檢驗科微生物室ppt模版 2012

1、臨床微生物質量控制,湖南省腫瘤醫(yī)院檢驗科,內 容,二、臨床微生物的質量控制,三、標本采集、運送和顯微鏡檢,四、細菌鑒定的基本步驟,五、細菌藥物敏感試驗,六、實驗室質量保證和報告規(guī)范化,七、工作中常見的問題和解決方法,八、目標,一、臨床微生物實驗室的重要性,一、臨床微生物實驗室的重要性,微生物實驗室在臨床中的地位： 及時、準確地作出病原學診斷和抗菌素敏感試驗，為臨床制訂抗感染治療方案提供依據(jù) 監(jiān)測和分析細菌耐藥性的變遷和某些重點的耐藥細菌 提供目標用藥依據(jù)或糾正經(jīng)驗用藥的依據(jù) 參與醫(yī)院感控監(jiān)測并定期發(fā)布醫(yī)院細菌耐藥率和耐藥趨勢,一、臨床微生物實驗室的重要性,人類面臨著微生物的挑戰(zhàn)，要打贏這場戰(zhàn)爭

2、不僅需要有經(jīng)驗的醫(yī)生，還需要一支優(yōu)秀的臨床微生物檢驗隊伍。 與過去的10年或20年相比，臨床微生物實驗室的規(guī)模和發(fā)展速度已經(jīng)發(fā)生了巨大的變化。目前，我們離CLSI(臨床實驗室標準化研究所)標準化文件要求還相差很遠，我們應進行規(guī)范操作，才可能應對微生物向人類的挑戰(zhàn)，才能適應臨床的需要。 臨床微生物檢驗，在感染性疾病及相關病患的診斷治療預防及研究工作中起著越來越重要的作用，為了保障檢驗結果的準確性和可靠性，日常工作中要注意開展質量控制。,為了保證檢驗結果準確無誤，應對室間質評和室內質控實行全面質量管理。,臨床微生物檢驗,是對人體的各種物質進行微生物學檢驗，整個檢驗過程包括病人樣品的采集、運送、處理

3、，樣品中致病微生物的分離、培養(yǎng)、鑒定，藥物敏感試驗，出具檢驗報告。,其質量控制環(huán)節(jié)多、涉及的知識面廣、復雜性高、需要超強的責任心。,二、臨床微生物的質量控制,臨床微生物檢驗質量控制的有關概念,為了保證質量控制，首先應了解以下有關概念： 細菌檢驗的質量：結果真實顯示標本中存在的病原菌及其生化特征和抗藥性 細菌檢驗的質量控制：制定細菌檢驗的質量水平，并采取監(jiān)測手段，這一過程稱為細菌檢驗的質量控制。 質量保證：為達到應有的質量水平而采取的措施。 質量評價：用一個客觀的公認的標準來評定一個實驗室或實驗室中某項試驗是否達到標準的過程。,二、臨床微生物的質量控制,室間質量控制：是各地實驗室之間進行質量控制

4、的一種方式，也是上一級實驗室對各實驗室進行質量管理的手段。參加由省臨床檢驗中心或衛(wèi)生部臨床檢驗中心組織的室間質控，會遇見一些平時罕見或未見過的菌株，通過質控檢驗對它們的生長條件、菌落形態(tài)、染色、鏡下形態(tài)等有了較深的感性認識。日后工作中倘若再遇見這些菌將不再會漏檢。,二、臨床微生物的質量控制,室內質量控制：做好室內質控直接關系到日常檢驗工作的質量。室內質控主要包括幾個方面：實驗室前的質量控制、標本接種前的質量控制、培養(yǎng)基的質量控制、試劑質量控制、常用儀器的質量控制、藥敏實驗的質量控制、及發(fā)報告前的質量控制。,二、臨床微生物的質量控制,臨床微生物實驗室質量管理目標 臨床微生物實驗室室是為臨床診斷與

5、治療提供有否感染病原菌以及藥物敏感實驗依據(jù)的檢查科室之一。 臨床微生物實驗室室的工作是面向全院臨床醫(yī)生與患者。其工作目的是一切為了患者，服務于患者；一切為了臨床，服務于臨床；急其所急，想其所想，檢驗報告及時、準確。 根據(jù)循證醫(yī)學的觀點，不斷進行實驗方法學的研究與改進，臨床價值探討，經(jīng)濟學評估，優(yōu)選出最直接、最有效、最準確、最經(jīng)濟的實驗或實驗組合，用于臨床。,二、臨床微生物的質量控制,不斷加強實驗室與臨床的信息交流與學術探討，直接參與臨床診斷治療，促進檢驗醫(yī)學的發(fā)展。 本室所進行的試驗方法、量值可溯源，不準確度限制在國內有關部分標準。力爭達到國家規(guī)定的質量控制標準. 儀器設備完好率85%。 參加

6、國際、國內室間質評，其總成績“優(yōu)秀”應為90，“良好”小于10。 對患者熱情，服務周到，使全科平均滿意率為95以上。 檢查差錯發(fā)生率應小于0.4。,二、臨床微生物的質量控制,臨床微生物實驗室的基本裝備,光學顯微鏡,孵育箱、燭缸、高壓鍋,生物安全柜或安全罩,試劑、染液、質控菌株、培養(yǎng)基,冰箱、酒精燈、接種環(huán)、尺、溫度計等,二、臨床微生物的質量控制,臨床微生物室的制度 生物安全防護制度 三級報告制度：涂片；初步藥敏和確切涂片；正式鑒定和藥敏 傳染病原報告制度 菌毒株保存制度 廢棄物處理制度 質量控制制度,二、臨床微生物的質量控制,室間質評,是在建立實施室內質控體系的基礎上，我們收到質控物后認真檢查

7、核對，如有破損、缺失、標本編號錯誤等要及時向科室反映，以便及時與部臨檢或省臨檢中心聯(lián)系，及時補寄。,由衛(wèi)生部臨床檢驗中心或省臨床檢驗中心組織，如實地反映實驗室的真實工作狀況和水平，是臨床實驗室全面質量管理重要組成部分，也是實驗室認可的重要依據(jù)。,二、臨床微生物的質量控制,需仔細閱讀室間質評的通知和要求，由室負責人將質評樣本保存在28冰箱，妥善保管好報表和項目編碼。,室間質評樣本的檢測操作程序 1. 測試環(huán)境、儀器、試劑的要求 室溫：2025 濕度：80% 試劑：所用試劑或試條均為儀器配套產(chǎn)品 質控品：為儀器配套產(chǎn)品，并在使用效期內，同時無變質或污染。 儀器：儀器必須有質量控制保證。 2. 質評

8、樣品的準備 按測定日期從冰箱中取出參評物，放置至室溫(約30min)。 根據(jù)標本種類，質控菌株分到各組進行培養(yǎng)分離鑒定。 3. 質評樣品的測定 質控菌株用小牛血清或肉湯溶解，按標本種類接種各種選擇培養(yǎng)基，放適當環(huán)境培養(yǎng)。 培養(yǎng)分離病原菌，根據(jù)病原菌種類進行鑒定和耐藥表型檢測，并根據(jù)質控要求，病原菌進行藥敏試驗(重復2次)。 4. 填寫報表或網(wǎng)上回報 填寫報表時應按要求逐項填寫，字跡清晰整潔。 填寫完后再次核對，以防筆誤、樣本號順序錯誤等。 然后則測定者、室負責人簽字。 5. 結果存檔 填寫完后復印或將網(wǎng)頁另存，一份寄出，一份存檔，以備核查。,二、臨床微生物的質量控制,室間質評的評價方法 1.

9、單項PT值評分標準 每一批號每一項目結果在允許范圍內時，測定結果合格，得分為100%，若在允許范圍外時，測定結果不合格，得分為0%。單個項目的得分計算公式為： (該項目的合格結果數(shù)該項目的總的測定樣本數(shù))100%。 合格：該項目的測定成績80% 不合格：該項目的測定成績80% 2. 總項目的PT值評分標準 總項目的計算公式為： (總項目的合格結果數(shù)總項目的總的測定樣本數(shù))100% 合格：總項目的測定總分80% 不合格：總項目的測定總分80% 3. 部臨檢中心給參加實驗室發(fā)證書的規(guī)定 合格證書：每年每個專業(yè)參加2次或3次以上，不得缺席，每次有五個調查樣本。每次總項目的測定總分80%；頒發(fā)合格證書

10、。 參加證書：不符合合格證書的要求和標準的均頒發(fā)參加證書。 注意：若失控，應將調查所有失控原因及相關糾正措施，并做好記錄，上報科質量控制小組和科主任，由科主任簽字后，質控結果歸檔保存。,二、臨床微生物的質量控制,臨床微生物室需建立室內質控,1,1,2,3,4,常規(guī)試驗室內質控,培養(yǎng)基質控,藥敏試驗的質控,自動化設備質控：鑒定和藥敏、血培養(yǎng)系統(tǒng),二、臨床微生物的質量控制,ATCC：美國典型菌株保存中心-主要來源 NCTC：英國國家典型菌株保存中,實驗中用標準方法鑒定，鑒定值95典型菌株，并經(jīng)多次傳代，特征衡定的菌株,質控菌株,參考菌株,臨床分離菌,二、臨床微生物的質量控制,質控必備菌株 細菌名稱

11、 菌號 用途 金黃色葡萄球菌 ATCC 25923 紙片擴散質控 金黃色葡萄球菌 ATCC 29213 MIC測定質控 大腸桿菌 ATCC 25922 紙片和MIC 綠膿假單胞菌 ATCC 27853 紙片和MIC 糞腸球菌 ATCC 29212 胸腺嘧啶含量測定 淋病奈瑟菌 ATCC 49226 淋球菌藥敏 流感嗜血桿菌 ATCC 49247 嗜血桿菌藥敏 肺炎克雷伯菌 ATCC 700603 ESBL陽性菌,二、臨床微生物的質量控制,低溫速凍 苛養(yǎng)細菌,冷凍干燥 長期保留菌株,參考菌株保存方法,高層瓊脂 非苛養(yǎng)菌,二、臨床微生物的質量控制,瓊脂斜面 現(xiàn)用菌株,常規(guī)試驗的質量控制-天天做 觸

12、酶試驗：3H2O2每三天更換一次 血漿凝固酶試驗：人血漿或商品乳膠試劑 氧化酶試驗：1鹽酸四甲基對苯胺水溶液浸泡厚濾紙，室溫吹干壓成小紙片，置含干燥劑容器20保存，或買商品制劑 內酰胺酶：頭孢硝噻吩(Nitrocefin)為底物，適于測試嗜血桿菌、淋球菌、卡他莫拉菌、腸球菌 革蘭染色：革蘭陽性菌染成紅色；革蘭陰性菌染成紫色；另涂片厚度、染色和脫色時間、染料沉渣等也影響染色質量,二、臨床微生物的質量控制,培養(yǎng)基的質量控制 一般性狀：外觀：透明、清亮、無混濁、無沉淀，顏色符合要求，表面濕潤但無水汽、平整、光潔無凹坑和氣泡。整塊平板厚薄均勻。厚度：一般厚度在3mm，但MH平板厚度4mm。斜面的長度試

13、管長度的2/3。pH是細菌生長的重要條件之一，合格培養(yǎng)基的pH應在規(guī)定值上下0.2的范圍內。 無菌試驗：新制備或新買的培養(yǎng)基在使用前要隨機抽取一定數(shù)量的樣品作無菌試驗。 購買的培養(yǎng)基要有質量保證如合格證明等文件；若無質量保證需檢測相應的性能。,三、標本采集、運輸和顯微鏡檢,培養(yǎng)基的質量控制 細菌生長試驗：所有的培養(yǎng)基在使用前還必須做細菌生長試驗以測定培養(yǎng)基性能是否符合要求。標準菌株分2種：一種是已知的可在某種培養(yǎng)基上生長并產(chǎn)生典型生物學性狀的，對培養(yǎng)基中的某種物質產(chǎn)生陽性反應的菌株；另一種是用已知的不能在某種培養(yǎng)基上生長或對培養(yǎng)基中的某種物質產(chǎn)生陰性生化反應的菌株。如血瓊脂平板：乙型溶血性鏈球

14、菌生長， 溶血；甲型鏈球菌，a溶血；巧克力瓊脂平板：流感嗜血桿菌生長良好；中國藍瓊脂平板和SS瓊脂平板：革蘭陰性菌生長，革蘭陽性菌不生長。,二、臨床微生物的質量控制,試劑質控 臨床微生物實驗室常用的試劑包括染色液、診斷血清以及各種生化反應試劑等。 染色液及染色方法質量控制：購買的或配置的染色液，每次需做好相關的記錄，如操作者和開瓶日期等；還要進行染色步驟質控，如革蘭染色在一張玻片上同時涂有金葡菌和大腸桿菌，以保證染色性判斷準確無誤。 常用生化試劑的質控：隨著細菌鑒定儀和快速微量生化鑒定板條的普及，臨床微生物檢驗常用的生化試劑種類日趨減少，應注意在用試劑在貯存時的避光、冷藏等要求，保證試劑的穩(wěn)定

15、性。不要使用過期的試劑。 診斷血清的質控：診斷血清是一種重要的細菌鑒定試劑，應從有資質的生產(chǎn)單位購買。驗收時必須看清生產(chǎn)批號、血清效價、透明度與色澤。試驗中應注意無菌操作，避免細菌污染。要經(jīng)常檢查貯存在4冰箱中的各種血清，若發(fā)現(xiàn)混濁，出現(xiàn)絮狀，應停止使用。為保證血清凝集反應結果準確，應每3個月對血清進行一次質控。不要使用過期的血清。,二、臨床微生物的質量控制,紙片藥敏試驗的室內質控 基礎質控：連續(xù)做30天，如失控超過3次還需繼續(xù)，如失控低于3次可改為每周1次 糾控：每周質控中發(fā)生失控應糾控，方法：連續(xù)5天，每天1次，每次重復5個紙片，如找到明確失控原因，可立即改為每周1次，否者繼續(xù) 4冰箱保存

16、一周的用量 藥物敏感試驗是臨床微生物檢驗的重要步驟之一，其結果正確與否涉及治療效果的好壞。,二、臨床微生物的質量控制,儀器的質量控制 按儀器說明規(guī)定用標準菌株定期對不同批號的試劑進行質控 國產(chǎn)試劑應采用自動或半自動標準化的系統(tǒng)，如ATB、VITEK 等進行標定 包括對冰箱、二氧化碳孵箱、普通孵箱、水浴箱等基本設備的每日溫度、氣體濃度的監(jiān)控記錄；顯微鏡、細菌鑒定儀等儀器的使用、保養(yǎng)、維修記錄。以保障實驗室各種設備、儀器的正常運轉。,二、臨床微生物的質量控制,1,2,分析前： 標本采集、運送,分析中： 細菌鑒定和藥敏試驗,分析后：報告的處理,3,室內質控,二、臨床微生物的質量控制,實驗室前的質量控

17、制 要想獲得可靠的檢驗結果，首先要取得一份合格的標本，所以實驗室前的質量控制是保障檢驗結果準確性的關鍵。包括標本采集時間（時 機）、采集方法與運送等。 各種臨床標本送到實驗室后，大致檢查其是否合格。不合格的標本不應進行檢驗。,三、標本采集、運輸和顯微鏡檢,血液細菌培養(yǎng) 臨床上疑為敗血癥、膿毒血癥或其他血流感染的患者，需做血液細菌培養(yǎng)以明確病原。及時、準確地從患者血液中分離出病原菌，才能正確實施有效地抗菌治療，從而有助于提高治愈率和降低醫(yī)療費用。 1.采血時機應在用抗菌素治療前, 最好在患者發(fā)冷發(fā)熱前半小時采血為宜。 2.采血次數(shù)與間隔 急性感染患者：從兩臂分別采2份血樣。 感染性心內膜炎患者：

18、24h內采血3次, 每次間隔不少于30分鐘。 發(fā)熱原因不明患者：2448h后可再采血2次,間隔不少于60分鐘。,三、標本采集、運輸和顯微鏡檢,血液細菌培養(yǎng) 3. 血培養(yǎng)采血方法、量、消毒與送檢 采血方法：不要與血氣和血沉標本一起采血；不推薦血入瓶前換針頭；不推薦靜脈血直接入瓶；不宜在靜脈導管或靜脈留置口采血。 采血量-最重要 血液和瓶中液體的比例應為1:10，成人810ml、小兒25ml；血量不足-先需氧瓶，剩余血接種厭氧瓶。 為防止污染正確的皮膚消毒特別重要！按照規(guī)范執(zhí)行。 亞急性感染性心內膜炎、人工瓣膜：主要病原菌是皮膚正常菌群，應自靜脈，而不是留置導管內采血。 標本立即送檢，否則室溫放置

19、。,三、標本采集、運輸和顯微鏡檢,呼吸道標本細菌培養(yǎng) 標本留取質量的好壞直接影響到對下呼吸道病原學的診斷 標本的采集要盡量減少上呼吸道正常菌群干擾 應在用藥前或停藥1天后留取標本。,三、標本采集、運輸和顯微鏡檢,痰 采集方法 自然咳痰：必須用請水漱口3次，應包括咽喉部，立即用力咳出痰，于滅菌容器中或輸送培養(yǎng)基中；支氣管鏡或支氣管毛刷:由醫(yī)生采集，建議直接種入輸送培養(yǎng)基 外 觀 分為膿痰（P）、粘液（M）、血（B）、唾液（S）、水樣（W）五個級別，以P、M、B級別適合細菌培養(yǎng)。 運 送 置無菌密封容器運送，2小時內送達實驗室，如無法馬上送出，標本置4 保存；若檢測結核分支桿菌則必須連續(xù)分別收集3

20、天標本 處 理 痰首先用滅菌生理鹽水將痰液洗3次，然后將痰塊打碎，或加入等量10g/L的胰蛋白酶將痰塊消化后再接種。,三、標本采集、運輸和顯微鏡檢,痰標本顯微鏡檢查的分類,13類為不合格標本, 不做培養(yǎng)。 45類為合格標本。 油鏡下觀察并記錄可能的病原菌，尤其是白細胞內吞噬的細菌,三、標本采集、運輸和顯微鏡檢,泌尿道標本細菌培養(yǎng) 應在用藥前或停藥5天后留取標本, 并使尿液在膀胱內停留68h以上。 盡量避免或減少尿道口正常菌群干擾。 清潔中段尿、導尿導管尿、經(jīng)恥骨上皮膚穿刺采集膀胱內尿液，送檢標本以晨起第一次尿液為佳 尿量不宜太多，試管塞子與尿液不應直接接觸 留取導尿管尿要排空導尿管內陳舊尿液，

21、倘留置尿管超過三天應避免采用。 標本采集后立即送檢，不能立即送檢者，可暫存4冰箱，但保存不超過8h,三、標本采集、運輸和顯微鏡檢,清潔中段尿液 盡量取早晨第一次尿液 棄去開始流出的尿液，以沖刷尿道口的細菌，取能代表膀胱部位病原菌的中段尿 詳細告知病人以下操作步驟 女性病人 收集標本前用清洗液沖洗干凈，從前向后仔細擦洗尿道區(qū)域 分開陰唇，開始排尿 排出幾毫升后，不停止尿流，采集中段尿 男性病人 回縮包皮并清洗龜頭 排出幾毫升后，不停止尿流，采集中段尿,三、標本采集、運輸和顯微鏡檢,導尿管尿液 集尿袋內的尿液不能用作培養(yǎng)； 導尿管末端的尿液也不能用于培養(yǎng)，因為很難避免沒有尿道菌群污染。 留置導管尿

22、液標本常通過專門的采樣端口采集，不能把導尿管與尿袋拔開后收集尿液。 采樣端口用酒精消毒；必要時，可先夾住導尿管但不能超過30分鐘；將注射器針頭插入采樣端口，抽吸出尿液；注入無菌杯或試管中,三、標本采集、運輸和顯微鏡檢,恥骨上穿刺吸取尿液 常用于患兒、泌尿道厭氧菌感染或脊柱損傷病人等。 可避免尿道或會陰細菌的污染，但對膀胱內少量尿液的小兒難以實施。 方法：消毒自臍以下至尿道之間區(qū)域的皮膚，局麻穿刺點部位；在恥骨聯(lián)合與臍連線上，高于恥骨聯(lián)合2cm處進針刺入膀胱；取20ml尿液；置于無菌容器中并送往實驗室。 可用于厭氧菌檢測,三、標本采集、運輸和顯微鏡檢,糞便標本的培養(yǎng) 應在發(fā)病早期并且盡量在用抗生

23、素治療前采集，稀便不少于1ml，固體便不少于1克，無便患者可用直腸拭子采集標本。 要挑取含膿、黏液、血等病理改變或水樣糞便送檢。直腸拭子采樣量要足夠，拭子上肉眼應可見糞便。 注意事項： 雖然糞便標本本身含很多細菌但也要用無菌容器。 厭氧細菌（難辯梭菌）培養(yǎng)的標本應盡量減少與空氣接觸。 注意挑取膿血便或粘液便做培養(yǎng) 要進行分區(qū)劃線。如圖所示。,三、標本采集、運輸和顯微鏡檢,分泌物的培養(yǎng) 1. 對開放性病灶的采集：如眼結膜膿性分泌物、扁桃體、外耳道、手術后切口、導管治療感染、瘺管內膿液、生殖道分泌物等均屬于開放性病灶。應先用滅菌生理鹽水沖洗表面污染菌，去除舊的分泌物，用滅菌拭子采集病灶深部的分泌物

24、，也可取感染部位下的組織送檢。 2. 閉鎖性膿腫：如淋巴膿腫、肺膿腫、肝膿腫、腹腔膿腫、盆腔膿腫等，對封閉的膿腫常采用穿刺或引流的的方法采樣，應在用藥前采集，應注意膿液的氣味、性狀、顏色注意厭氧菌存在的可能。不能及時送檢應應用輸送培養(yǎng)基。,三、標本采集、運輸和顯微鏡檢,膿液標本 要盡量避免病灶表面細菌污染。開放性膿腫，采樣前無菌鹽水沖洗傷口，拭去表面污染膿液，挑取病灶深部膿液；封閉性膿液，嚴格病灶皮膚或黏膜表面的消毒后用無菌干燥注射器穿刺抽取，置無菌試管內送檢，或切開排膿時用無菌拭子采集深部膿液。,三、標本采集、運輸和顯微鏡檢,厭氧菌和傷口標本 厭氧菌標本 隔絕空氣-氧對厭氧菌有毒性作用 液狀

25、標本應用注射器抽取密封送檢 分泌物標本最好床邊采集床邊接種；另置厭氧環(huán)境送檢（輸送培養(yǎng)基） 傷口標本 在傷口切開排膿時留取標本 不能在傷口消毒清洗后留取標本 盡量采集傷口深部的膿汁送檢,三、標本采集、運輸和顯微鏡檢,腦脊液標本 直接觀察：革蘭染色、抗酸染色、印度墨汁染色 無菌采集技術：避免標本污染及患者被感染 病毒培養(yǎng)標本：置4 保存 分枝桿菌培養(yǎng)標本：2mL以上，置4 保存 細菌培養(yǎng)標本置35 保存,三、標本采集、運輸和顯微鏡檢,細菌鑒定的基本步驟 標本的分離培養(yǎng)（這關系到整個結果的可靠性） 培養(yǎng)結果的觀察（致病菌的選擇） 細菌的分純、鑒定（天地人鑒定系統(tǒng)、ATB半自動微生物鑒定、VITEK

26、系統(tǒng)、MicroScan自動微生物分析系統(tǒng)、Sensititre 全自動微生物鑒定系統(tǒng)，我們腫瘤醫(yī)院用的是前兩種鑒定系統(tǒng)）,四、細菌鑒定的基本步驟,常用的培養(yǎng)基種類和用途 哥倫比亞血平板營養(yǎng)要求高的細菌 巧克力平板含V、X因子，主要培養(yǎng)嗜血桿菌、腦膜炎球菌和淋球菌用 中國藍/麥康凱平板G-桿菌用 SS平板沙門氏菌和志賀氏菌用 M-H平板細菌藥敏用 TCBS平板弧菌科細菌用 真菌顯色平板真菌培養(yǎng)用 羅氏培養(yǎng)基分枝桿菌用,四、細菌鑒定的基本步驟,常見標本細菌培養(yǎng)基選擇 痰-血平板、巧克力平板、（中國藍/麥康凱）放CO2環(huán)境，能分離肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌 尿-血平板、（中國藍/麥康凱）

27、定量培養(yǎng) 糞便-中國藍/麥康凱平板、SS平板等能分離沙門菌、志賀菌等，報告“未檢出XXX菌” 腦脊液-血平板、巧克力平板CO2環(huán)境，能分離常見苛養(yǎng)菌（腦膜炎奈瑟菌、流感嗜血桿菌、單核細胞李斯特菌等），常規(guī)進行革蘭染色、墨汁染色 胸腹水：血平板、巧克力、肉湯 胃液、膽汁：血平板、中國蘭、肉湯 真菌培養(yǎng)：沙保弱培養(yǎng)基 厭氧培養(yǎng)：厭氧血平板、中國蘭、肉湯、涂片 陰拭子、膿、分泌物：血平板、中國蘭、肉湯 咽、眼、耳拭子：血平板、巧克力平板、中國蘭、肉湯； TB培養(yǎng)：羅氏雞蛋培養(yǎng) 注：血平板和巧克力平板放置CO2培養(yǎng)箱或燭缸培養(yǎng)，其它放置普通培養(yǎng)環(huán)境,四、細菌鑒定的基本步驟,A：血平板 B：中國蘭平板

28、C：巧克力平板 D：SS平板 E：霍亂平板 F：TCBS平板：G：腸道菌顯色平板 H：真菌平板 I：增菌肉湯 L：堿性蛋白胨水 M：羅氏培養(yǎng)基（管）,四、細菌鑒定的基本步驟,培養(yǎng)結果的觀察（致病菌的選擇） 觀察培養(yǎng)基上是否有細菌生長 觀察生長情況（是單一種細菌還是多種細菌） 觀察生長的細菌是否具有某些典型特征 排除污染細菌 對于無菌部位所采集的標本（CSF、胸水、腹水、關節(jié)液、血液、骨髓、各器官穿刺液等等），只要培養(yǎng)出細菌（排除污染）一律都視為致病菌。 對于有菌部位或易被正常菌群污染的標本，培養(yǎng)出細菌后，要根據(jù)標本的不同，排除正常菌群后，再挑選致病菌（請看下圖）。,四、細菌鑒定的基本步驟,無菌

29、部位標本,四、細菌鑒定的基本步驟,涂片染色 涂片染色：應具備最基本的兩種染色技術，即革蘭氏染色和抗酸染色。 1 革蘭染色：革蘭染色報告必須包括染色反應或微生物種類和類別，描述物種的形態(tài)或結構。如革蘭染色見到革蘭陽性球菌，呈葡萄狀排列；又如革蘭染色見到真菌小分生孢子及菌絲。 2.抗酸染色：抗酸染色報告應顯示找到或未找到或可疑抗酸桿菌三種結果，報告中應以加號體現(xiàn)標本中抗酸桿菌的存在量。如找到抗酸桿菌+；見到染色不典型抗酸桿菌+，建議再送標本；不能報告找到結核桿菌但可報告未找到結核桿菌。,四、細菌鑒定的基本步驟,四、細菌鑒定的基本步驟,細菌鑒定,四、細菌鑒定的基本步驟,血清學試驗 腸道致病菌生化特征

30、符合的前提下必須有血清學的試驗作最后確認，基層細菌室應具備1-3項血清試劑。 1.志賀氏菌多價和單價凝集血清： 2.沙門氏菌多價和單價凝集血清 3.致病性大腸桿菌多價和單價凝結血清 4. 耶爾森氏菌凝集血清,四、細菌鑒定的基本步驟,真菌鑒定 1每一基層實驗室必須開展真菌涂片，報告臨床是否找到真菌；是否見到真菌菌絲；從形態(tài)辨別常見絲狀真菌;區(qū)別曲菌或毛霉菌。 2開展酵母樣真菌分離培養(yǎng)，應具備最基本的沙保弱培養(yǎng)基或用顯色培養(yǎng)基，鑒別白念和非白念，隱球菌等。 3.有條件的實驗室應開展非培養(yǎng)的鑒定方法，如-D葡聚糖的檢測。,四、細菌鑒定的基本步驟,四、細菌鑒定的基本步驟,四、細菌鑒定的基本步驟,四、細

31、菌鑒定的基本步驟,四、細菌鑒定的基本步驟,四、細菌鑒定的基本步驟,四、細菌鑒定的基本步驟,五、細菌藥敏試驗,抗菌藥物敏感性試驗-常用方法 擴散試驗diffusion test：紙片擴散法(抑菌圈直徑) 稀釋試驗dilution test：肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法、最小抑菌濃度minimum inhibitory concentration，MIC E試驗E-test 自動化儀器檢測,五、細菌藥敏試驗,紙片擴散法操作步驟 制備接種物（0.5麥氏單位） 接種HTM或5%羊血M-H瓊脂平板上（15分鐘內接種，涂抹均勻） 在接種好的瓊脂平板上貼加紙片 孵育（15分鐘內反轉平板，35C空氣孵育） 苛養(yǎng)菌5

32、CO2孵育 判度結果和解釋結果,五、細菌藥敏試驗,紙片擴散法判讀結果 將游標卡尺置于反轉的平板的背面，測量到最接近的整數(shù)毫米數(shù)。平板應距離一個黑色不反光的背景數(shù)英寸，并用反射光照明。 如果是加血的瓊脂培養(yǎng)基，則應在透射光照射下，打開培養(yǎng)皿蓋，從上表面測量抑菌圈。 如果被測菌是葡萄球菌或腸球菌，則應孵育24小時，再在透射光下分別觀察苯唑西林或萬古霉素的透明抑菌圈內有無耐甲氧西林或耐萬古霉素菌落的微弱生長，遇不敏感的結果需用稀釋法測定MIC法確 變形桿菌(遷移生長)以及磺胺類藥物的紙片法藥敏忽略薄紗樣蔓延生長，微弱生長（20%或更少），克林霉素對葡萄球菌的抑菌圈內如有薄霧狀菌苔應報告細菌對克林霉素

33、耐藥,不管其是否顯示“D”抑菌圈,五、細菌藥敏試驗,五、細菌藥敏試驗,五、細菌藥敏試驗,五、細菌藥敏試驗,五、細菌藥敏試驗,藥敏結果結果的審核 S-敏感（Susceptible）：用常規(guī)用量治療有效，常規(guī)用藥時達到的平均血藥濃度超過細菌的MIC 5倍以上。 R-耐藥（Resistance）：用常規(guī)用量治療不能抑制細菌的生長，MIC高于藥物在血、體液中可能達到的濃度。 I-中介 (Intermediate)：MIC接近血、體液中藥物的濃度，治療反應率低于敏感株，藥物生理濃集部位有效(泌尿道)，加大用藥劑量可能有效。,五、細菌藥敏試驗,ESBL初步篩選實驗,五、細菌藥敏試驗,ESBL確認試驗,五、

34、細菌藥敏試驗,ESBL的質控頻率 篩選試驗和表型確證試驗均可每日進行或每周進行，所選擇菌株為肺克700603或大腸埃希菌25922。 應該注意的是：肺克700603ESBL基因在質粒上，應將其凍存于-60或以下。 奇異變形桿菌 ESBL 監(jiān)測試驗,五、細菌藥敏試驗,可誘導的克林霉素耐藥 (erm-介導) 常規(guī)D試驗: 陽性 15 g 紅霉素紙片及 2 g克林霉素之間距離為15-26.,“D Test” 陽性反應,五、細菌藥敏試驗,mecA介導的葡萄球菌耐藥的表型試驗,紙片擴散法 用頭孢西丁 (CX DD 30 g) 紙片 金葡菌 其結果等于苯唑西林紙片(OX DD)結果。 CoNS 結果優(yōu)于苯

35、唑西林紙片的結果。 結果清晰，讀起來比苯唑西林容易。 報告時仍寫苯唑西林，而不寫頭孢西丁。 MIC試驗 仍用苯唑西林藥。,43,五、細菌藥敏試驗,常見細菌的耐藥問題 肺炎鏈球菌PRSP 腸球菌HLARE、VRE 葡萄球菌MRS、MRSA 腸桿菌屬AmpC 超級細菌NDM-1 以上的耐藥問題都為目前全球最關注的細菌耐藥問題，也是我們在工作中要特別注意的問題,五、細菌藥敏試驗,質量控制的規(guī)范化 為了保證微生物實驗室的質量，我們應做到質量控制的規(guī)范化 1藥物敏感試驗的質量控制：應包括30天的初始質量穩(wěn)定測試；每周一次的常規(guī)質量控制；5天的糾控程序。 2鑒定試劑質量控制：購入新的試劑；在更換批號；更換

36、生產(chǎn)廠家；結果發(fā)生異常等情況時均應進行質量控制。 3染色液質量控制：每天臨床標本染色前應包括染色結果陽性和陰性的對照物及染色液污染的質量檢查。 4分離培養(yǎng)基：如血瓊脂和巧克力，用肺炎鏈球菌、B-溶血和草綠色溶血的鏈球菌、流感嗜血桿菌、等苛養(yǎng)細菌的標準菌株或經(jīng)標準化試劑已證實結果正確的菌株進行測試，判斷其分離能力。,六、實驗室質量保證和報告規(guī)范化,質量控制的規(guī)范化 5.培養(yǎng)箱溫度的質量控制：每天第一個開箱和最后離開實驗室均應對培養(yǎng)箱的溫度作記錄；CO2培養(yǎng)箱還應記錄CO2的含量。 6冰箱溫度記錄：按每一冰箱存放的物品不同設置不同的質控范圍，特別對低溫冰箱；每天記錄一次。 7自動化設備：按廠家提供的SOP文件進行質控；在設備軟件升級或修改版本時均應進行質量控制程序。 8.每一有權向臨床發(fā)報告的實驗室都應參加全國或省或市級質量控制活動。,六、實驗室質量保證和報告規(guī)范化,臨床微生物實驗室報告制度的規(guī)范 臨床微生物實驗室應對不同的細菌檢驗報告時間和內容應有相應的規(guī)定，并告訴臨床各科，依此可防止不明原因的報告延遲。 應分兩種報告形式： 危重感染報告: 常規(guī)報告:,六、實驗室質量保證和報告規(guī)范化,報告的規(guī)范化 1.涂片報告 革蘭染色：危重報告3060分鐘報告。報告內容應包括染色反應、是細