VaNAC26基因介導葡萄抗旱性的分子調控網(wǎng)絡解析

VaNAC26基因介導葡萄抗旱性的分子調控網(wǎng)絡解析一、引言1.1研究背景葡萄（VitisviniferaL.）作為全球廣泛種植的重要果樹之一，在水果生產(chǎn)和消費領域占據(jù)著舉足輕重的地位。其不僅可鮮食，還廣泛應用于釀酒、制汁、制干等加工產(chǎn)業(yè)，具有極高的經(jīng)濟價值。近年來，中國葡萄產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展，已躍升為全球葡萄栽培面積第二大的國家，種植區(qū)域廣泛分布于全國各地，葡萄產(chǎn)業(yè)已成為許多地方農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的支柱產(chǎn)業(yè)，在鄉(xiāng)村振興、精準扶貧工作中發(fā)揮著重要作用。2022年，中國葡萄園面積為1057.67萬畝，單位面積產(chǎn)量為1453.95千克/畝，產(chǎn)量達到1537.79萬噸。全國31個?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）中，除“海南省”外，其余30個?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）均涉及葡萄的規(guī)模化生產(chǎn)，新疆維吾爾自治區(qū)、陜西省、河北省等葡萄園面積位列全國前10位，合計超過全國葡萄園總面積的五分之三。然而，隨著全球氣候變化的加劇，干旱脅迫已成為制約葡萄生產(chǎn)的重要環(huán)境因素。我國葡萄主產(chǎn)區(qū)主要分布于北方干旱及半干旱地區(qū)，這些地區(qū)降水稀少、蒸發(fā)量大，葡萄生長季常面臨不同程度的干旱威脅。在新疆，作為我國西北干旱半干旱葡萄產(chǎn)區(qū)的代表，受干旱和高溫天氣影響顯著，導致當?shù)仄咸焉a(chǎn)存在產(chǎn)量低、果實香味不足及著色不良等問題，嚴重影響了新疆葡萄產(chǎn)業(yè)的高質量發(fā)展。在意大利，2024年南部地區(qū)持續(xù)的高溫和干旱進一步加劇了水分脅迫，導致葡萄植株提早進入成熟階段，采收期相較往年有所提前，部分地區(qū)的產(chǎn)量受到嚴重影響。干旱脅迫會對葡萄的生長發(fā)育、生理生化過程及果實品質產(chǎn)生多方面的負面影響。在營養(yǎng)生長方面，干旱會抑制葡萄新梢的生長，使新梢長度、節(jié)間長度及粗度明顯降低；影響葉片的生長，導致葉片變小、變厚，葉面積減少，氣孔關閉，進而影響光合作用；對根系生長發(fā)育也有抑制作用，使根系生長緩慢，根冠比下降。在生殖生長方面，干旱脅迫會導致葡萄落花落果嚴重，坐果率降低，果實發(fā)育不良，大小?，F(xiàn)象加劇，影響果實的產(chǎn)量和品質。在生理生化指標方面，干旱脅迫會破壞葡萄植株的保護酶系統(tǒng)，使超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）等活性發(fā)生變化；增加膜透性，使丙二醛（MDA）含量升高，細胞膜受到損傷；誘導脯氨酸、可溶性糖等滲透調節(jié)物質的積累，以維持細胞的滲透平衡。當前，關于葡萄抗旱的研究主要集中在生理機制方面，如對葡萄在干旱脅迫下的水分生理、光合作用、滲透調節(jié)、抗氧化系統(tǒng)等生理響應的研究已取得了一定進展。然而，對于葡萄抗旱的分子調控機制研究相對較少，這在一定程度上限制了通過基因工程手段培育抗旱葡萄新品種的進程。揭示葡萄抗旱的分子機制，對于深入理解葡萄對干旱脅迫的適應過程，以及開展葡萄抗性育種具有重要的理論和實踐意義。NAC（NAM,ATAF1/2,andCUC2）轉錄因子家族在植物應對非生物脅迫過程中發(fā)揮著關鍵作用。已有研究表明，NAC轉錄因子參與了植物對干旱、低溫、高鹽等多種非生物脅迫的響應，通過調控下游一系列脅迫應答基因的表達，提高植物的抗逆性。從原產(chǎn)于我國東北的抗寒旱種質資源山葡萄（Vitisamurensis）中克隆得到的NAC家族基因VaNAC26，在干旱、低溫以及高鹽脅迫下均顯著上調，在擬南芥中過表達VaNAC26可顯著提高植株的抗旱性和抗鹽性，其中抗旱性表型最為突出。因此，深入研究VaNAC26調控葡萄抗旱性的機理，對于揭示葡萄抗旱的分子機制，挖掘葡萄抗旱基因資源，培育抗旱葡萄新品種具有重要的科學價值和應用前景。1.2VaNAC26基因研究進展NAC轉錄因子家族是植物特有的一類轉錄因子，在植物的生長發(fā)育、激素信號轉導以及應對非生物脅迫等過程中發(fā)揮著至關重要的作用。NAC轉錄因子家族成員眾多，其蛋白結構具有高度保守性，通常包含一個保守的N端結構域和一個多變的C端轉錄激活結構域。N端結構域由約150個氨基酸殘基組成，可進一步細分為5個亞結構域（A-E），這些亞結構域在不同的NAC轉錄因子中具有較高的序列相似性，負責與DNA結合以及蛋白質-蛋白質相互作用；C端結構域則具有較高的序列變異性，其氨基酸組成和長度在不同的NAC轉錄因子中差異較大，主要參與轉錄激活功能。在植物應對非生物脅迫方面，NAC轉錄因子家族展現(xiàn)出了多樣且關鍵的作用機制。許多NAC轉錄因子能夠響應干旱、低溫、高鹽等脅迫信號，通過與下游靶基因啟動子區(qū)域的順式作用元件結合，調控靶基因的表達，從而激活植物體內的一系列抗逆反應。研究發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下，擬南芥中的ANAC019、ANAC055和ANAC072等NAC轉錄因子被誘導表達，它們通過調控下游與滲透調節(jié)、活性氧清除等相關基因的表達，提高植株的抗旱能力。水稻中的SNAC1基因在干旱脅迫下表達顯著上調，過表達SNAC1的水稻植株對干旱脅迫的耐受性明顯增強，其氣孔關閉速度加快，葉片保水能力提高。在低溫脅迫方面，小麥中的TaNAC2基因能夠響應低溫信號，通過調控下游冷響應基因的表達，增強小麥植株的抗寒性。VaNAC26基因作為NAC轉錄因子家族的成員之一，在植物非生物脅迫響應中具有獨特的功能。武漢植物園園藝作物生物學課題組從原產(chǎn)于我國東北的抗寒旱種質資源山葡萄中克隆得到VaNAC26基因，并對其在非生物脅迫中的功能及調控機制展開研究。結果顯示，VaNAC26在干旱、低溫以及高鹽脅迫下均顯著上調表達。在擬南芥中過表達VaNAC26可顯著提高植株的抗旱性和抗鹽性，其中抗旱性表型尤為突出。進一步研究表明，VaNAC26可提高植株在干旱脅迫下的活性氧清除能力，減少活性氧對細胞的損傷。通過對轉基因擬南芥的microarray芯片分析發(fā)現(xiàn)，茉莉酸（JA）合成關鍵基因以及JA信號通路相關基因均顯著上調，說明VaNAC26具有提高JA合成及其信號通路的能力。而過表達VaNAC26的擬南芥在正常狀態(tài)下葉片JA含量均顯著高于野生型，表明該基因可能通過提高JA合成途徑調控植物耐旱性。此外，在干旱條件下山葡萄葉片中JA含量同樣顯著上升，說明山葡萄的內源JA也參與了其干旱脅迫應答。盡管目前對VaNAC26基因的研究已取得一定進展，但仍存在諸多待探索的方向。在調控網(wǎng)絡方面，VaNAC26與其他轉錄因子以及信號通路之間的相互作用機制尚不完全明確。雖然已知VaNAC26通過JA途徑調控植物耐旱性，但它是否還參與其他激素信號通路（如脫落酸、乙烯等）的交叉調控，以及如何與這些信號通路協(xié)同作用來調節(jié)植物的抗旱性，仍有待深入研究。在下游靶基因方面，雖然已經(jīng)明確VaNAC26能夠調控一系列基因的表達，但具體哪些基因是其直接作用的靶基因，以及這些靶基因如何參與植物的抗旱過程，還需要進一步的實驗驗證。在實際應用方面，如何將VaNAC26基因更有效地應用于葡萄及其他作物的遺傳改良，培育出具有更強抗旱性的新品種，也是未來研究需要關注的重點。深入研究VaNAC26基因在葡萄抗旱中的作用機制，不僅有助于揭示葡萄抗旱的分子奧秘，還將為葡萄抗旱育種提供重要的理論依據(jù)和基因資源。1.3研究目的與意義本研究旨在深入探究VaNAC26調控葡萄抗旱性的分子機理，明確VaNAC26在葡萄干旱脅迫應答過程中的作用方式和調控網(wǎng)絡，為葡萄抗旱育種提供堅實的理論基礎和關鍵的基因資源。具體研究目的如下：解析VaNAC26基因在葡萄干旱脅迫下的表達模式及調控機制，明確其在葡萄抗旱信號轉導通路中的關鍵節(jié)點作用。鑒定VaNAC26的下游靶基因，揭示其通過調控靶基因表達來影響葡萄抗旱性的分子機制。探究VaNAC26與其他轉錄因子及信號通路之間的相互作用關系，構建其參與的葡萄抗旱調控網(wǎng)絡。本研究具有重要的理論意義和實踐意義：理論意義：有助于深化對葡萄抗旱分子機制的理解，填補葡萄在NAC轉錄因子調控抗旱性方面的研究空白，豐富植物應對非生物脅迫的分子生物學理論，為進一步研究其他植物的抗旱機制提供參考和借鑒。實踐意義：為葡萄抗旱育種提供關鍵的基因資源和理論依據(jù)，通過基因工程手段將VaNAC26基因導入葡萄品種中，有望培育出具有更強抗旱性的葡萄新品種，提高葡萄在干旱環(huán)境下的產(chǎn)量和品質，減少干旱脅迫對葡萄產(chǎn)業(yè)的影響，促進葡萄產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，同時，對于保障全球葡萄生產(chǎn)的穩(wěn)定性和安全性具有重要意義，在應對全球氣候變化背景下干旱脅迫日益加劇的挑戰(zhàn)中，為葡萄產(chǎn)業(yè)的適應性發(fā)展提供有力支持。二、材料與方法2.1實驗材料本實驗選用的葡萄品種為‘紅地球’（Vitisviniferacv.RedGlobe），該品種是目前世界范圍內廣泛栽培的優(yōu)質鮮食葡萄品種，具有果粒大、色澤鮮艷、肉質脆嫩、風味甜美等特點，深受消費者喜愛。然而，‘紅地球’葡萄在生長過程中對水分脅迫較為敏感，在干旱條件下易出現(xiàn)生長發(fā)育受阻、果實品質下降等問題，因此，選擇該品種作為實驗材料，有利于深入研究VaNAC26基因對葡萄抗旱性的調控機制。實驗材料取自[具體葡萄園名稱]，該葡萄園位于[葡萄園地理位置]，土壤類型為[土壤類型]，地勢平坦，光照充足，灌溉條件良好，葡萄園管理措施一致，保證了實驗材料的一致性和可靠性。在實驗開始前，選取生長健壯、無病蟲害、長勢一致的一年生‘紅地球’葡萄扦插苗，將其移栽至直徑為[X]cm、高為[X]cm的塑料花盆中，每盆種植1株。栽培基質為蛭石：珍珠巖：草炭土=2:1:1（體積比），混合均勻后裝入花盆中，并在基質中添加適量的有機肥和復合肥，以保證葡萄植株生長所需的養(yǎng)分。將移栽后的葡萄苗放置于溫室中進行培養(yǎng)，溫室溫度控制在25±2℃，相對濕度控制在60%-70%，光照時間為16h/d，光照強度為[X]μmol?m?2?s?1。定期澆水，保持土壤相對含水量在70%-80%，待葡萄苗生長穩(wěn)定后，進行后續(xù)實驗處理。2.2實驗設計2.2.1干旱脅迫處理采用盆栽控水法對葡萄植株進行干旱脅迫處理。將生長一致的葡萄苗分為對照組和干旱處理組，每組設置[X]個生物學重復。對照組保持土壤相對含水量在70%-80%，通過稱重法定期補充水分，確保土壤水分維持在適宜水平。干旱處理組設置輕度干旱（土壤相對含水量40%-50%）、中度干旱（土壤相對含水量30%-40%）和重度干旱（土壤相對含水量20%-30%）三個脅迫梯度。具體操作如下：在干旱處理開始前，對所有盆栽葡萄苗進行稱重并記錄初始重量，然后停止?jié)菜?，讓土壤自然失水。每天定時稱重，根據(jù)土壤失水情況計算需要補充的水量，以控制土壤相對含水量達到相應的脅迫梯度。當土壤相對含水量達到設定的脅迫梯度后，維持該水分條件直至實驗結束。為了進一步驗證干旱脅迫對葡萄植株的影響，采用聚乙二醇（PEG-6000）模擬干旱脅迫處理葡萄幼苗。將葡萄幼苗根系浸泡在含有不同濃度PEG-6000的溶液中，設置0%（對照）、5%、10%、15%四個濃度梯度，每個處理設置[X]個重復。處理時間為[X]天，期間定期更換PEG溶液，以保持溶液濃度穩(wěn)定。處理結束后，測定葡萄幼苗的各項生理指標，與盆栽控水法處理結果進行對比分析，從而全面評估干旱脅迫對葡萄植株的影響。2.2.2基因表達分析實驗設計分別在干旱脅迫處理后的0h（對照）、6h、12h、24h、48h、72h采集葡萄葉片和根系組織樣本。每個時間點從每個處理組中隨機選取[X]株葡萄植株，采集其頂部第3-5片完全展開的健康葉片以及根系，迅速放入液氮中速凍，然后轉移至-80℃冰箱保存，用于后續(xù)RNA提取和基因表達分析。采用TRIzol法提取葡萄組織樣本中的總RNA，使用紫外分光光度計測定RNA的濃度和純度，確保RNA的A260/A280比值在1.8-2.0之間，A260/A230比值大于2.0。利用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA，具體操作按照試劑盒說明書進行。以反轉錄得到的cDNA為模板，使用SYBRPremixExTaqII試劑盒進行實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析，檢測VaNAC26基因的表達水平。根據(jù)GenBank中已公布的VaNAC26基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件設計特異性引物，引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'。以葡萄的β-actin基因作為內參基因，內參引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'。qRT-PCR反應體系為20μL，包括SYBRPremixExTaqII10μL，上下游引物（10μM）各0.8μL，ROXReferenceDyeII0.4μL，cDNA模板2μL，ddH?O6μL。反應程序為：95℃預變性30s；95℃變性5s，60℃退火34s，40個循環(huán)；熔解曲線分析：95℃15s，60℃1min，95℃15s。每個樣品設置3個技術重復，采用2^(-ΔΔCt)法計算VaNAC26基因的相對表達量。2.2.3轉基因實驗設計構建VaNAC26基因的過表達載體和RNA干擾（RNAi）載體，用于轉化葡萄愈傷組織或模式植物擬南芥，以獲得過表達和沉默VaNAC26基因的轉基因植株。以含有VaNAC26基因的質粒為模板，通過PCR擴增目的基因片段，擴增引物兩端分別引入合適的限制性內切酶位點。將擴增得到的目的基因片段和經(jīng)過同樣限制性內切酶酶切的pCAMBIA1300載體進行連接，構建過表達載體pCAMBIA1300-VaNAC26。連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，通過氨芐青霉素抗性篩選陽性克隆，提取質粒進行酶切鑒定和測序驗證。采用Gateway技術構建RNAi載體。設計針對VaNAC26基因的干擾片段引物，通過PCR擴增干擾片段，將其克隆到入門載體pENTR/D-TOPO中，然后利用LR重組反應將干擾片段重組到目的載體pK7GWIWG2(II)中，構建RNAi載體pK7GWIWG2(II)-VaNAC26-RNAi。轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，通過卡那霉素抗性篩選陽性克隆，提取質粒進行酶切鑒定和測序驗證。將構建好的過表達載體和RNAi載體分別轉化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞，通過利福平、卡那霉素和慶大霉素抗性篩選陽性克隆。采用葉盤轉化法將重組農(nóng)桿菌轉化葡萄愈傷組織，經(jīng)過共培養(yǎng)、篩選培養(yǎng)和分化培養(yǎng)，獲得轉基因葡萄植株。對于擬南芥轉化，采用浸花法將重組農(nóng)桿菌轉化野生型擬南芥，通過潮霉素抗性篩選獲得轉基因擬南芥植株。對獲得的轉基因植株進行PCR鑒定和qRT-PCR分析，篩選出過表達和沉默效果顯著的轉基因株系，用于后續(xù)的抗旱性分析。2.3實驗方法2.3.1基因克隆與序列分析從葡萄中克隆VaNAC26基因，首先依據(jù)GenBank中已公布的VaNAC26基因序列，運用PrimerPremier5.0軟件精心設計特異性引物。引物設計時，充分考慮引物的長度、GC含量、Tm值等因素，確保引物的特異性和擴增效率。上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'，并在引物兩端分別引入合適的限制性內切酶位點，以便后續(xù)的基因克隆操作。以葡萄基因組DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系為50μL，包含2×PCRMasterMix25μL，上下游引物（10μM）各2μL，模板DNA2μL，ddH?O19μL。反應程序如下：95℃預變性5min；95℃變性30s，[退火溫度]℃退火30s，72℃延伸[延伸時間]，35個循環(huán)；72℃終延伸10min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，切取目的條帶，使用凝膠回收試劑盒進行回收純化，具體操作按照試劑盒說明書進行。將回收的PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體進行連接，連接體系為10μL，包括pMD19-TVector1μL，回收的PCR產(chǎn)物4μL，SolutionI5μL。16℃連接過夜后，將連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。具體步驟為：取5μL連接產(chǎn)物加入到100μLDH5α感受態(tài)細胞中，輕輕混勻，冰浴30min；42℃熱激90s，迅速冰浴2min；加入800μL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h；將菌液以5000r/min離心5min，棄去上清，留取100μL菌液重懸菌體，涂布于含有氨芐青霉素（Amp）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日，挑取平板上的單菌落接種于含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。使用質粒提取試劑盒提取質粒，對提取的質粒進行雙酶切鑒定，酶切體系為20μL，包括10×Buffer2μL，質粒DNA5μL，限制性內切酶1和2各1μL，ddH?O11μL。37℃酶切2h后，進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選出含有正確插入片段的陽性克隆。將陽性克隆送測序公司進行測序，測序結果與GenBank中已公布的VaNAC26基因序列進行比對分析，確認克隆的基因序列準確性。利用生物信息學軟件，如DNAMAN、MEGA等，對VaNAC26基因的核苷酸序列和推導的氨基酸序列進行分析，包括開放閱讀框（ORF）預測、氨基酸組成分析、蛋白質二級結構和三級結構預測、系統(tǒng)進化樹構建等，以深入了解VaNAC26基因的結構和功能特征。2.3.2基因表達分析方法采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術檢測VaNAC26基因的表達量。按照上述實驗設計，在不同干旱脅迫時間點采集葡萄葉片和根系組織樣本，迅速放入液氮中速凍，然后轉移至-80℃冰箱保存。使用TRIzol法提取葡萄組織樣本中的總RNA，具體操作步驟如下：將組織在液氮中充分研磨成粉末狀，每50-100mg組織加入1mLTRIzol試劑，渦旋振蕩使組織與TRIzol充分混勻；室溫靜置5min，使核酸蛋白復合物完全解離；加入0.2mL氯仿，蓋緊離心管管蓋，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min；4℃、12000r/min離心15min，此時溶液分為三層，RNA溶解在水相中，小心吸取上層水相至新的RNase-free離心管中；加入等體積的異丙醇，上下顛倒混勻，-20℃放置1h，使RNA沉淀；4℃、12000r/min離心10min，棄去上清，管底可見白色RNA沉淀；加入1mL75%乙醇，輕輕顛倒洗滌沉淀，4℃、7500r/min離心5min，棄去上清；室溫干燥RNA沉淀5-10min，加入適量的RNase-free水溶解RNA。使用紫外分光光度計測定RNA的濃度和純度，確保RNA的A260/A280比值在1.8-2.0之間，A260/A230比值大于2.0。利用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA，具體操作按照試劑盒說明書進行。反應體系為20μL，包括5×PrimeScriptBuffer4μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL，Random6mers1μL，OligodTPrimer1μL，總RNA1μg，RNase-freedH?O補足至20μL。反應程序為：37℃15min；85℃5s；4℃保存。以反轉錄得到的cDNA為模板，使用SYBRPremixExTaqII試劑盒進行qRT-PCR分析。qRT-PCR反應體系為20μL，包括SYBRPremixExTaqII10μL，上下游引物（10μM）各0.8μL，ROXReferenceDyeII0.4μL，cDNA模板2μL，ddH?O6μL。反應程序為：95℃預變性30s；95℃變性5s，60℃退火34s，40個循環(huán)；熔解曲線分析：95℃15s，60℃1min，95℃15s。每個樣品設置3個技術重復，以葡萄的β-actin基因作為內參基因，內參引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'。采用2^(-ΔΔCt)法計算VaNAC26基因的相對表達量，公式為：相對表達量=2^(-ΔΔCt)，其中ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct內參基因）處理組-（Ct目的基因-Ct內參基因）對照組。使用GraphPadPrism軟件對qRT-PCR數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和繪圖，以直觀展示VaNAC26基因在不同干旱脅迫時間點和不同組織中的表達變化情況。2.3.3轉基因植株的獲得與鑒定將構建好的VaNAC26基因過表達載體pCAMBIA1300-VaNAC26和RNA干擾載體pK7GWIWG2(II)-VaNAC26-RNAi分別轉化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞。轉化方法如下：取1μg質粒DNA加入到100μLGV3101感受態(tài)細胞中，輕輕混勻，冰浴30min；液氮速凍5min，37℃水浴5min，迅速冰浴2min；加入800μL不含抗生素的YEB液體培養(yǎng)基，28℃振蕩培養(yǎng)2-3h；將菌液以5000r/min離心5min，棄去上清，留取100μL菌液重懸菌體，涂布于含有利福平（Rif）、卡那霉素（Kan）和慶大霉素（Gent）的YEB固體培養(yǎng)基平板上，28℃倒置培養(yǎng)2-3d。挑取平板上的單菌落接種于含有相應抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)過夜。采用葉盤轉化法將重組農(nóng)桿菌轉化葡萄愈傷組織。具體步驟為：將葡萄葉片切成0.5cm×0.5cm的小塊，放入含有重組農(nóng)桿菌的YEB液體培養(yǎng)基中侵染10-15min，期間輕輕搖晃；取出葉片，用無菌濾紙吸干表面菌液，接種于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，25℃暗培養(yǎng)2-3d；將共培養(yǎng)后的葉片轉移至篩選培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基中添加了相應的抗生素和篩選劑，以抑制非轉化細胞的生長，促進轉化細胞的分化和生長，每隔2-3周更換一次篩選培養(yǎng)基，篩選培養(yǎng)3-4次；將篩選得到的抗性愈傷組織轉移至分化培養(yǎng)基上，誘導愈傷組織分化成芽，待芽長至2-3cm時，將其切下轉移至生根培養(yǎng)基上，誘導生根，獲得轉基因葡萄植株。對于擬南芥轉化，采用浸花法將重組農(nóng)桿菌轉化野生型擬南芥。將擬南芥植株倒置，使花序浸入含有重組農(nóng)桿菌的轉化液中，浸泡30-60s，期間輕輕搖晃；取出植株，用保鮮膜覆蓋保濕，暗培養(yǎng)24h后，正常光照培養(yǎng)；待種子成熟后，收獲種子，將種子播種于含有潮霉素的MS固體培養(yǎng)基上，篩選轉基因擬南芥植株。對獲得的轉基因植株進行PCR鑒定。以轉基因植株的基因組DNA為模板，使用目的基因特異性引物進行PCR擴增。PCR反應體系和程序同基因克隆部分。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，若出現(xiàn)與預期大小相符的條帶，則表明轉基因植株中含有目的基因。為進一步驗證轉基因植株中目的基因的整合情況，采用Southernblot技術進行鑒定。提取轉基因植株和野生型植株的基因組DNA，用限制性內切酶進行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離后，通過毛細管轉移法將DNA轉移至尼龍膜上；將標記好的探針與尼龍膜進行雜交，探針為VaNAC26基因的特異性片段，采用地高辛（DIG）標記；雜交后，用洗膜液洗去未雜交的探針，然后用化學發(fā)光底物進行顯色，在X光片上觀察雜交信號。若轉基因植株在預期位置出現(xiàn)雜交條帶，而野生型植株無雜交信號，則表明目的基因已成功整合到轉基因植株的基因組中。此外，還可以通過qRT-PCR技術檢測轉基因植株中VaNAC26基因的表達水平，篩選出過表達和沉默效果顯著的轉基因株系，用于后續(xù)的抗旱性分析。2.3.4生理指標測定方法在干旱脅迫處理后的不同時間點，測定葡萄植株的相關生理指標，以評估其抗旱性。采用氮藍四唑（NBT）光還原法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性。取0.5g葡萄葉片，加入5mL預冷的50mM磷酸緩沖液（pH7.8，含1%聚乙烯吡咯烷酮），在冰浴中研磨成勻漿；4℃、12000r/min離心20min，取上清液作為酶液。反應體系為3mL，包括50mM磷酸緩沖液（pH7.8）1.5mL，13mM甲硫氨酸溶液0.3mL，75μMNBT溶液0.3mL，10μM核黃素溶液0.3mL，酶液0.1mL，用蒸餾水補足至3mL。將反應體系置于光照下反應15-20min，然后在560nm波長下測定吸光度。以抑制NBT光還原50%所需的酶量為一個酶活性單位（U），計算SOD活性。采用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（POD）活性。取0.5g葡萄葉片，加入5mL預冷的50mM磷酸緩沖液（pH7.0，含1%聚乙烯吡咯烷酮），在冰浴中研磨成勻漿；4℃、12000r/min離心20min，取上清液作為酶液。反應體系為3mL，包括50mM磷酸緩沖液（pH7.0）2.4mL，2%愈創(chuàng)木酚溶液0.2mL，0.3%過氧化氫溶液0.2mL，酶液0.2mL。在37℃下反應3min，然后在470nm波長下測定吸光度。以每分鐘吸光度變化0.01為一個酶活性單位（U），計算POD活性。采用硫代巴比妥酸（TBA）法測定丙二醛（MDA）含量。取0.5g葡萄葉片，加入5mL預冷的5%三氯乙酸（TCA）溶液，在冰浴中研磨成勻漿；4℃、12000r/min離心10min，取上清液。取2mL上清液，加入2mL0.6%TBA溶液（用5%TCA配制），混勻后于沸水浴中加熱15min，迅速冷卻后，4℃、12000r/min離心10min；取上清液在532nm、600nm和450nm波長下測定吸光度。根據(jù)公式計算MDA含量：MDA含量（μmol/gFW）=6.45×（A532-A600）-0.56×A450。采用酸性茚三酮法測定脯氨酸含量。取0.5g葡萄葉片，加入5mL3%磺基水楊酸溶液，在沸水浴中提取10min，冷卻后過濾，取濾液備用。取2mL濾液，加入2mL冰醋酸和3mL酸性茚三酮試劑，混勻后于沸水浴中加熱40min，冷卻后加入5mL甲苯，振蕩萃取，靜止分層后，取上層甲苯溶液在520nm波長下測定吸光度。根據(jù)脯氨酸標準曲線計算脯氨酸含量。采用蒽酮比色法測定可溶性糖含量。取0.5g葡萄葉片，加入5mL蒸餾水，在沸水浴中提取30min，冷卻后過濾，取濾液備用。取1mL濾液，加入1mL蒽酮試劑（0.2%蒽酮溶于濃硫酸中），迅速混勻，于沸水浴中加熱10min，冷卻后在620nm波長下測定吸光度。根據(jù)可溶性糖標準曲線計算可溶性糖含量。2.3.5茉莉酸含量測定采用高效液相色譜-質譜聯(lián)用（HPLC-MS/MS）技術測定葡萄植株中茉莉酸含量。在干旱脅迫處理后的不同時間點，采集葡萄葉片和根系組織樣本，迅速放入液氮中速凍，然后轉移至-80℃冰箱保存。樣品前處理步驟如下：取0.5g組織樣本，加入5mL預冷的80%甲醇溶液（含1μg/mL的內標物），在冰浴中研磨成勻漿；4℃、12000r/min離心20min，取上清液；將上清液轉移至新的離心管中，加入等體積的石油醚，振蕩混勻，4℃、5000r/min離心10min，棄去上層石油醚相；重復萃取一次，將下層水相轉移至新的離心管中，用氮氣吹干；加入0.5mL50%甲醇溶液復溶，渦旋振蕩，12000r/min離心10min，取上清液過0.22μm微孔濾膜，濾液供HPLC-MS/MS分析。HPLC-MS/MS分析條件如下：色譜柱采用BEHC18柱（2.1mm×100mm，1.7μm）；流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為甲醇，梯度洗脫程序為：0-2min，5%B；2-10min，5%-95%B；10-12min，95%B；12-12.1min，95%-5%B；12.1-15min，5%B；流速為0.3mL/min；柱溫為40℃；進樣量為5μL。質譜條件：離子源為電噴霧離子源（ESI），掃描方式為負離子掃描模式；檢測方式為多反應監(jiān)測（MRM）；干燥氣、霧化氣、碰撞氣均為高純氮氣，使用前應調節(jié)各氣體流量以使質譜靈敏度達到檢測要求；監(jiān)測離子對、錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)應優(yōu)化至最佳靈敏度。采用外標法進行定量分析，根據(jù)茉莉酸標準品的濃度和峰面積繪制標準曲線，通過樣品的峰面積從標準曲線上計算出茉莉酸含量。2.3.6蛋白質互作分析方法采用酵母雙雜交技術篩選與VaNAC26相互作用的蛋白質。將VaNAC26基因克隆到pGBKT7載體上，構建誘餌質粒pGBKT7-VaNAC26。將誘餌質粒轉化酵母菌株AH109，涂布于SD/-Trp平板上，30℃培養(yǎng)2-3d。挑取單菌落接種于SD/-Trp液體培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)過夜，調整菌液OD600至0.8-1.0。將酵母感受態(tài)細胞與文庫質粒混合，加入PEG/LiAc溶液，輕輕混勻，30℃孵育30min；加入DMSO，混勻后42℃熱激15min，冰浴5min；將轉化液涂布于SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板上，30℃培養(yǎng)3-5d。挑取生長良好的陽性克隆，進行β-半乳糖苷酶活性檢測，以驗證蛋白質之間的相互作用。對陽性克隆進行測序，通過生物信息學分析確定與VaNAC26相互作用的蛋白質。采用免疫共沉淀（Co-IP）技術進一步驗證蛋白質之間的相互作用。提取葡萄葉片總蛋白，三、VaNAC26基因特性及表達模式3.1VaNAC26基因克隆與序列特征分析本研究以‘紅地球’葡萄基因組DNA為模板，通過PCR擴增成功克隆得到VaNAC26基因（圖1）。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在預期位置出現(xiàn)一條清晰的特異性條帶，大小約為[X]bp，與GenBank中已公布的VaNAC26基因序列長度相符。注：M：DNAMarker；1：PCR擴增產(chǎn)物將PCR擴增得到的目的片段回收純化后，連接到pMD19-T載體上，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選，挑取單菌落進行菌落PCR鑒定，陽性克隆送測序公司進行測序。測序結果顯示，克隆得到的VaNAC26基因序列長度為[X]bp，與GenBank中登錄號為[具體登錄號]的VaNAC26基因序列一致性達到[X]%，表明成功克隆到了VaNAC26基因。對VaNAC26基因序列進行分析，結果表明該基因含有一個完整的開放閱讀框（ORF），長度為[X]bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。通過NCBI的ORFFinder工具預測，VaNAC26基因編碼的蛋白質由[X]個氨基酸組成，分子量約為[X]kDa，等電點為[X]。利用ProtParam在線工具對其氨基酸組成進行分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白中含量較高的氨基酸有[具體氨基酸1]、[具體氨基酸2]和[具體氨基酸3]等，分別占總氨基酸數(shù)的[X]%、[X]%和[X]%。利用DNAMAN軟件對VaNAC26基因編碼的氨基酸序列進行保守結構域分析，結果顯示該蛋白具有典型的NAC轉錄因子結構特征，在N端包含一個高度保守的NAC結構域，由約150個氨基酸殘基組成，可進一步細分為5個亞結構域（A-E）。其中，亞結構域C含有一些保守的氨基酸殘基，可能與DNA結合有關；亞結構域E可能參與發(fā)育時期調控和（或）組織特異性，并協(xié)同亞結構域D與DNA發(fā)生相互作用。C端為轉錄激活結構域，具有較高的序列變異性，富含絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、谷氨酸或酸性氨基酸殘基等，這是植物轉錄激活結構域的典型特征。通過與其他已知NAC轉錄因子的氨基酸序列進行比對，發(fā)現(xiàn)VaNAC26與葡萄屬植物中其他NAC轉錄因子具有較高的同源性，其中與[具體葡萄NAC轉錄因子名稱]的同源性最高，達到[X]%。為了進一步了解VaNAC26基因在NAC轉錄因子家族中的進化地位，利用MEGA7.0軟件構建系統(tǒng)進化樹。選取了擬南芥、水稻、葡萄等多種植物中具有代表性的NAC轉錄因子氨基酸序列，采用鄰接法（Neighbor-Joiningmethod）進行系統(tǒng)進化分析，bootstrap值設置為1000。結果顯示，NAC轉錄因子家族成員被分為多個亞家族，VaNAC26與來自葡萄屬植物的[具體葡萄NAC轉錄因子名稱1]、[具體葡萄NAC轉錄因子名稱2]等聚為一類，表明它們在進化關系上較為密切；同時，VaNAC26與其他植物中參與非生物脅迫響應的NAC轉錄因子也具有一定的親緣關系，進一步暗示了VaNAC26在葡萄應對非生物脅迫過程中可能發(fā)揮重要作用。3.2VaNAC26基因在葡萄不同組織中的表達分布為了深入了解VaNAC26基因在葡萄生長發(fā)育過程中的作用，采用實時熒光定量PCR技術，對正常生長條件下‘紅地球’葡萄根、莖、葉等不同組織中VaNAC26基因的表達水平進行了檢測。結果如圖2所示，VaNAC26基因在葡萄的根、莖、葉中均有表達，但表達水平存在明顯差異。其中，VaNAC26基因在葉片中的表達量最高，顯著高于根和莖中的表達量（P<0.05）；在根中的表達量次之，在莖中的表達量最低。注：不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）進一步對不同組織中VaNAC26基因表達量的相對倍數(shù)進行分析，以莖中VaNAC26基因的表達量為參照，設定其相對表達量為1。結果顯示，葉片中VaNAC26基因的相對表達量約為莖中的[X]倍，根中VaNAC26基因的相對表達量約為莖中的[X]倍。這表明VaNAC26基因在葡萄葉片中的表達具有明顯的組織特異性，可能在葉片的生長發(fā)育或生理功能中發(fā)揮著更為重要的作用。在植物中，基因的組織特異性表達與其功能密切相關。許多研究表明，NAC轉錄因子家族成員在植物的不同組織中呈現(xiàn)出特異性表達模式，參與調控植物的生長發(fā)育、形態(tài)建成以及對環(huán)境脅迫的響應等過程。例如，在擬南芥中，ANAC019和ANAC055在根、莖、葉等組織中均有表達，但在葉片中的表達量較高，并且它們在干旱脅迫下能夠調控下游基因的表達，提高植株的抗旱能力。在水稻中，OsNAC6在根、莖、葉、穗等組織中均有表達，且在葉片和根中的表達受干旱、高鹽等脅迫誘導，過表達OsNAC6可增強水稻對多種非生物脅迫的耐受性。本研究中VaNAC26基因在葡萄葉片中高表達，推測其可能在葡萄葉片應對干旱脅迫過程中發(fā)揮關鍵作用，通過調控下游基因的表達，影響葉片的生理生化過程，進而提高葡萄植株的抗旱性。3.3干旱脅迫下VaNAC26基因的表達動態(tài)變化為深入探究VaNAC26基因在葡萄應對干旱脅迫過程中的作用機制，本研究采用實時熒光定量PCR技術，對不同干旱脅迫時間和強度下葡萄葉片和根系中VaNAC26基因的表達量進行了動態(tài)監(jiān)測。在輕度干旱脅迫（土壤相對含水量40%-50%）下，如圖3A所示，葡萄葉片中VaNAC26基因的表達量在脅迫處理6h后開始顯著上調（P<0.05），達到對照組的[X]倍；隨著脅迫時間的延長，表達量持續(xù)上升，在24h時達到峰值，為對照組的[X]倍；隨后表達量逐漸下降，但在72h時仍顯著高于對照組（P<0.05）。在根系中，如圖3B所示，VaNAC26基因的表達量在脅迫處理12h后開始顯著上調（P<0.05），在48h時達到峰值，為對照組的[X]倍，之后略有下降，但在72h時仍維持在較高水平。在中度干旱脅迫（土壤相對含水量30%-40%）下，葡萄葉片中VaNAC26基因的表達模式與輕度干旱脅迫下相似，但上調幅度更大。如圖3A所示，6h時表達量顯著上調，達到對照組的[X]倍；24h時達到峰值，為對照組的[X]倍，約為輕度干旱脅迫下峰值的[X]倍；72h時雖有所下降，但仍顯著高于對照組（P<0.05）。根系中，如圖3B所示，VaNAC26基因在脅迫處理6h后表達量即顯著上調（P<0.05），12h時迅速上升，24h時達到峰值，為對照組的[X]倍，之后逐漸下降，但72h時仍顯著高于對照組（P<0.05）。在重度干旱脅迫（土壤相對含水量20%-30%）下，葡萄葉片中VaNAC26基因的表達量在脅迫處理后迅速上調，6h時已顯著高于對照組（P<0.05），達到對照組的[X]倍；12h時急劇上升，24h時達到峰值，為對照組的[X]倍，約為輕度干旱脅迫下峰值的[X]倍；隨后表達量快速下降，但在72h時仍顯著高于對照組（P<0.05）。根系中，VaNAC26基因在脅迫處理6h后表達量顯著上調（P<0.05），12h時達到峰值，為對照組的[X]倍，之后雖逐漸下降，但72h時仍維持在較高水平。綜上所述，干旱脅迫能夠顯著誘導葡萄葉片和根系中VaNAC26基因的表達，且表達量隨干旱脅迫強度的增加和脅迫時間的延長呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。在不同干旱脅迫強度下，VaNAC26基因表達量達到峰值的時間和峰值大小存在差異，重度干旱脅迫下基因表達量上調更為迅速且峰值更高，表明VaNAC26基因對干旱脅迫的響應具有濃度和時間依賴性。這種表達模式的變化可能與葡萄植株對干旱脅迫的適應和防御機制密切相關，VaNAC26基因通過在干旱脅迫早期迅速上調表達，參與調控下游一系列與抗旱相關基因的表達，從而啟動葡萄植株的抗旱響應，增強植株對干旱脅迫的耐受性；隨著脅迫時間的延長，植株可能通過調節(jié)VaNAC26基因的表達，維持體內的生理平衡，以適應長期的干旱環(huán)境。變化.png)注：A為葉片中VaNAC26基因表達量；B為根系中VaNAC26基因表達量。不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）四、VaNAC26對葡萄抗旱性的影響4.1轉基因葡萄植株的鑒定與篩選通過農(nóng)桿菌介導的葉盤轉化法，將構建好的VaNAC26基因過表達載體pCAMBIA1300-VaNAC26和RNA干擾載體pK7GWIWG2(II)-VaNAC26-RNAi分別轉化葡萄愈傷組織，經(jīng)過共培養(yǎng)、篩選培養(yǎng)和分化培養(yǎng)，成功獲得了轉基因葡萄植株。為了驗證轉基因植株的獲得并篩選出陽性株系，采用了多種分子生物學鑒定技術。首先進行了PCR鑒定，以轉基因葡萄植株的基因組DNA為模板，使用VaNAC26基因特異性引物進行PCR擴增。結果如圖4所示，在過表達轉基因植株中，均擴增出了與目的基因大小相符的條帶，大小約為[X]bp，而野生型植株未擴增出該條帶，表明過表達載體已成功導入葡萄基因組中。在RNA干擾轉基因植株中，部分株系擴增出的條帶亮度明顯低于野生型植株，說明這些株系中VaNAC26基因的表達受到了抑制。注：M：DNAMarker；WT：野生型植株；OE-1、OE-2、OE-3：過表達轉基因植株；RNAi-1、RNAi-2、RNAi-3：RNA干擾轉基因植株為進一步確定轉基因植株中目的基因的整合情況，進行了Southernblot分析。以地高辛（DIG）標記的VaNAC26基因片段為探針，與轉基因植株和野生型植株的基因組DNA進行雜交。結果如圖5所示，在過表達轉基因植株中，均檢測到了明顯的雜交信號，且不同株系的雜交信號強度存在差異，表明目的基因已成功整合到葡萄基因組中，且整合拷貝數(shù)可能不同。在RNA干擾轉基因植株中，部分株系的雜交信號強度明顯減弱，說明這些株系中VaNAC26基因的拷貝數(shù)減少或基因結構發(fā)生了變化。注：WT：野生型植株；OE-1、OE-2、OE-3：過表達轉基因植株；RNAi-1、RNAi-2、RNAi-3：RNA干擾轉基因植株最后，采用實時熒光定量PCR技術對轉基因植株中VaNAC26基因的表達水平進行了檢測。結果如圖6所示，在過表達轉基因植株中，VaNAC26基因的表達量顯著高于野生型植株，其中OE-2株系的表達量最高，約為野生型植株的[X]倍。在RNA干擾轉基因植株中，VaNAC26基因的表達量顯著低于野生型植株，其中RNAi-3株系的表達量最低，僅為野生型植株的[X]%。綜上所述，通過PCR鑒定、Southernblot分析和實時熒光定量PCR檢測，成功獲得了過表達和沉默VaNAC26基因的轉基因葡萄植株，并篩選出了表達效果顯著的株系，為后續(xù)研究VaNAC26基因對葡萄抗旱性的影響奠定了基礎。注：WT：野生型植株；OE-1、OE-2、OE-3：過表達轉基因植株；RNAi-1、RNAi-2、RNAi-3：RNA干擾轉基因植株。不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）4.2過表達VaNAC26增強葡萄抗旱性的表型分析為深入探究VaNAC26基因對葡萄抗旱性的影響，本研究對過表達VaNAC26基因的轉基因葡萄植株和野生型葡萄植株進行了干旱脅迫處理，并對其生長狀況進行了詳細的表型分析。在正常生長條件下，過表達VaNAC26基因的轉基因葡萄植株與野生型植株在形態(tài)上無明顯差異，植株生長健壯，葉片翠綠，新梢生長速度基本一致。然而，在干旱脅迫處理后，兩者的表型差異逐漸顯現(xiàn)。隨著干旱脅迫時間的延長，野生型葡萄植株受到的影響較為明顯。植株生長受到顯著抑制，新梢生長緩慢，節(jié)間縮短，葉片逐漸變黃、卷曲，部分葉片甚至出現(xiàn)干枯脫落的現(xiàn)象。而相比之下，過表達VaNAC26基因的轉基因葡萄植株表現(xiàn)出較強的抗旱能力。在相同的干旱脅迫條件下，轉基因植株的新梢仍能保持一定的生長速度，葉片雖然也出現(xiàn)了卷曲現(xiàn)象，但變黃和干枯的程度明顯較輕，大部分葉片仍能保持綠色，維持正常的生理功能。進一步對干旱脅迫下葡萄植株的生長指標進行統(tǒng)計分析，結果顯示，在干旱脅迫處理[X]天后，野生型植株的新梢長度增長率僅為[X]%，而過表達VaNAC26基因的轉基因植株新梢長度增長率達到了[X]%，顯著高于野生型植株（P<0.05）。在葉片相對含水量方面，野生型植株的葉片相對含水量在干旱脅迫后下降迅速，處理[X]天后降至[X]%，而轉基因植株的葉片相對含水量仍能維持在[X]%左右，表明轉基因植株在干旱脅迫下能夠更好地保持葉片的水分含量，減少水分散失。此外，對植株的死亡率進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，在重度干旱脅迫處理[X]天后，野生型植株的死亡率達到了[X]%，而過表達VaNAC26基因的轉基因植株死亡率僅為[X]%，說明過表達VaNAC26基因能夠顯著提高葡萄植株在干旱脅迫下的存活率。綜上所述，過表達VaNAC26基因能夠增強葡萄植株在干旱脅迫下的生長能力，減輕干旱脅迫對植株造成的傷害，使植株在干旱環(huán)境中保持較好的生長狀態(tài)，從而提高葡萄的抗旱性。這些結果表明，VaNAC26基因在葡萄抗旱過程中發(fā)揮著重要的作用，為進一步研究其調控葡萄抗旱性的分子機制奠定了基礎。4.3沉默VaNAC26降低葡萄抗旱性的表型分析為了深入探究VaNAC26基因在葡萄抗旱過程中的作用，對沉默VaNAC26基因的轉基因葡萄植株進行了干旱脅迫處理，并與野生型植株進行了詳細的表型對比分析。在正常水分條件下，沉默VaNAC26基因的轉基因葡萄植株與野生型植株在外觀形態(tài)上并無明顯差異，植株生長態(tài)勢良好，新梢生長正常，葉片翠綠且舒展，各項生長指標基本一致。然而，當遭遇干旱脅迫時，兩者的差異逐漸顯著。隨著干旱脅迫時間的延長，沉默VaNAC26基因的轉基因葡萄植株表現(xiàn)出明顯的生長劣勢。新梢生長受到強烈抑制，生長速度急劇減緩，節(jié)間長度明顯縮短，與野生型植株相比，新梢長度增長率顯著降低。在干旱脅迫處理[X]天后，野生型植株新梢長度增長率為[X]%，而沉默VaNAC26基因的轉基因植株新梢長度增長率僅為[X]%，差異達到顯著水平（P<0.05）。在葉片形態(tài)方面，沉默VaNAC26基因的轉基因葡萄植株葉片在干旱脅迫下卷曲程度更為嚴重，葉片邊緣向內卷曲，且葉片發(fā)黃現(xiàn)象明顯早于野生型植株。部分葉片甚至在干旱脅迫后期出現(xiàn)了嚴重的干枯和壞死，導致葉片脫落。相比之下，野生型植株雖然也受到干旱脅迫的影響，但葉片的卷曲和發(fā)黃程度相對較輕，仍能在一定程度上維持葉片的正常生理功能。對葉片相對含水量的測定結果顯示，隨著干旱脅迫時間的增加，沉默VaNAC26基因的轉基因葡萄植株葉片相對含水量下降速度明顯快于野生型植株。在干旱脅迫處理[X]天后，野生型植株葉片相對含水量為[X]%，而轉基因植株葉片相對含水量降至[X]%，表明轉基因植株在干旱脅迫下保水能力較弱，水分散失更快。進一步統(tǒng)計植株的死亡率發(fā)現(xiàn)，在重度干旱脅迫處理[X]天后，沉默VaNAC26基因的轉基因葡萄植株死亡率高達[X]%，而野生型植株死亡率為[X]%，兩者差異顯著（P<0.05）。這表明沉默VaNAC26基因使葡萄植株對干旱脅迫更為敏感，抗旱能力顯著降低，在干旱環(huán)境下的生存能力明顯減弱。綜上所述，沉默VaNAC26基因的葡萄植株在干旱脅迫下生長受到嚴重抑制，新梢生長緩慢，葉片卷曲、發(fā)黃、干枯脫落現(xiàn)象嚴重，葉片相對含水量下降迅速，植株死亡率升高，這些表型特征充分說明沉默VaNAC26基因降低了葡萄的抗旱性，進一步證實了VaNAC26基因在葡萄抗旱過程中發(fā)揮著關鍵作用。五、VaNAC26調控葡萄抗旱性的生理機制5.1VaNAC26對葡萄抗氧化系統(tǒng)的調控在正常生長條件下，過表達VaNAC26基因的轉基因葡萄植株與野生型植株的SOD、POD、CAT等抗氧化酶活性以及H?O?、O??等活性氧含量均無顯著差異。然而，在干旱脅迫處理后，兩者之間的差異逐漸顯現(xiàn)。隨著干旱脅迫時間的延長，野生型葡萄植株的SOD、POD、CAT等抗氧化酶活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在脅迫初期，野生型植株通過提高抗氧化酶活性來清除體內積累的活性氧，以維持細胞內的氧化還原平衡。然而，隨著脅迫程度的加劇，抗氧化酶活性逐漸下降，導致活性氧清除能力減弱，H?O?和O??等活性氧在細胞內大量積累。在干旱脅迫處理12天時，野生型植株的SOD活性較脅迫前下降了[X]%，POD活性下降了[X]%，CAT活性下降了[X]%，而H?O?含量增加了[X]倍，O??產(chǎn)生速率提高了[X]倍?；钚匝醯姆e累會導致細胞膜脂過氧化，使MDA含量升高，進一步破壞細胞膜的結構和功能。在干旱脅迫處理12天時，野生型植株的MDA含量較脅迫前增加了[X]倍。相比之下，過表達VaNAC26基因的轉基因葡萄植株在干旱脅迫下表現(xiàn)出更強的抗氧化能力。在干旱脅迫處理后，轉基因植株的SOD、POD、CAT等抗氧化酶活性顯著高于野生型植株，且能夠維持在較高水平。在干旱脅迫處理12天時，轉基因植株的SOD活性較脅迫前提高了[X]%，POD活性提高了[X]%，CAT活性提高了[X]%。同時，轉基因植株的H?O?和O??等活性氧含量顯著低于野生型植株。在干旱脅迫處理12天時，轉基因植株的H?O?含量僅為野生型植株的[X]%，O??產(chǎn)生速率為野生型植株的[X]%。由于活性氧積累較少，轉基因植株的細胞膜脂過氧化程度較輕，MDA含量顯著低于野生型植株。在干旱脅迫處理12天時，轉基因植株的MDA含量僅為野生型植株的[X]%。進一步對沉默VaNAC26基因的轉基因葡萄植株進行分析，結果顯示，在干旱脅迫下，沉默VaNAC26基因的轉基因植株抗氧化酶活性顯著低于野生型植株，活性氧積累量顯著增加。在干旱脅迫處理12天時，沉默VaNAC26基因的轉基因植株SOD活性較野生型植株下降了[X]%，POD活性下降了[X]%，CAT活性下降了[X]%，而H?O?含量增加了[X]倍，O??產(chǎn)生速率提高了[X]倍，MDA含量增加了[X]倍。綜上所述，VaNAC26基因能夠通過調控葡萄植株的抗氧化系統(tǒng)，增強植株在干旱脅迫下的活性氧清除能力，減少活性氧對細胞的損傷，從而提高葡萄的抗旱性。過表達VaNAC26基因可顯著提高葡萄植株在干旱脅迫下的抗氧化酶活性，降低活性氧含量和膜脂過氧化程度；而沉默VaNAC26基因則導致葡萄植株抗氧化能力下降，活性氧積累增加，細胞膜損傷加劇，抗旱性降低。5.2VaNAC26對葡萄滲透調節(jié)物質的影響在植物應對干旱脅迫的過程中，滲透調節(jié)物質起著至關重要的作用。脯氨酸作為一種重要的滲透調節(jié)物質，能夠在干旱脅迫下大量積累，通過調節(jié)細胞的滲透勢，維持細胞的膨壓，從而保護細胞免受干旱脅迫的傷害。此外，脯氨酸還具有穩(wěn)定蛋白質和細胞膜結構、清除活性氧等功能，有助于提高植物的抗逆性?？扇苄蕴且彩且活愔匾臐B透調節(jié)物質，包括葡萄糖、果糖、蔗糖等，它們可以在干旱脅迫下積累，降低細胞的水勢，促進水分吸收，同時還能為植物提供能量，維持細胞的正常生理功能。為探究VaNAC26基因對葡萄滲透調節(jié)物質的影響，本研究對過表達和沉默VaNAC26基因的轉基因葡萄植株在干旱脅迫下的脯氨酸和可溶性糖含量進行了測定。在正常生長條件下，過表達VaNAC26基因的轉基因葡萄植株與野生型植株的脯氨酸和可溶性糖含量無顯著差異。然而，在干旱脅迫處理后，兩者的差異逐漸顯現(xiàn)。隨著干旱脅迫時間的延長，野生型葡萄植株的脯氨酸和可溶性糖含量逐漸增加。在干旱脅迫處理12天時，野生型植株的脯氨酸含量較脅迫前增加了[X]倍，可溶性糖含量增加了[X]%。這表明野生型植株能夠通過積累滲透調節(jié)物質來應對干旱脅迫，維持細胞的滲透平衡。相比之下，過表達VaNAC26基因的轉基因葡萄植株在干旱脅迫下脯氨酸和可溶性糖的積累量顯著高于野生型植株。在干旱脅迫處理12天時，轉基因植株的脯氨酸含量較脅迫前增加了[X]倍，約為野生型植株的[X]倍；可溶性糖含量增加了[X]%，約為野生型植株的[X]倍。這說明過表達VaNAC26基因能夠顯著促進葡萄植株在干旱脅迫下脯氨酸和可溶性糖的積累，增強植株的滲透調節(jié)能力，從而提高葡萄的抗旱性。進一步對沉默VaNAC26基因的轉基因葡萄植株進行分析，結果顯示，在干旱脅迫下，沉默VaNAC26基因的轉基因植株脯氨酸和可溶性糖的積累量顯著低于野生型植株。在干旱脅迫處理12天時，沉默VaNAC26基因的轉基因植株脯氨酸含量較脅迫前增加了[X]倍，僅為野生型植株的[X]%；可溶性糖含量增加了[X]%，為野生型植株的[X]%。這表明沉默VaNAC26基因抑制了葡萄植株在干旱脅迫下脯氨酸和可溶性糖的積累，降低了植株的滲透調節(jié)能力，導致葡萄抗旱性下降。綜上所述，VaNAC26基因能夠通過調控葡萄植株在干旱脅迫下脯氨酸和可溶性糖等滲透調節(jié)物質的積累，影響植株的滲透調節(jié)能力，進而調控葡萄的抗旱性。過表達VaNAC26基因可顯著促進滲透調節(jié)物質的積累，增強葡萄的抗旱性；而沉默VaNAC26基因則抑制滲透調節(jié)物質的積累，降低葡萄的抗旱性。5.3VaNAC26對葡萄光合作用的調控光合作用是植物生長發(fā)育的關鍵生理過程，對植物的物質積累和能量轉換起著至關重要的作用。在干旱脅迫條件下，植物的光合作用會受到顯著影響，進而制約植物的生長和產(chǎn)量。為深入探究VaNAC26基因對葡萄光合作用的調控機制，本研究對過表達和沉默VaNAC26基因的轉基因葡萄植株在干旱脅迫下的光合作用相關指標進行了測定和分析。在正常生長條件下，過表達VaNAC26基因的轉基因葡萄植株與野生型植株的凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、胞間二氧化碳濃度（Ci）和蒸騰速率（Tr）等光合作用參數(shù)無顯著差異。然而，在干旱脅迫處理后，兩者的差異逐漸顯現(xiàn)。隨著干旱脅迫時間的延長，野生型葡萄植株的Pn、Gs和Tr均呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢，而Ci則先下降后上升。在干旱脅迫處理12天時，野生型植株的Pn較脅迫前下降了[X]%，Gs下降了[X]%，Tr下降了[X]%，Ci在脅迫初期（6天）下降了[X]%，隨后在12天時上升了[X]%。這表明干旱脅迫導致野生型植株的氣孔關閉，限制了二氧化碳的供應，從而抑制了光合作用的進行；同時，Ci后期的上升可能是由于光合機構受到損傷，導致光合作用的同化能力下降。相比之下，過表達VaNAC26基因的轉基因葡萄植株在干旱脅迫下能夠維持較高的Pn、Gs和Tr水平，且Ci的變化幅度較小。在干旱脅迫處理12天時，轉基因植株的Pn較脅迫前下降了[X]%，顯著低于野生型植株的下降幅度；Gs下降了[X]%，Tr下降了[X]%，均明顯低于野生型植株。Ci在脅迫初期（6天）下降了[X]%，12天時僅上升了[X]%。這說明過表達VaNAC26基因能夠減輕干旱脅迫對葡萄植株氣孔的影響，維持較高的氣孔導度，保證二氧化碳的供應，從而有效緩解干旱脅迫對光合作用的抑制作用。進一步對沉默VaNAC26基因的轉基因葡萄植株進行分析，結果顯示，在干旱脅迫下，沉默VaNAC26基因的轉基因植株Pn、Gs和Tr的下降幅度顯著大于野生型植株，而Ci的上升幅度也更大。在干旱脅迫處理12天時，沉默VaNAC26基因的轉基因植株Pn較脅迫前下降了[X]%，Gs下降了[X]%，Tr下降了[X]%，均顯著高于野生型植株的下降幅度；Ci在脅迫初期（6天）下降了[X]%，12天時上升了[X]%，上升幅度明顯大于野生型植株。這表明沉默VaNAC26基因使葡萄植株對干旱脅迫更為敏感，光合作用受到的抑制更為嚴重，氣孔關閉更為明顯，二氧化碳供應不足，導致光合速率大幅下降。綜上所述，VaNAC26基因能夠通過調控葡萄植株在干旱脅迫下的氣孔行為和光合機構的穩(wěn)定性，影響光合作用的進行，進而調控葡萄的抗旱性。過表達VaNAC26基因可顯著增強葡萄植株在干旱脅迫下的光合作用能力，維持較高的光合速率，減輕干旱脅迫對光合作用的抑制；而沉默VaNAC26基因則導致葡萄植株光合作用能力下降，對干旱脅迫的耐受性降低。這進一步證實了VaNAC26基因在葡萄抗旱過程中通過調控光合作用發(fā)揮著重要作用。六、VaNAC26調控葡萄抗旱性的分子機制6.1VaNAC26與茉莉酸合成及信號通路的關系為深入探究VaNAC26調控葡萄抗旱性的分子機制，本研究著重分析了VaNAC26與茉莉酸合成及信號通路之間的內在聯(lián)系。通過實時熒光定量PCR技術，對干旱脅迫下過表達和沉默VaNAC26基因的轉基因葡萄植株中茉莉酸合成關鍵基因的表達水平進行了檢測。如圖7所示，在正常生長條件下，過表達VaNAC26基因的轉基因葡萄植株與野生型植株中茉莉酸合成關鍵基因LOX、AOS、AOC等的表達水平無顯著差異。然而，在干旱脅迫處理后，兩者的差異逐漸顯現(xiàn)。隨著干旱脅迫時間的延長，野生型葡萄植株中茉莉酸合成關鍵基因的表達量雖有一定程度的上升，但上升幅度相對較小。在干旱脅迫處理12天時，野生型植株中LOX基因的表達量較脅迫前增加了[X]倍，AOS基因的表達量增加了[X]倍，AOC基因的表達量增加了[X]倍。相比之下，過表達VaNAC26基因的轉基因葡萄植株在干旱脅迫下茉莉酸合成關鍵基因的表達量顯著上調。在干旱脅迫處理12天時，轉基因植株中LOX基因的表達量較脅迫前增加了[X]倍，約為野生型植株的[X]倍；AOS基因的表達量增加了[X]倍，約為野生型植株的[X]倍；AOC基因的表達量增加了[X]倍，約為野生型植株的[X]倍。這表明過表達VaNAC26基因能夠顯著促進葡萄植株在干旱脅迫下茉莉酸合成關鍵基因的表達，從而增強茉莉酸的合成。進一步對沉默VaNAC26基因的轉基因葡萄植株進行分析，結果顯示，在干旱脅迫下，沉默VaNAC26基因的轉基因植株茉莉酸合成關鍵基因的表達量顯著低于野生型植株。在干旱脅迫處理12天時，沉默VaNAC26基因的轉基因植株中LOX基因的表達量較脅迫前增加了[X]倍，僅為野生型植株的[X]%；AOS基因的表達量增加了[X]倍，為野生型植株的[X]%；AOC基因的表達量增加了[X]倍，為野生型植株的[X]%。這表明沉默VaNAC26基因抑制了葡萄植株在干旱脅迫下茉莉酸合成關鍵基因的表達，減少了茉莉酸的合成。為了進一步驗證VaNAC26對茉莉酸信號通路的影響，對茉莉酸信號通路相關基因的表達水平進行了檢測。結果表明，在干旱脅迫下，過表達VaNAC26基因的轉基因葡萄植株中茉莉酸信號通路相關基因MYC2、JAZ1、JAZ2等的表達量顯著高于野生型植株，而沉默VaNAC26基因的轉基因葡萄植株中這些基因的表達量顯著低于野生型植株。這說明VaNAC26通過調控茉莉酸信號通路相關基因的表達，參與了葡萄對干旱脅迫的響應。綜上所述，VaNAC26基因能夠通過調控茉莉酸合成關鍵基因的表達，影響茉莉酸的合成，進而參與葡萄對干旱脅迫的響應。過表達VaNAC26基因可顯著促進茉莉酸合成關鍵基因的表達，增強茉莉酸的合成，激活茉莉酸信號通路；而沉默VaNAC26基因則抑制茉莉酸合成關鍵基因的表達，減少茉莉酸的合成，削弱茉莉酸信號通路。這表明VaNAC26在茉莉酸合成及信號通路中發(fā)揮著重要的調控作用，為揭示VaNAC26調控葡萄抗旱性的分子機制提供了重要線索。注：WT：野生型植株；OE：過表達轉基因植株；RNAi：RNA干擾轉基因植株。不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）6.2VaNAC26直接調控的下游抗旱相關基因通過染色質免疫沉淀測序（ChIP-seq）技術，結合生物信息學分析，篩選出了多個VaNAC26直接結合并調控的下游抗旱相關基因。其中，基因VaRAB18（ResponsivetoABA18）是一個重要的靶基因。VaRAB18屬于晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白（LEA）家族，在植物應對干旱脅迫過程中發(fā)揮著重要作用。研究表明，VaNAC26能夠直接結合到VaRAB18基因啟動子區(qū)域的NAC識別序列（NACRS）上，從而激活VaRAB18基因的表達。在干旱脅迫下，過表達VaNAC26基因的轉基因葡萄植株中VaRAB18基因的表達量顯著高于野生型植株，而沉默VaNAC26基因的轉基因葡萄植株中VaRAB18基因的表達量顯著低于野生型植株。進一步研究發(fā)現(xiàn)，VaRAB18蛋白具有較強的親水性，能夠在細胞內形成水合層，保護細胞內的生物大分子和細胞器免受干旱脅迫的損傷，從而提高葡萄植株的抗旱性。另一個被VaNAC26直接調控的下游基因是VaP5CS（Pyrroline-5-carboxylatesynthetase），該基因編碼吡咯啉-5-羧酸合成酶，是脯氨酸合成途徑中的關鍵酶。脯氨酸作為一種重要的滲透調節(jié)物質，在植物應對干旱脅迫時能夠積累，調節(jié)細胞的滲透勢，維持細胞的膨壓，保護細胞免受干旱傷害。ChIP-qPCR實驗結果表明，VaNAC26能夠特異性地結合到VaP5CS基因啟動子區(qū)域的順式作用元件上，促進VaP5CS基因的轉錄。在干旱脅迫下，過表達VaNAC26基因的轉基因葡萄植株中VaP5CS基因的表達量顯著上調，脯氨酸含量也明顯增加；而沉默VaNAC26基因的轉基因葡萄植株中VaP5CS基因的表達受到抑制，脯氨酸含量顯著降低。這表明VaNAC26通過調控VaP5CS基因的表達，影響脯氨酸的合成，進而參與葡萄對干旱脅迫的響應。此外，VaNAC26還直接調控了葡萄中的水通道蛋白基因VaPIP1;1（Plasmamembraneintrinsicprotein1;1）的表達。水通道蛋白在植物水分運輸和維持水分平衡中起著關鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，VaNAC26能夠與VaPIP1;1基因啟動子區(qū)域的特定序列結合，調控其表達。在干旱脅迫下，過表達VaNAC26基因的轉基因葡萄植株中VaPIP1;1基因的表達量顯著高于野生型植株，水通道蛋白的活性增強，從而提高了葡萄植株對水分的吸收和運輸能力，增強了植株的抗旱性。而沉默VaNAC26基因的轉基因葡萄植株中VaPIP1;1基因的表達量顯著降低，水通道蛋白活性減弱，植株的抗旱性下降。綜上所述，VaNAC26通過直接調控VaRAB18、VaP5CS、VaPIP1;1等下游抗旱相關基因的表達，參與葡萄對干旱脅迫的響應，提高葡萄的抗旱性。這些下游基因在滲透調節(jié)、細胞保護和水分運輸?shù)确矫姘l(fā)揮著重要作用，共同構成了VaNAC26調控葡萄抗旱性的分子網(wǎng)絡。6.3VaNAC26參與的葡萄抗旱調控網(wǎng)絡構建綜合上述研究結果，構建了以VaNAC26為核心的葡萄抗旱調控網(wǎng)絡（圖8）。在干旱脅迫下，葡萄植株感知到干旱信號后，激活一系列信號轉導途徑，其中VaNAC26基因的表達迅速上調。VaNAC26作為轉錄因子，一方面直接與茉莉酸合成關鍵基因（如LOX、AOS、AO