分子診斷技術(shù)

1、分子診斷技術(shù),常見的核酸分子診斷技術(shù),核酸分子雜交 ( Nucleic acid molecular Hybridization) 基因芯片（ Gene Chip ） 聚合酶鏈反應(yīng)( polymerase chain reaction reaction；PCR),核酸分子雜交的原理,雙鏈核酸加熱或經(jīng)鹼處理變性后，可解鏈成兩條互補(bǔ)的單鏈核酸。 在適當(dāng)溫度、鹽濃度下，雙鏈能按鹼基互補(bǔ)配對(duì)原則(A-T,C-G)復(fù)性而重新成為雙鏈核酸。 用已知序列的單鏈核酸，經(jīng)標(biāo)記制成核酸探針，與變性后的待測標(biāo)本核酸進(jìn)行雜交，通過檢測標(biāo)記探針的信號(hào)，可判斷標(biāo)本是否存在與探針互補(bǔ)雜交的同源核酸。,核酸分子雜交探針的制備

2、,制備探針的靶核酸可通過: 分離、切割病毒的特定核酸片段獲得; 用重組技術(shù)，將該片段克隆到細(xì)菌質(zhì)粒，經(jīng)擴(kuò)增和純化大量獲得; 選擇已知病毒的一段基因序列，用人工方法合成寡核苷酸，其長度以20個(gè)左右最為常用，過短易出現(xiàn)非特異性雜交。,核酸分子雜交探針的制備,常見的用于標(biāo)記探針的示蹤物質(zhì) 放射性核素如：32P，35S，3H，125I等，雜交后可通過放射自顯影技術(shù)進(jìn)行檢測 非放射性物質(zhì)如：生物素、地高辛和酶等，雜交后可通過底物顯色、化學(xué)發(fā)光等技術(shù)進(jìn)行檢測,核酸分子雜交示意圖 核酸分子雜交的程序,常用的核酸分子雜交技術(shù),斑點(diǎn)雜交（spot blot hybridization） 凝膠電泳印跡轉(zhuǎn)移雜交（S

3、outhern blot hybridization) 原位雜交（in-situ hybridization）,斑點(diǎn)雜交,Dot Bolt Hybridization for HBV DNA Quantitationin 5 l of Patient Sera,凝膠電泳印跡轉(zhuǎn)移雜交 原位雜交 (Southernblot hybridization) (in-situhybridization ）,核酸分子雜交技術(shù)的應(yīng)用,核酸分子雜交具有很高的靈敏度和高度的特異性，因而該技術(shù)在分子生物學(xué)領(lǐng)域中已廣泛地使用于克隆基因的篩選、酶切圖譜的制作、基因組中特定基因序列的定性 等 在醫(yī)學(xué)上，目前已用于多種遺

4、傳性疾病的基因診斷，惡性腫瘤的基因分析，傳染病病原體的檢測等領(lǐng)域中 。,基因芯片,基因芯片（或DNA Chip,或Microarray）又稱DNA微陣列，是指固定在固相載體上的高密度DNA微點(diǎn)陣。即將大量靶基因或寡核苷酸片段有序地，高密度地（點(diǎn)與點(diǎn)間距一般小于500m）排列在玻璃、硅等載體上，稱之為基因芯片。,上圖顯示大量的DNA探針，按照一定的規(guī)律有序地排列在支撐物上，每個(gè)探針與相對(duì)應(yīng)的特異互補(bǔ)序列結(jié)合后，即可發(fā)出熒光。利用該芯片可同時(shí)獲取大量信息。,DNA Microarray,基因芯片技術(shù)原理,大規(guī)模集成的固相雜交 基本原理是核酸分子雜交，即依據(jù)DNA雙鏈堿基互補(bǔ)配對(duì)、變性和復(fù)性的原理,

5、以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段作探針，檢測樣品中哪些核酸序列與其互補(bǔ)，然后通過定性、定量分析得出待測樣品的基因序列及表達(dá)的信息,基因芯片的作用原理,基因芯片的制作方式,原位合成,直接點(diǎn)樣,原位光蝕刻合成,原位噴印合成,分子印章法,針式點(diǎn)樣,噴墨點(diǎn)樣,光導(dǎo)原位合成法,基因芯片技術(shù)流程,基因芯片的應(yīng)用,基因表達(dá)分析 分析基因表達(dá)時(shí)空特征 基因差異表達(dá)檢測 發(fā)現(xiàn)新基因 大規(guī)模DNA測序 基因型、基因突變和多態(tài)性分析 疾病的診斷與治療 遺傳病相關(guān)基因的定位 腫瘤診斷 感染性疾病的診斷 耐藥菌株和藥敏檢測,聚合酶鏈反應(yīng) (polymerase chain reaction reaction

6、；PCR),PCR是八十年代中期問世的一種體外模擬體內(nèi)DNA復(fù)制過程的技術(shù)，可在短時(shí)間內(nèi)將待測特異性DNA擴(kuò)增百萬倍以上，并具有簡單、快速、特異的特點(diǎn)，成為分子生物學(xué)發(fā)展史的又一個(gè)里程碑。 PCR不僅可檢測各種DNA病毒的核酸，還可經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄，檢測各種RNA病毒的核酸，因而在各型肝炎病毒的檢測中，敏感性遠(yuǎn)超過分子雜交，有著不可替代的作用。,PCR 的常見類型,常規(guī)PCR 逆轉(zhuǎn)錄PCR（RTPCR） 巢式PCRnested-PCR 原位PCR（in-situ PCR） 多重PCR ,非對(duì)稱PCR 免疫PCR 定量PCR 隨機(jī)引物PCR 簡并引物PCR 錨定PCR,實(shí)時(shí)熒光定量PCR熒光檢測技術(shù),SYBR Green I。是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料。 TaqMan 水解探針。由產(chǎn)熒光基團(tuán)，熒光淬滅基團(tuán)，與擴(kuò)增子有互補(bǔ)的特異核苷酸序列組成。,實(shí)時(shí)熒光定量PCR：水解探針法,退火 延伸 切割 聚合完成,該法也稱TaqMan技術(shù)，在PCR系統(tǒng)中，加入能和靶核酸模板雜交的探針，其5端帶有熒光報(bào)告基團(tuán)，發(fā)射的熒光被3端帶有的熒光淬滅基團(tuán)所吸收。 引物延伸時(shí)，由于聚合酶具有的53核酸外切酶作用，可把熒光報(bào)告基團(tuán)從探針上切下，因與淬滅基團(tuán)遠(yuǎn)離，