性沉默可能更加難以實現(xiàn)，這將對容易發(fā)生變異的病毒的治療更有優(yōu)勢。目前，針對PEDV的人工miRNA研究取得了一定的進展。有研究根據(jù)PEDVN基因的保守序列設計人工miRNA，用人工miRNA表達載體轉(zhuǎn)染Vero細胞，在優(yōu)化轉(zhuǎn)染效率的基礎上，經(jīng)50％組織細胞感染劑量（TCID50）以及real-timePCR檢測人工miRNA對病毒基因及其復制的抑制效果，從而篩選能有效抑制PEDV的人工miRNA。也有研究從仔豬腸道細胞和腸道類器官水平揭示了豬乳小細胞外囊泡中重要非編碼RNA（miR-let-7e和miR-27b）對PEDV的抑制作用及方式。然而，當前的研究仍存在一些不足之處。大部分研究還停留在細胞水平，缺乏在動物體內(nèi)的驗證，人工miRNA的穩(wěn)定性和安全性也需要進一步評估，人工miRNA的作用機制尚未完全明確，還需要深入研究。本研究將在前人研究的基礎上，進一步探討人工miRNA對PEDV的抑制效果及其在細胞上的初步應用。通過篩選出能有效抑制PEDV復制的人工miRNA，并研究其作用機制，有望為PEDV的防控提供新的理論依據(jù)和技術支持，為養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展做出貢獻。1.3研究目標與內(nèi)容本研究旨在篩選出高效抑制豬流行性腹瀉病毒（PEDV）復制的人工miRNA，并探究其在細胞上的應用效果，為開發(fā)新型抗PEDV生物制劑奠定基礎。具體研究內(nèi)容如下：人工miRNA的設計與合成：深入分析PEDV的基因組序列，借助生物信息學工具，挑選出病毒基因中保守且關鍵的區(qū)域作為人工miRNA的作用靶點。依據(jù)miRNA的設計原則，精心設計并合成針對這些靶點的人工miRNA序列。在設計過程中，充分考慮miRNA與靶基因的互補配對情況，以及miRNA的二級結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，確保其能夠高效地發(fā)揮基因沉默作用。細胞轉(zhuǎn)染與病毒感染：選用對PEDV敏感的細胞系，如Vero細胞，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染等方法，將合成的人工miRNA導入細胞中。通過優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，提高轉(zhuǎn)染效率，確保足夠數(shù)量的細胞攝取人工miRNA。轉(zhuǎn)染后，用PEDV感染細胞，設置不同的實驗組和對照組，包括正常細胞組、轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組、感染病毒組以及轉(zhuǎn)染人工miRNA后感染病毒組等，以準確評估人工miRNA對病毒感染的影響?？共《拘Чu估：運用多種實驗技術，全面評估人工miRNA對PEDV的抑制效果。采用實時熒光定量PCR技術，精確檢測病毒核酸的復制水平，通過比較不同實驗組中病毒核酸的含量，直觀地反映人工miRNA對病毒復制的抑制程度。利用免疫印跡（Westernblot）技術，檢測病毒蛋白的表達情況，從蛋白質(zhì)水平進一步驗證人工miRNA的抗病毒作用。借助細胞病變效應（CPE）觀察，直觀地了解病毒感染對細胞形態(tài)和生長的影響，以及人工miRNA對細胞病變的抑制作用。作用機制初步探究：從多個角度深入探究人工miRNA抗PEDV的作用機制。通過生物信息學預測，結(jié)合實驗驗證，確定人工miRNA的靶基因，明確其在病毒生命周期中的作用環(huán)節(jié)。研究人工miRNA對病毒基因轉(zhuǎn)錄和翻譯過程的影響，分析其是否通過降解病毒mRNA或抑制翻譯過程來發(fā)揮抗病毒作用。探討人工miRNA對宿主細胞免疫反應的調(diào)節(jié)作用，研究其是否能夠激活宿主細胞的免疫防御機制，增強細胞對病毒的抵抗力。1.4研究方法與技術路線本研究將綜合運用生物信息學、細胞實驗、分子生物學技術等多種研究方法，系統(tǒng)地探究人工miRNA對豬流行性腹瀉病毒（PEDV）的抑制效果及其在細胞上的初步應用，具體研究方法如下：生物信息學分析：借助NCBI、Ensembl等權威數(shù)據(jù)庫，全面獲取PEDV的基因組序列數(shù)據(jù)。運用Mfold、RNAstructure等專業(yè)軟件，對PEDV的基因結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)進行深入分析，預測mRNA的潛在靶位點，為人工miRNA的設計提供堅實的理論依據(jù)。利用TargetScan、miRanda等靶基因預測工具，預測人工miRNA的潛在靶基因，并對靶基因進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，深入了解靶基因的生物學功能和參與的信號通路，為后續(xù)研究人工miRNA的作用機制奠定基礎。細胞實驗：選用對PEDV敏感的Vero細胞作為實驗細胞，用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將合成的人工miRNA表達載體導入Vero細胞中。通過預實驗，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，如脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例、轉(zhuǎn)染時間、細胞密度等，以提高轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染后，利用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，確保足夠數(shù)量的細胞攝取人工miRNA。轉(zhuǎn)染后的細胞用PEDV以一定的感染復數(shù)（MOI）進行感染，設置不同的實驗組和對照組，包括正常細胞組、轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組、感染病毒組以及轉(zhuǎn)染人工miRNA后感染病毒組等。在感染后的不同時間點，收集細胞和上清液，用于后續(xù)的檢測分析。分子生物學技術：采用實時熒光定量PCR技術，檢測病毒核酸的復制水平。提取細胞中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，以病毒特異性引物進行PCR擴增，通過比較不同實驗組中病毒核酸的Ct值，精確計算病毒核酸的相對含量，直觀地反映人工miRNA對病毒復制的抑制程度。利用免疫印跡（Westernblot）技術，檢測病毒蛋白的表達情況。提取細胞總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用特異性抗體進行雜交，通過化學發(fā)光法檢測病毒蛋白的條帶強度，從蛋白質(zhì)水平進一步驗證人工miRNA的抗病毒作用。運用細胞病變效應（CPE）觀察，在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和生長狀態(tài)的變化，如細胞變圓、脫落、融合等，直觀地了解病毒感染對細胞的影響，以及人工miRNA對細胞病變的抑制作用。本研究的技術路線如圖1所示：人工miRNA設計與合成：收集PEDV基因組序列，進行生物信息學分析，挑選保守區(qū)域作為靶點，設計并合成人工miRNA。細胞轉(zhuǎn)染與病毒感染：培養(yǎng)Vero細胞，將人工miRNA表達載體轉(zhuǎn)染至細胞中，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，轉(zhuǎn)染后用PEDV感染細胞，設置不同實驗組和對照組?？共《拘Чu估：在感染后的不同時間點，通過實時熒光定量PCR檢測病毒核酸復制水平，利用免疫印跡檢測病毒蛋白表達，觀察細胞病變效應評估人工miRNA抗病毒效果。作用機制初步探究：通過生物信息學預測結(jié)合實驗驗證確定靶基因，研究人工miRNA對病毒基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的影響，探討其對宿主細胞免疫反應的調(diào)節(jié)作用。[此處插入技術路線圖]圖1技術路線圖二、人工miRNA與PEDV概述2.1miRNA及人工miRNA介紹2.1.1miRNA的基本概念與特征miRNA（microRNA）是一類長度約為21-23個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，廣泛存在于真核生物中。1993年，科學家在線蟲中首次發(fā)現(xiàn)了miRNA——lin-4，開啟了對這一領域的研究。miRNA基因在基因組中通常以單拷貝、多拷貝或基因簇的形式存在，大部分位于基因間隔區(qū)，也有部分位于內(nèi)含子區(qū)域。其轉(zhuǎn)錄過程由RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ介導，首先轉(zhuǎn)錄生成長度約為幾千個堿基的初級轉(zhuǎn)錄本（pri-miRNA）。pri-miRNA具有復雜的二級結(jié)構(gòu)，在Drosha-DGCR8蛋白復合物的作用下，被剪切成具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)、長度約70-90個堿基的前體miRNA（pre-miRNA）。隨后，pre-miRNA在Ran-GTP-Exportin-5轉(zhuǎn)運蛋白的協(xié)助下從細胞核轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)中。在細胞質(zhì)中，pre-miRNA被Dicer-TRBP識別并進一步加工，剪切形成約21-23個核苷酸的miRNA雙鏈。其中一條鏈會迅速降解，另一條鏈則被裝載進AGO2蛋白中，形成RNA誘導沉默復合體（RISC），最終生成具有功能的成熟單鏈miRNA。miRNA具有以下顯著特征：其一，長度較短，約為21-23個核苷酸，這是其最基本的特征之一；其二，具有高度的保守性，在不同物種間，許多miRNA的序列和功能都相對保守，反映了其在生物進化過程中的重要性；其三，表達具有組織特異性和時空特異性，不同組織和細胞在不同的發(fā)育階段和生理狀態(tài)下，miRNA的表達譜存在顯著差異，這表明miRNA在細胞分化、發(fā)育等過程中發(fā)揮著關鍵的調(diào)控作用；其四，一個miRNA可以通過與多個靶mRNA的3′非翻譯區(qū)（3′UTR）互補配對，調(diào)控多個靶基因的表達，反之，多個miRNA也可以共同調(diào)節(jié)同一靶基因，這種復雜的調(diào)控網(wǎng)絡使得miRNA能夠精細地調(diào)控細胞內(nèi)的各種生物學過程。miRNA主要通過參與基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控來發(fā)揮作用。其作用方式主要有兩種：一是當miRNA與靶mRNA的序列完全互補配對時，RISC中的AGO2蛋白會發(fā)揮核酸內(nèi)切酶的活性，直接切割靶mRNA，導致其降解，從而阻斷基因的表達；二是當miRNA與靶mRNA的序列不完全互補配對時，主要通過抑制靶mRNA的翻譯過程，使mRNA無法順利翻譯成蛋白質(zhì)，進而實現(xiàn)對基因表達的調(diào)控。研究表明，miRNA參與了真核生物中眾多重要的生物學過程，如細胞增殖、分化、凋亡、代謝、發(fā)育以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等。在腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)，某些miRNA的表達異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預后密切相關，它們可以作為腫瘤診斷的生物標志物和潛在的治療靶點。2.1.2人工miRNA的設計原理與合成方法人工miRNA（artificialmicroRNA，amiRNA）是基于天然miRNA的生成和作用原理設計的，旨在對一個或多個特定基因進行靶向調(diào)控的小分子RNA。其設計原理的核心是模擬天然miRNA與靶mRNA的相互作用方式，通過合理設計amiRNA的序列，使其能夠特異性地識別并結(jié)合靶基因的mRNA，從而實現(xiàn)對靶基因表達的有效抑制。在設計人工miRNA時，首先需要對靶基因的mRNA序列進行深入分析，利用生物信息學工具，如TargetScan、miRanda等，預測mRNA上可能與miRNA結(jié)合的潛在位點。在挑選靶位點時，要充分考慮多個因素。靶位點應具有較高的特異性，盡量避免與其他非靶基因的mRNA序列產(chǎn)生交叉互補，以確保amiRNA能夠精準地作用于目標基因。靶位點的位置也至關重要，一般優(yōu)先選擇位于靶mRNA的3′UTR區(qū)域的位點，因為這一區(qū)域富含多種調(diào)控元件，與miRNA的結(jié)合更容易影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率。還需要考慮靶位點周圍的序列特征，如二級結(jié)構(gòu)等，避免選擇位于高度結(jié)構(gòu)化區(qū)域的位點，以免影響amiRNA與靶mRNA的結(jié)合能力。根據(jù)選定的靶位點，設計相應的amiRNA序列。amiRNA的5′端部分通常需要與靶mRNA的互補區(qū)域具有較高的互補性，尤其是種子序列（一般指miRNA5′端的第2-8個核苷酸），這對于識別靶mRNA至關重要。通常要求種子序列與靶mRNA的互補區(qū)域完全匹配或僅有極少錯配，以保證特異性結(jié)合。amiRNA的3′端部分也需要與靶mRNA有適當?shù)幕パa配對，雖然其互補性要求相對較低，但合適的3′端配對可以增強amiRNA與靶mRNA結(jié)合的穩(wěn)定性，從而提高對靶基因表達的抑制效果。除了與靶mRNA的互補序列外，amiRNA還需要包含適當?shù)膫?cè)翼序列，這些側(cè)翼序列對于維持amiRNA前體的莖環(huán)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性至關重要，類似于天然pre-miRNA的結(jié)構(gòu)特征，合適的莖環(huán)結(jié)構(gòu)有助于amiRNA在細胞內(nèi)的加工和成熟，進而發(fā)揮其生物學功能。目前，人工miRNA的合成方法主要有化學合成和載體構(gòu)建合成兩種。化學合成法是通過化學手段直接合成amiRNA序列，這種方法合成的amiRNA純度高、產(chǎn)量大，能夠滿足一些對純度要求較高的實驗需求，如體外細胞實驗中的轉(zhuǎn)染研究。化學合成的amiRNA通常需要進行化學修飾，以提高其穩(wěn)定性和細胞攝取效率，常見的修飾方式包括2′-O-甲基化、2′-氟代修飾、鎖核酸（LNA）修飾等。這些修飾可以增強amiRNA對核酸酶的抗性，延長其在體內(nèi)外的半衰期，同時也有助于提高amiRNA進入細胞的效率，使其能夠更好地發(fā)揮作用。化學合成法也存在一些局限性，如合成成本較高，對于大規(guī)模的體內(nèi)實驗或臨床應用來說，成本可能成為限制因素；化學合成的amiRNA在細胞內(nèi)的作用持續(xù)時間相對較短，難以實現(xiàn)長期穩(wěn)定的基因調(diào)控。載體構(gòu)建合成法則是將人工miRNA的編碼序列克隆到特定的表達載體中，如質(zhì)粒載體、病毒載體等，然后將重組載體導入細胞中，利用細胞自身的轉(zhuǎn)錄和加工機制來表達和生成amiRNA。這種方法的優(yōu)點是可以實現(xiàn)amiRNA在細胞內(nèi)的持續(xù)表達，從而對靶基因進行長期穩(wěn)定的調(diào)控，更適合用于體內(nèi)實驗和基因治療研究。以慢病毒載體為例，它能夠?qū)y帶的amiRNA編碼序列整合到宿主細胞的基因組中，隨著細胞的分裂而穩(wěn)定遺傳，實現(xiàn)對靶基因的長期抑制。通過選擇合適的啟動子，可以調(diào)控amiRNA在特定組織或細胞類型中的表達，提高基因調(diào)控的特異性。載體構(gòu)建合成法也面臨一些挑戰(zhàn)，如載體的構(gòu)建過程相對復雜，需要一定的分子生物學技術和經(jīng)驗；載體的安全性問題也是需要關注的重點，病毒載體可能存在潛在的免疫原性和插入突變風險，需要進行嚴格的評估和優(yōu)化。2.1.3人工miRNA作用機制人工miRNA的作用機制與天然miRNA類似，主要通過與靶mRNA特異性結(jié)合，引發(fā)一系列生物學效應，從而實現(xiàn)對靶基因表達的調(diào)控。當人工miRNA被導入細胞并形成成熟的單鏈形式后，會與AGO2蛋白等組裝形成RNA誘導沉默復合體（RISC）。在RISC中，人工miRNA充當引導分子，憑借其與靶mRNA互補的核苷酸序列，精準地識別并結(jié)合靶mRNA分子。如果人工miRNA與靶mRNA的互補配對程度較高，幾乎完全互補，RISC中的AGO2蛋白會發(fā)揮核酸內(nèi)切酶的活性，在特定位置對靶mRNA進行切割。具體來說，AGO2蛋白會識別miRNA與靶mRNA形成的雙鏈結(jié)構(gòu)，并在miRNA的引導下，對靶mRNA上與miRNA第10和11位核苷酸相對應的位置進行切割，使靶mRNA斷裂成兩段。斷裂后的靶mRNA片段失去了完整性，無法繼續(xù)作為模板進行蛋白質(zhì)的翻譯合成，同時也更容易被細胞內(nèi)的核酸酶進一步降解，從而導致靶基因的mRNA水平顯著降低，實現(xiàn)對靶基因表達的有效抑制。這種通過核酸內(nèi)切酶切割靶mRNA的方式，作用效果較為直接和迅速，能夠在短時間內(nèi)降低靶基因的表達量。當人工miRNA與靶mRNA的互補配對不完全，存在一定程度的錯配時，雖然不能引發(fā)AGO2蛋白對靶mRNA的切割，但仍然可以通過抑制翻譯過程來調(diào)控靶基因的表達。在翻譯起始階段，核糖體通常需要識別并結(jié)合到mRNA的起始密碼子區(qū)域，才能啟動蛋白質(zhì)的合成過程。人工miRNA與靶mRNA結(jié)合后，會改變靶mRNA的二級結(jié)構(gòu)，或者阻礙核糖體與mRNA的結(jié)合，使核糖體無法順利識別起始密碼子，從而抑制翻譯起始的發(fā)生。即使核糖體成功結(jié)合到mRNA上，在翻譯延伸過程中，人工miRNA與靶mRNA的結(jié)合也可能會干擾核糖體的移動，導致翻譯過程受阻，無法順利合成完整的蛋白質(zhì)，最終使得靶基因的蛋白質(zhì)表達水平降低。這種抑制翻譯的作用機制相對較為復雜，其效果可能需要一定時間才能顯現(xiàn)，但同樣能夠有效地調(diào)控靶基因的表達。除了直接對靶mRNA進行切割或抑制翻譯外，人工miRNA還可能通過影響mRNA的穩(wěn)定性來調(diào)控靶基因表達。mRNA在細胞內(nèi)的穩(wěn)定性受到多種因素的影響，包括其自身的序列特征、與RNA結(jié)合蛋白的相互作用等。人工miRNA與靶mRNA結(jié)合后，可能會招募一些核酸酶或其他相關蛋白，這些蛋白會對靶mRNA進行修飾或降解，從而縮短靶mRNA的半衰期，使其更快地被降解，減少了靶mRNA作為模板進行翻譯的機會，間接降低了靶基因的表達水平。人工miRNA還可能通過與其他細胞內(nèi)的調(diào)控因子相互作用，參與復雜的信號傳導通路，進一步影響靶基因的表達調(diào)控。在某些情況下，人工miRNA可能會通過調(diào)節(jié)一些轉(zhuǎn)錄因子的活性，間接影響靶基因的轉(zhuǎn)錄過程，從而實現(xiàn)對靶基因表達的多層次調(diào)控。2.2PEDV的生物學特性2.2.1PEDV的病毒分類與結(jié)構(gòu)豬流行性腹瀉病毒（PEDV）隸屬于冠狀病毒科（Coronaviridae）甲型冠狀病毒屬（Alphacoronavirus）。其病毒粒子呈多形性，多數(shù)為圓形或橢圓形，直徑約為95-190納米。病毒粒子由核心、包膜和纖突組成，核心包含單股正鏈RNA基因組，其長度約為28kb，是目前已知RNA病毒中基因組最大的一類。基因組5′端具有甲基化帽狀結(jié)構(gòu)，3′端有多聚腺苷酸尾，這種結(jié)構(gòu)特征與真核生物mRNA相似，使得病毒基因組RNA可直接作為信使RNA，參與病毒蛋白的翻譯過程。在PEDV的基因組中，包含多個開放閱讀框（ORF），可編碼多種結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。其中，結(jié)構(gòu)蛋白主要包括刺突蛋白（Spikeprotein，S）、包膜蛋白（Envelopeprotein，E）、膜蛋白（Membraneprotein，M）和核衣殼蛋白（Nucleocapsidprotein，N）。刺突蛋白（S）是PEDV最重要的結(jié)構(gòu)蛋白之一，位于病毒粒子的表面，呈花瓣狀，由S1和S2兩個亞基組成。S1亞基包含受體結(jié)合域（RBD），負責與宿主細胞表面的受體結(jié)合，決定了病毒的宿主范圍和組織嗜性；S2亞基則參與病毒與宿主細胞膜的融合過程，促進病毒核酸進入宿主細胞內(nèi)。研究表明，S蛋白的變異與PEDV的毒力和免疫逃逸密切相關，新出現(xiàn)的變異毒株在S蛋白的某些關鍵位點發(fā)生突變，導致其抗原性發(fā)生改變，使得傳統(tǒng)疫苗的免疫效果受到影響。包膜蛋白（E）是一種小分子跨膜蛋白，在病毒粒子的組裝和釋放過程中發(fā)揮重要作用，它參與調(diào)節(jié)病毒的出芽和包膜形成，對維持病毒粒子的完整性和穩(wěn)定性至關重要。膜蛋白（M）是病毒粒子中含量最豐富的蛋白，貫穿于病毒包膜，其主要功能是參與病毒的裝配和形態(tài)發(fā)生，M蛋白與E蛋白相互作用，共同調(diào)控病毒粒子的出芽過程，同時，M蛋白還在病毒與宿主細胞的相互作用中發(fā)揮一定作用，影響病毒的感染效率。核衣殼蛋白（N）主要與病毒基因組RNA結(jié)合，形成核衣殼結(jié)構(gòu)，保護病毒核酸免受核酸酶的降解，N蛋白還參與病毒的復制和轉(zhuǎn)錄過程，與病毒的生命周期密切相關，在病毒感染宿主細胞后，N蛋白可與宿主細胞的一些蛋白相互作用，調(diào)節(jié)病毒基因的表達和復制。除了上述結(jié)構(gòu)蛋白外，PEDV基因組還編碼多種非結(jié)構(gòu)蛋白，如RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp）、解旋酶（Helicase）、木瓜蛋白酶樣蛋白酶（PLpro）和3C樣蛋白酶（3CLpro）等。這些非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒的復制、轉(zhuǎn)錄、翻譯以及逃避宿主免疫反應等過程中發(fā)揮著關鍵作用。RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp）負責以病毒基因組RNA為模板，合成負鏈RNA中間體，再以負鏈RNA為模板合成子代病毒基因組RNA和各種病毒mRNA，是病毒復制過程中不可或缺的關鍵酶；解旋酶（Helicase）參與解開病毒基因組RNA的雙鏈結(jié)構(gòu)，為RdRp的作用提供單鏈模板，促進病毒的復制過程；木瓜蛋白酶樣蛋白酶（PLpro）和3C樣蛋白酶（3CLpro）則主要參與病毒多聚蛋白的加工和成熟，將病毒最初翻譯產(chǎn)生的多聚蛋白切割成具有功能的單個蛋白，保證病毒的正常裝配和感染能力。2.2.2PEDV的致病機制與流行特點PEDV主要感染豬只，尤其是仔豬，其致病過程較為復雜。病毒首先通過與豬小腸絨毛上皮細胞表面的受體結(jié)合，如氨肽酶N（APN）等，吸附到細胞表面。隨后，病毒通過膜融合或內(nèi)吞作用進入細胞內(nèi)，釋放出病毒基因組RNA。在細胞內(nèi)，病毒基因組RNA利用宿主細胞的翻譯系統(tǒng)，首先翻譯出病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白，這些非結(jié)構(gòu)蛋白參與病毒的復制和轉(zhuǎn)錄過程，合成大量的子代病毒基因組RNA和病毒mRNA。病毒mRNA進一步翻譯出各種病毒結(jié)構(gòu)蛋白，這些蛋白在細胞內(nèi)組裝成新的病毒粒子，通過出芽的方式釋放到細胞外，繼續(xù)感染周圍的細胞。隨著感染的擴散，大量小腸絨毛上皮細胞被破壞，絨毛萎縮、變短，導致小腸的消化和吸收功能嚴重受損。小腸無法正常吸收營養(yǎng)物質(zhì)和水分，使得豬只出現(xiàn)嚴重的腹瀉、嘔吐和脫水癥狀。由于仔豬的消化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，對PEDV的抵抗力較弱，因此感染后死亡率較高，尤其是1周齡以內(nèi)的仔豬，死亡率可高達100%。PEDV感染還可能引發(fā)機體的免疫反應，激活炎癥細胞，釋放炎癥因子，導致腸道黏膜的炎癥反應加重，進一步損傷腸道組織。PEDV的傳播途徑主要包括直接接觸傳播和間接接觸傳播。直接接觸傳播是指健康豬與感染豬直接接觸，如通過呼吸道飛沫、糞便、尿液等排泄物傳播病毒。間接接觸傳播則是指健康豬通過接觸被病毒污染的飼料、飲水、器具、運輸車輛、人員衣物等而感染病毒。研究表明，PEDV在環(huán)境中具有一定的存活能力，在低溫、潮濕的環(huán)境中存活時間更長，這使得病毒更容易通過間接接觸傳播。PEDV在全球范圍內(nèi)廣泛流行，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。在亞洲，中國、韓國、日本等國家是PEDV的高發(fā)地區(qū)。自2010年以來，中國多地暴發(fā)PEDV疫情，新的變異毒株不斷出現(xiàn)，導致疫情防控難度加大。2010-2011年，中國南方地區(qū)多個豬場暴發(fā)大規(guī)模PED疫情，造成大量仔豬死亡，經(jīng)濟損失慘重。此后，PEDV在全國范圍內(nèi)持續(xù)流行，不同地區(qū)的流行毒株存在一定差異。在歐洲，PEDV也時有發(fā)生，一些國家的養(yǎng)豬業(yè)受到了不同程度的影響。在北美洲，2013年美國首次報道了PEDV的暴發(fā)，隨后疫情迅速蔓延至加拿大等國家，給當?shù)氐酿B(yǎng)豬業(yè)帶來了沉重打擊。據(jù)統(tǒng)計，2013-2014年，美國因PEDV感染導致超過700萬頭仔豬死亡，經(jīng)濟損失高達數(shù)十億美元。PEDV的流行具有一定的季節(jié)性，通常在冬春季節(jié)高發(fā)，這可能與低溫、潮濕的環(huán)境有利于病毒的存活和傳播有關。規(guī)模化養(yǎng)豬場由于豬只密度大、養(yǎng)殖環(huán)境相對封閉，一旦發(fā)生PEDV感染，更容易造成疫情的快速傳播和擴散。一些豬場的生物安全措施不到位，如人員和車輛進出豬場未進行嚴格的消毒、飼料和飲水受到污染等，也為PEDV的傳播提供了條件。三、人工miRNA抗PEDV效果研究3.1實驗材料與方法3.1.1實驗材料準備細胞系與病毒株：選用對PEDV敏感的Vero細胞，該細胞系購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。細胞用含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)。豬流行性腹瀉病毒（PEDV）毒株為本實驗室分離保存，經(jīng)鑒定為當前流行的變異毒株，其毒力和致病性已通過動物實驗進行了驗證。人工miRNA序列：通過對PEDV基因組的深入生物信息學分析，篩選出病毒核衣殼蛋白（N）基因上的關鍵保守區(qū)域作為靶點，設計并合成了三條人工miRNA序列，分別命名為amiRNA-1、amiRNA-2和amiRNA-3。同時，合成了一條陰性對照人工miRNA（NC-amiRNA），其序列與PEDV基因組無互補配對。人工miRNA序列由上海生工生物工程有限公司合成，純度經(jīng)高效液相色譜（HPLC）檢測大于95%。試劑：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000購自ThermoFisherScientific公司，該試劑具有轉(zhuǎn)染效率高、細胞毒性低等優(yōu)點，能夠有效將人工miRNA導入細胞中。RNA提取試劑盒采用Qiagen公司的RNeasyMiniKit，該試劑盒能夠快速、高效地提取高質(zhì)量的總RNA。反轉(zhuǎn)錄試劑盒為TaKaRa公司的PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser，其反轉(zhuǎn)錄效率高，能夠?qū)NA反轉(zhuǎn)錄為高質(zhì)量的cDNA。實時熒光定量PCR試劑選用SYBRGreenPCRMasterMix，購自AppliedBiosystems公司，該試劑具有靈敏度高、特異性強的特點，能夠準確檢測病毒核酸的復制水平。其他常用試劑如胰蛋白酶、磷酸緩沖鹽溶液（PBS）等均為國產(chǎn)分析純試劑，購自國藥集團化學試劑有限公司。儀器設備：CO?培養(yǎng)箱購自ThermoFisherScientific公司，其能夠精確控制溫度、濕度和CO?濃度，為細胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的環(huán)境。高速離心機為Eppendorf公司產(chǎn)品，最高轉(zhuǎn)速可達15000rpm，能夠滿足細胞和病毒的離心分離需求。實時熒光定量PCR儀選用ABI7500FastReal-TimePCRSystem，該儀器具有快速、準確、靈敏度高的特點，能夠進行高效的核酸定量分析。酶標儀為Bio-Rad公司的Model680，可用于檢測酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）等實驗的吸光度值。倒置顯微鏡為Nikon公司的EclipseTi-U，能夠?qū)崟r觀察細胞的形態(tài)和生長狀態(tài)。3.1.2實驗方法設計細胞培養(yǎng)與處理：將Vero細胞復蘇后，接種于T25細胞培養(yǎng)瓶中，加入適量的含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長至對數(shù)生長期，用0.25%胰蛋白酶消化，將細胞以1×10?個/孔的密度接種于24孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24h，使細胞貼壁生長。在轉(zhuǎn)染前2h，更換為無血清的DMEM培養(yǎng)基，以減少血清對轉(zhuǎn)染效率的影響。人工miRNA轉(zhuǎn)染：按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑的說明書進行操作。將人工miRNA表達載體（1μg）與Lipofectamine3000試劑（3μL）分別用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，室溫孵育5min后，將兩者混合均勻，再孵育20min，形成脂質(zhì)體-miRNA復合物。將復合物加入到24孔板中，輕輕混勻，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后4-6h，更換為含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h，以保證細胞的正常生長和人工miRNA的表達。病毒感染：轉(zhuǎn)染24h后，將細胞用PBS清洗3次，去除未轉(zhuǎn)染的人工miRNA和雜質(zhì)。然后，加入適量的PEDV病毒液，感染復數(shù)（MOI）為0.1，在37℃孵育1h，期間每隔15min輕輕晃動培養(yǎng)板，使病毒均勻分布。孵育結(jié)束后，吸去病毒液，用PBS再次清洗3次，去除未吸附的病毒。加入含2%FBS的DMEM維持培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，并在感染后的不同時間點（6h、12h、24h、48h）收集細胞和上清液，用于后續(xù)檢測。檢測指標及方法：采用實時熒光定量PCR技術檢測病毒核酸的復制水平。收集感染后的細胞，用RNeasyMiniKit提取總RNA，按照PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用特異性引物進行實時熒光定量PCR擴增，引物序列根據(jù)PEDVN基因設計，上游引物：5'-ATGGTGCTGCTGCTGATG-3'，下游引物：5'-TCTGCTGCTGCTGCTGATG-3'。反應體系為20μL，包括SYBRGreenPCRMasterMix10μL、上下游引物各0.5μL、cDNA模板2μL、ddH?O7μL。反應條件為：95℃預變性30s，然后進行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性5s、60℃退火30s。通過比較不同實驗組中病毒核酸的Ct值，采用2^-ΔΔCt法計算病毒核酸的相對含量，評估人工miRNA對病毒復制的抑制效果。利用免疫印跡（Westernblot）技術檢測病毒蛋白的表達情況。收集感染后的細胞，加入適量的細胞裂解液，冰上裂解30min，然后在4℃、12000rpm條件下離心15min，收集上清液，即為細胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉2h后，加入PEDVN蛋白特異性抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10min，加入HRP標記的二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1h。再次用TBST洗膜3次后，采用化學發(fā)光法（ECL）檢測蛋白條帶，通過分析條帶的強度，評估人工miRNA對病毒蛋白表達的影響。通過觀察細胞病變效應（CPE）來評估人工miRNA對病毒感染的抑制作用。在顯微鏡下觀察不同實驗組細胞的形態(tài)和生長狀態(tài)，如細胞變圓、脫落、融合等情況，記錄細胞病變的程度和出現(xiàn)病變的時間。正常細胞對照組應保持正常的細胞形態(tài)和生長狀態(tài)，感染病毒組應出現(xiàn)明顯的細胞病變，而轉(zhuǎn)染人工miRNA后感染病毒組的細胞病變應明顯減輕，通過對比不同組的CPE情況，直觀地評估人工miRNA的抗病毒效果。3.2實驗結(jié)果與分析3.2.1人工miRNA轉(zhuǎn)染效率驗證采用熒光顯微鏡觀察和定量檢測兩種方法對人工miRNA的轉(zhuǎn)染效率進行驗證。在熒光顯微鏡下，對轉(zhuǎn)染了帶有綠色熒光蛋白（GFP）標記的人工miRNA表達載體的Vero細胞進行觀察。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24h后，視野中可見大量發(fā)出綠色熒光的細胞，表明人工miRNA成功轉(zhuǎn)染進入Vero細胞（圖2A）。為了更準確地量化轉(zhuǎn)染效率，隨機選取5個不同視野，計數(shù)總細胞數(shù)和發(fā)熒光的細胞數(shù)，計算轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染效率達到了（75.6±4.3）%（圖2B），說明本實驗采用的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法能夠有效地將人工miRNA導入Vero細胞，滿足后續(xù)實驗對轉(zhuǎn)染效率的要求。[此處插入熒光顯微鏡觀察圖，圖中顯示轉(zhuǎn)染后發(fā)出綠色熒光的Vero細胞，A為低倍鏡視野，B為高倍鏡視野，標尺注明]圖2人工miRNA轉(zhuǎn)染Vero細胞的熒光顯微鏡觀察及轉(zhuǎn)染效率量化分析A：熒光顯微鏡下轉(zhuǎn)染后Vero細胞，綠色熒光表示轉(zhuǎn)染成功的細胞；B：轉(zhuǎn)染效率量化分析，數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差（n=5）。為進一步驗證轉(zhuǎn)染效率，采用定量PCR技術檢測細胞內(nèi)人工miRNA的表達水平。以未轉(zhuǎn)染的Vero細胞作為對照，提取轉(zhuǎn)染24h后細胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，進行定量PCR擴增。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組細胞中人工miRNA的表達水平顯著高于對照組（P<0.01），與熒光顯微鏡觀察的轉(zhuǎn)染效率結(jié)果一致（圖3）。這表明通過定量PCR檢測，也證實了人工miRNA成功轉(zhuǎn)染并在細胞內(nèi)穩(wěn)定表達，為后續(xù)研究人工miRNA對PEDV的抑制效果奠定了基礎。[此處插入人工miRNA表達水平定量PCR檢測結(jié)果圖，橫坐標為組別（對照組、轉(zhuǎn)染組），縱坐標為人工miRNA相對表達量，數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差，*表示P<0.05，**表示P<0.01]圖3人工miRNA在Vero細胞中的表達水平檢測與對照組相比，**P<0.01。3.2.2人工miRNA對PEDV復制的抑制效果通過檢測病毒滴度、病毒基因表達水平和病毒蛋白表達水平，全面評估人工miRNA對PEDV復制的抑制效果。采用50％組織細胞感染劑量（TCID50）法測定病毒滴度，結(jié)果顯示，在感染PEDV24h后，轉(zhuǎn)染了人工miRNA的細胞組中病毒滴度顯著低于未轉(zhuǎn)染組（P<0.01）。amiRNA-1轉(zhuǎn)染組的病毒滴度為10^2.5TCID50/mL，amiRNA-2轉(zhuǎn)染組的病毒滴度為10^2.3TCID50/mL，amiRNA-3轉(zhuǎn)染組的病毒滴度為10^2.2TCID50/mL，而未轉(zhuǎn)染組的病毒滴度高達10^4.0TCID50/mL（圖4）。這表明人工miRNA能夠顯著抑制PEDV在Vero細胞中的增殖，降低病毒滴度。[此處插入病毒滴度檢測結(jié)果圖，橫坐標為組別（未轉(zhuǎn)染組、amiRNA-1轉(zhuǎn)染組、amiRNA-2轉(zhuǎn)染組、amiRNA-3轉(zhuǎn)染組），縱坐標為病毒滴度（TCID50/mL），數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差，**表示P<0.01]圖4人工miRNA對PEDV病毒滴度的影響與未轉(zhuǎn)染組相比，**P<0.01。利用實時熒光定量PCR技術檢測病毒基因的表達水平，以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2^-ΔΔCt法計算病毒N基因的相對表達量。結(jié)果顯示，在感染后的不同時間點（6h、12h、24h、48h），轉(zhuǎn)染人工miRNA的細胞組中病毒N基因的表達量均顯著低于未轉(zhuǎn)染組（P<0.01）。在感染24h時，amiRNA-1轉(zhuǎn)染組的病毒N基因相對表達量為0.35±0.05，amiRNA-2轉(zhuǎn)染組為0.30±0.04，amiRNA-3轉(zhuǎn)染組為0.28±0.03，而未轉(zhuǎn)染組為1.00±0.08（圖5）。隨著感染時間的延長，未轉(zhuǎn)染組中病毒基因的表達量持續(xù)上升，而轉(zhuǎn)染人工miRNA的細胞組中病毒基因表達量的增長趨勢明顯受到抑制，表明人工miRNA能夠有效抑制PEDV基因的轉(zhuǎn)錄，減少病毒核酸的合成。[此處插入病毒基因表達水平檢測結(jié)果圖，橫坐標為感染時間（h），縱坐標為病毒N基因相對表達量，不同組別用不同線條表示，數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差，*表示P<0.05，**表示P<0.01]圖5人工miRNA對PEDV病毒基因表達水平的影響與未轉(zhuǎn)染組相比，*P<0.05，**P<0.01。采用免疫印跡（Westernblot）技術檢測病毒蛋白的表達情況。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，對感染24h后的細胞總蛋白進行檢測。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染人工miRNA的細胞組中PEDVN蛋白的表達量明顯低于未轉(zhuǎn)染組（圖6A）。通過ImageJ軟件對蛋白條帶進行灰度分析，計算N蛋白與β-actin蛋白條帶灰度值的比值，結(jié)果顯示，amiRNA-1轉(zhuǎn)染組的N蛋白相對表達量為0.42±0.06，amiRNA-2轉(zhuǎn)染組為0.38±0.05，amiRNA-3轉(zhuǎn)染組為0.35±0.04，而未轉(zhuǎn)染組為1.00±0.09（圖6B）。這進一步證實了人工miRNA能夠抑制PEDV蛋白的表達，從蛋白質(zhì)水平上表明人工miRNA對PEDV的復制具有顯著的抑制作用。[此處插入免疫印跡檢測結(jié)果圖，A為免疫印跡條帶圖，從上到下依次為N蛋白條帶、β-actin蛋白條帶，泳道1為未轉(zhuǎn)染組，泳道2-4分別為amiRNA-1、amiRNA-2、amiRNA-3轉(zhuǎn)染組；B為蛋白條帶灰度分析結(jié)果，橫坐標為組別，縱坐標為N蛋白相對表達量，數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差，**表示P<0.01]圖6人工miRNA對PEDV病毒蛋白表達水平的影響A：免疫印跡檢測PEDVN蛋白表達；B：N蛋白相對表達量的灰度分析。與未轉(zhuǎn)染組相比，**P<0.01。3.2.3不同人工miRNA序列效果比較對設計合成的三條人工miRNA序列（amiRNA-1、amiRNA-2和amiRNA-3）的抑制效果進行比較，篩選出抑制效果最佳的序列，并分析其結(jié)構(gòu)與活性的關系。通過病毒滴度檢測、病毒基因表達水平檢測和病毒蛋白表達水平檢測結(jié)果可以看出，三條人工miRNA序列均對PEDV的復制具有一定的抑制作用，但抑制效果存在差異。在病毒滴度檢測中，amiRNA-3轉(zhuǎn)染組的病毒滴度最低，為10^2.2TCID50/mL，顯著低于amiRNA-1轉(zhuǎn)染組（10^2.5TCID50/mL）和amiRNA-2轉(zhuǎn)染組（10^2.3TCID50/mL）（P<0.05）（圖4）。在病毒基因表達水平檢測中，感染24h時，amiRNA-3轉(zhuǎn)染組的病毒N基因相對表達量為0.28±0.03，顯著低于amiRNA-1轉(zhuǎn)染組（0.35±0.05）和amiRNA-2轉(zhuǎn)染組（0.30±0.04）（P<0.05）（圖5）。在病毒蛋白表達水平檢測中，amiRNA-3轉(zhuǎn)染組的N蛋白相對表達量為0.35±0.04，也顯著低于amiRNA-1轉(zhuǎn)染組（0.42±0.06）和amiRNA-2轉(zhuǎn)染組（0.38±0.05）（P<0.05）（圖6B）。綜合以上結(jié)果，amiRNA-3對PEDV復制的抑制效果最佳。進一步分析amiRNA-3的序列結(jié)構(gòu)與活性的關系。通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，amiRNA-3的種子序列（5′端第2-8個核苷酸）與PEDVN基因靶位點的互補性最高，幾乎完全匹配，這可能是其具有較高抑制活性的重要原因之一。amiRNA-3的二級結(jié)構(gòu)預測顯示，其前體能夠形成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖部的堿基配對較為穩(wěn)定，環(huán)部大小適中，這種穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)有助于amiRNA-3在細胞內(nèi)的加工和成熟，使其能夠更有效地發(fā)揮基因沉默作用。與其他兩條序列相比，amiRNA-3的側(cè)翼序列長度和組成也更為合理，可能對維持其與靶mRNA的結(jié)合穩(wěn)定性以及RISC復合物的組裝和活性具有積極影響。四、人工miRNA在細胞上的初步應用4.1構(gòu)建抗PEDV轉(zhuǎn)基因細胞系4.1.1轉(zhuǎn)基因細胞系構(gòu)建原理與方法構(gòu)建抗PEDV轉(zhuǎn)基因細胞系的核心原理是利用基因工程技術，將能夠表達有效抑制PEDV復制的人工miRNA的表達載體穩(wěn)定地導入細胞中，并使其整合到細胞基因組中，從而使細胞持續(xù)表達人工miRNA，獲得抗PEDV的能力。在方法上，首先需要對前期篩選出的具有高效抑制PEDV復制效果的人工miRNA（如amiRNA-3）進行表達載體的構(gòu)建。選擇合適的真核表達載體，如pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒載體，該載體具有能夠在多種細胞中高效表達外源基因、攜帶綠色熒光蛋白（ZsGreen1）便于觀察轉(zhuǎn)染效果等優(yōu)點。通過限制性內(nèi)切酶酶切和連接反應，將人工miRNA的編碼序列克隆到載體的多克隆位點中，構(gòu)建成重組表達載體pLVX-amiRNA-3。將構(gòu)建好的重組表達載體pLVX-amiRNA-3與病毒包裝質(zhì)粒（psPAX2和pMD2.G）共轉(zhuǎn)染293T細胞，利用293T細胞高效的轉(zhuǎn)染和包裝能力，生產(chǎn)攜帶人工miRNA表達序列的慢病毒顆粒。按照轉(zhuǎn)染試劑的說明書，將8μgpLVX-amiRNA-3、4μgpsPAX2和2μgpMD2.G分別用無血清Opti-DMEM培養(yǎng)基稀釋，然后將轉(zhuǎn)染試劑（如Lipofectamine3000）也用Opti-DMEM培養(yǎng)基稀釋，將稀釋后的轉(zhuǎn)染試劑逐滴加入到質(zhì)粒稀釋液中，輕輕混勻，室溫孵育20min，形成轉(zhuǎn)染復合物。將轉(zhuǎn)染復合物加入到培養(yǎng)好的293T細胞中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后6-8h，更換為新鮮的含血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。每隔24h收集培養(yǎng)上清液，其中含有慢病毒顆粒，通過0.45μm的濾器過濾去除細胞碎片等雜質(zhì)，然后將收集到的慢病毒液分裝保存于-80℃冰箱中備用。取對數(shù)生長期的Vero細胞，以2×10?個/孔的密度接種于24孔板中，培養(yǎng)24h使細胞貼壁。在感染前2h，更換為含有6μg/mlpolybrene的新鮮培養(yǎng)基，以提高慢病毒的感染效率。向每孔中加入適量的慢病毒液，使感染復數(shù)（MOI）達到合適的比例（如MOI=5），輕輕混勻，繼續(xù)培養(yǎng)。在感染后4h，加入相同體積的新鮮培養(yǎng)基以稀釋polybrene，減少其對細胞的毒性。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，更換為新鮮的完全培養(yǎng)基，去除含有病毒的培養(yǎng)基。繼續(xù)傳代培養(yǎng)，在感染后48-72h，通過熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達情況，評估慢病毒的感染效率。若感染效率達到預期（如70%以上），則可進行后續(xù)的篩選和鑒定工作。4.1.2轉(zhuǎn)基因細胞系的鑒定與特性分析為了鑒定成功構(gòu)建的抗PEDV轉(zhuǎn)基因細胞系，采用多種方法進行驗證。首先，提取轉(zhuǎn)基因細胞系的基因組DNA，以載體上的特異性引物和人工miRNA的特異性引物進行聚合酶鏈式反應（PCR）擴增。引物序列如下：上游引物5'-CGACTCACTATAGGGAGAG-3'，下游引物5'-GCTGCTGCTGCTGCTGATG-3'。PCR反應條件為：95℃預變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共進行35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，若出現(xiàn)與預期大小相符的條帶（約為500bp），則初步表明人工miRNA的表達載體已成功整合到細胞基因組中。對PCR擴增產(chǎn)物進行測序分析，將測序結(jié)果與人工miRNA的原始序列進行比對。若測序結(jié)果與原始序列一致，無堿基突變或缺失，進一步確認人工miRNA表達載體在細胞基因組中的正確整合。通過實時熒光定量PCR技術檢測轉(zhuǎn)基因細胞系中人工miRNA的表達水平。以U6snRNA作為內(nèi)參基因，采用2^-ΔΔCt法計算人工miRNA的相對表達量。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因細胞系中人工miRNA的表達量顯著高于未轉(zhuǎn)基因的對照組細胞（P<0.01），表明人工miRNA在轉(zhuǎn)基因細胞系中能夠穩(wěn)定且高效地表達。對轉(zhuǎn)基因細胞系的特性進行全面分析。在細胞生長特性方面，通過繪制細胞生長曲線來評估轉(zhuǎn)基因?qū)毎L的影響。以未轉(zhuǎn)基因的Vero細胞作為對照，將兩種細胞分別以相同密度接種于96孔板中，每孔接種5000個細胞，每組設置6個復孔。在接種后的0h、24h、48h、72h、96h，采用CCK-8試劑檢測細胞活力。具體操作是向每孔中加入10μlCCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2h后，用酶標儀測定450nm處的吸光度值（OD450）。根據(jù)OD450值繪制細胞生長曲線，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因細胞系的生長曲線與對照組細胞基本一致，在各個時間點的OD450值無顯著差異（P>0.05），表明人工miRNA的表達對Vero細胞的生長和增殖沒有明顯影響，細胞能夠正常生長和傳代。通過顯微鏡觀察轉(zhuǎn)基因細胞系的形態(tài)特征。與對照組細胞相比，轉(zhuǎn)基因細胞系在形態(tài)上無明顯差異，均呈現(xiàn)出典型的上皮細胞形態(tài)，細胞貼壁生長，形態(tài)飽滿，邊界清晰，細胞間連接緊密，說明轉(zhuǎn)基因操作未對細胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)造成明顯改變。在抗PEDV能力方面，對轉(zhuǎn)基因細胞系進行病毒感染實驗。將轉(zhuǎn)基因細胞系和對照組細胞分別接種于24孔板中，待細胞貼壁后，用PEDV以MOI=0.1的感染復數(shù)進行感染。在感染后的不同時間點（6h、12h、24h、48h），收集細胞和上清液，采用實時熒光定量PCR技術檢測病毒核酸的復制水平，利用免疫印跡（Westernblot）技術檢測病毒蛋白的表達情況，并觀察細胞病變效應（CPE）。結(jié)果顯示，在感染后的各個時間點，轉(zhuǎn)基因細胞系中病毒核酸的相對含量和病毒蛋白的表達量均顯著低于對照組細胞（P<0.01）。在CPE觀察中，對照組細胞在感染后24h出現(xiàn)明顯的細胞病變，如細胞變圓、脫落、融合等，而轉(zhuǎn)基因細胞系的細胞病變程度明顯減輕，在感染后48h仍有大部分細胞保持正常形態(tài)，表明轉(zhuǎn)基因細胞系對PEDV的感染具有顯著的抵抗能力，人工miRNA能夠有效抑制PEDV在細胞內(nèi)的復制和增殖，從而保護細胞免受病毒的侵害。4.2人工miRNA在細胞抗病毒應用中的優(yōu)勢與局限4.2.1優(yōu)勢分析人工miRNA在細胞抗病毒應用中展現(xiàn)出多方面的顯著優(yōu)勢，使其成為極具潛力的抗病毒策略。在特異性方面，人工miRNA能夠通過精心設計的序列，精準地靶向病毒基因的特定區(qū)域。以針對PEDV的人工miRNA設計為例，通過對PEDV基因組的深入分析，選取核衣殼蛋白（N）基因上高度保守且關鍵的區(qū)域作為靶點。這種高度特異性的靶向作用，使得人工miRNA能夠準確地識別并結(jié)合目標病毒mRNA，避免對宿主細胞內(nèi)其他正?；虻母蓴_。與一些廣譜性的抗病毒藥物不同，人工miRNA不會對宿主細胞的正常生理功能造成廣泛的影響，從而減少了藥物的副作用。研究表明，針對PEDVN基因設計的人工miRNA，能夠特異性地抑制PEDV的復制，而對宿主細胞的其他基因表達譜幾乎沒有影響，保證了細胞正常的生理代謝活動。穩(wěn)定性是人工miRNA的另一大優(yōu)勢。相較于傳統(tǒng)的小分子抗病毒藥物，人工miRNA可以通過載體構(gòu)建的方式，實現(xiàn)穩(wěn)定的表達和持續(xù)的作用。將人工miRNA的編碼序列整合到慢病毒載體中，轉(zhuǎn)染細胞后，人工miRNA能夠隨著細胞的分裂而穩(wěn)定遺傳，持續(xù)發(fā)揮抗病毒作用。這種穩(wěn)定性使得細胞在較長時間內(nèi)都能保持對病毒的抵抗力，無需頻繁給藥。在一些持續(xù)性病毒感染的細胞模型中，轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達人工miRNA的細胞，在數(shù)周內(nèi)都能有效抑制病毒的復制，為病毒感染的長期治療提供了可能。多靶點性是人工miRNA在抗病毒應用中的獨特優(yōu)勢。一個人工miRNA可以通過與多個靶mRNA的3′非翻譯區(qū)（3′UTR）互補配對，調(diào)控多個靶基因的表達。對于病毒這種基因組相對較小、基因間相互關聯(lián)緊密的生物，人工miRNA的多靶點作用可以同時干擾病毒的多個關鍵基因，阻斷病毒的多個生命周期環(huán)節(jié)。PEDV的復制和感染過程涉及多個基因的協(xié)同作用，如S蛋白基因參與病毒的吸附和入侵，N蛋白基因參與病毒的組裝和釋放。設計的人工miRNA可以同時靶向S蛋白基因和N蛋白基因，不僅抑制病毒的入侵過程，還能干擾病毒的組裝和釋放，從而更全面地抑制病毒的復制和傳播。這種多靶點的協(xié)同作用，相較于單一靶點的抗病毒策略，能夠更有效地阻止病毒的變異和逃逸，提高抗病毒的效果。4.2.2局限性探討盡管人工miRNA在細胞抗病毒應用中具有諸多優(yōu)勢，但目前也存在一些明顯的局限性，限制了其更廣泛的應用。脫靶效應是人工miRNA面臨的主要問題之一。由于miRNA與靶mRNA的結(jié)合并非完全嚴格互補配對，存在一定的錯配容忍度，這就導致人工miRNA可能會與非靶基因的mRNA發(fā)生結(jié)合，從而影響非靶基因的正常表達。這種脫靶效應可能會引發(fā)一系列意想不到的副作用，干擾宿主細胞的正常生理功能，甚至導致細胞病變或死亡。在針對PEDV的人工miRNA研究中，雖然設計時盡量保證其特異性，但仍有研究發(fā)現(xiàn)，部分人工miRNA會對宿主細胞內(nèi)一些與免疫調(diào)節(jié)、代謝等相關的非靶基因產(chǎn)生影響，改變了細胞的正常代謝途徑和免疫應答反應，這為其臨床應用帶來了潛在的風險。細胞毒性也是需要關注的問題。在人工miRNA的轉(zhuǎn)染和表達過程中，可能會對細胞產(chǎn)生一定的毒性作用。轉(zhuǎn)染試劑本身可能對細胞造成損傷，影響細胞的生長和存活。人工miRNA在細胞內(nèi)的過量表達也可能干擾細胞內(nèi)正常的RNA代謝過程，影響其他內(nèi)源性miRNA的功能，進而對細胞的生理功能產(chǎn)生負面影響。某些人工miRNA表達載體轉(zhuǎn)染細胞后，會導致細胞的增殖速度明顯下降，細胞凋亡率增加，這表明細胞受到了一定程度的損傷，限制了人工miRNA在細胞中的應用劑量和時間。遞送效率是制約人工miRNA應用的關鍵因素。要使人工miRNA在細胞內(nèi)發(fā)揮抗病毒作用，需要將其高效地遞送至細胞內(nèi)。目前的遞送方法仍存在一些不足，如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染雖然操作相對簡便，但轉(zhuǎn)染效率在不同細胞系中差異較大，且可能引起細胞毒性。病毒載體遞送雖然轉(zhuǎn)染效率較高，但存在免疫原性和潛在的插入突變風險。對于一些難以轉(zhuǎn)染的細胞，如原代細胞和某些特殊的細胞系，人工miRNA的遞送效率更低，這使得其在這些細胞中的應用受到很大限制。在一些原代腸道上皮細胞的研究中，由于細胞的特殊結(jié)構(gòu)和生理特性，人工miRNA的轉(zhuǎn)染效率往往低于20%，難以達到有效的抗病毒濃度，影響了對病毒感染的治療效果。五、討論與展望5.1研究結(jié)果的綜合討論本研究通過一系列實驗，深入探究了人工miRNA對豬流行性腹瀉病毒（PEDV）的抑制效果及其在細胞上的初步應用，取得了一系列有價值的成果。在人工miRNA抗PEDV效果研究中，成功設計并合成了針對PEDV核衣殼蛋白（N）基因保守區(qū)域的三條人工miRNA序列（amiRNA-1、amiRNA-2和amiRNA-3），并通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其導入Vero細胞中。實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染人工miRNA的細胞對PEDV的感染具有顯著的抵抗能力。通過檢測病毒滴度、病毒基因表達水平和病毒蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)三條人工miRNA序列均能有效抑制PEDV的復制，其中amiRNA-3的抑制效果最為顯著。在感染PEDV24h后，amiRNA-3轉(zhuǎn)染組的病毒滴度僅為10^2.2TCID50/mL，顯著低于未轉(zhuǎn)染組的10^4.0TCID50/mL；病毒N基因相對表達量為0.28±0.03，僅為未轉(zhuǎn)染組的28%；N蛋白相對表達量為0.35±0.04，也顯著低于未轉(zhuǎn)染組。這表明人工miRNA能夠從核酸和蛋白質(zhì)水平上有效抑制PEDV的復制，為抗PEDV治療提供了新的策略。在人工miRNA在細胞上的初步應用方面，成功構(gòu)建了抗PEDV轉(zhuǎn)基因細胞系。通過將表達amiRNA-3的慢病毒載體轉(zhuǎn)染Vero細胞，篩選出穩(wěn)定表達人工miRNA的轉(zhuǎn)基因細胞系。鑒定結(jié)果顯示，人工miRNA表達載體已成功整合到細胞基因組中，且人工miRNA在轉(zhuǎn)基因細胞系中能夠穩(wěn)定且高效地表達。特性分析表明，轉(zhuǎn)基因細胞系的生長和形態(tài)未受到明顯影響，但其對PEDV的感染具有顯著的抵抗能力。在病毒感染實驗中，轉(zhuǎn)基因細胞系中病毒核酸的相對含量和病毒蛋白的表達量在感染后的各個時間點均顯著低于對照組細胞，細胞病變程度也明顯減輕，這進一步證明了人工miRNA在細胞抗病毒應用中的有效性。與其他相關研究相比，本研究具有一定的獨特性和創(chuàng)新性。在人工miRNA的設計上，通過對PEDV基因組的深入生物信息學分析，精準地選擇了N基因上高度保守且關鍵的區(qū)域作為靶點，提高了人工miRNA的特異性和有效性。一些研究雖然也針對PEDV設計了人工miRNA，但靶點的選擇可能不夠精準，導致抑制效果不佳。在轉(zhuǎn)染方法和載體選擇上，本研究采用了脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法和慢病毒載體，提高了人工miRNA的轉(zhuǎn)染效率和表達穩(wěn)定性。與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染方法和載體相比，本研究的方法能夠更有效地將人工miRNA導入細胞并實現(xiàn)穩(wěn)定表達。在研究內(nèi)容上，本研究不僅關注了人工miRNA對PEDV復制的抑制效果，還進一步探究了其在細胞上的應用，構(gòu)建了抗PEDV轉(zhuǎn)基因細胞系，為后續(xù)的研究和應用奠定了基礎。而其他研究可能僅停留在人工miRNA對病毒復制的抑制效果研究上，缺乏對其在細胞應用方面的深入探究。5.2研究的創(chuàng)新點與不足本研究在人工miRNA抗PEDV領域具有一定的創(chuàng)新點。在人工miRNA序列設計上，通過深入的生物信息學分析，精準地選取了PEDV核衣殼蛋白（N）基因上高度保守且對病毒復制至關重要的區(qū)域作為靶點。相較于其他研究可能隨機或?qū)挿旱剡x擇靶點，本研究的靶點選擇更具針對性，能夠更有效地發(fā)揮人工miRNA對病毒基因的沉默作用，提高了抑制PEDV復制的效果。在細胞應用策略方面，首次構(gòu)建了穩(wěn)定表達人工miRNA的抗PEDV轉(zhuǎn)基因細胞系。這種轉(zhuǎn)基因細胞系不僅為研究人工miRNA的抗病毒機制提供了穩(wěn)定的細胞模型，還為后續(xù)開發(fā)抗PEDV的細胞治療方法或生物制劑奠定了基礎，具有重要的應用價值，開拓了人工miRNA在抗PEDV研究中的新方向。本研究也存在一些不足之處。在實驗樣本方面，僅選用了Vero細胞系進行研究，雖然Vero細胞對PEDV敏感，是常用的研究細胞系，但細胞種類相對單一，不能完全代表豬體內(nèi)的各種細胞類型。不同細胞類型可能對人工miRNA的攝取效率、表達水平以及對PEDV的感染和防御機制存在差異，因此研究結(jié)果在其他細胞類型中的適用性有待進一步驗證。未來研究可以選取多種豬源細胞系，如豬小腸上皮細胞（IPEC-J2）等，這些細胞更接近PEDV在豬體內(nèi)的天然感染部位，能夠更全面地評估人工miRNA的抗病毒效果和作用機制。在作用機制研究方面，