基因工程專題1-5.ppt

1、4.目的基因的檢測與鑒定：目的基因在受體細(xì)胞中是否穩(wěn)定存在，是否表達(dá)? （1）分子水平的鑒定： 檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入目的基因-目的基因能否在真核生物中穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵；檢測方法？ 檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA 檢測方法？ 檢測目的基因是否翻譯出了蛋白質(zhì) 檢測方法？ （2）個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定 方法？,核酸探針：核酸探針是指帶有放射性同位素(如32P)、熒光分子等標(biāo)記的特定已知序列的核酸片段，它能和與其互補(bǔ)的核酸序列雜交，形成雙鏈，所以可用于待測核酸樣品中特定基因序列的檢測。包括DNA探針和RNA探針。 核酸探針具有特異性，高度的敏感性。 核酸分子雜交：互補(bǔ)的核苷酸序列通過堿

2、基配對形成穩(wěn)定的雜合雙鏈分子的過程稱為核酸分子雜交。,完,把某一生物體內(nèi)全部已知基因分別點(diǎn)到DNA微列陣或者基因芯片上，再用不同發(fā)育階段的cDNA與之雜交，就能了解某些基因?qū)μ囟ㄉL發(fā)育階段的表達(dá)情況。,(1)斑點(diǎn)印跡(Dot-blot)將待測核酸樣品變性后直接點(diǎn)樣在膜上，稱之為斑點(diǎn)印跡。為使核酸牢固結(jié)合在膜上，通常還將點(diǎn)樣后的膜進(jìn)行80真空烘烤2h。 (2)Southern印跡(Southern blot)這是指將DNA片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移到固相支持物上的過程。 (3) Northern印跡(Northern blot)Northern印跡是指將RNA片段變性及電泳分離后，轉(zhuǎn)移到固

3、相支持物上的過程。 雜交的雙方是所使用探針和要檢測的核酸。該檢測對象可以是克隆化的基因組DNA,也可以是細(xì)胞總DNA或總RNA。根據(jù)使用的方法被檢測的核酸可以是提純的，也可以在細(xì)胞內(nèi)雜交, 即細(xì)胞原位雜交。探針必須經(jīng)過標(biāo)記，以便示蹤和檢測。使用最普遍的探針標(biāo)記物是同位素, 但由于同位素的安全性，近年來發(fā)展了許多非同位素標(biāo)記探針的方法,例如，使用熒光分子。,固相雜交包括膜上印跡雜交和原位雜交。前者包括三個(gè)基本過程：第一，通過印跡技術(shù)將核酸片段轉(zhuǎn)移到固相支持物上；第二，用標(biāo)記探針與支持物上的核酸片段進(jìn)行雜交；第三，雜交信號的檢測。 用探針對細(xì)胞或組織切片中的核酸雜交并進(jìn)行檢測的方法稱之為核酸原位雜

4、交。某特點(diǎn)是靶分子固定在細(xì)胞中，細(xì)胞固定在載玻片上，以固定的細(xì)胞代替純化的核酸，然后將載玻片浸入溶有探針的溶液里，探針進(jìn)入組織細(xì)胞與靶分子雜交，而靶分子仍固定在細(xì)胞內(nèi)。例如。可用特異性的細(xì)菌、病毒的核酸做為探針對組織、細(xì)胞進(jìn)行原位雜交，以確定有無該病原體的感染等。原位雜交不需從組織中提取核酸，對于組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性，在臨床應(yīng)用上有獨(dú)特的意義。 2.雜交反應(yīng)的基本過程雜交反應(yīng)包括預(yù)雜交、雜交和漂洗幾步操作。 預(yù)雜交的目的是用非特異性DNA分子(鮭精DNA或小牛胸腺DNA)及其它高分子化合物(Denharts溶液)將待測核酸分子中的非特異性位點(diǎn)封閉，以避免這些位點(diǎn)與探針的非特異性結(jié)合。雜交反應(yīng)是使單鏈核酸探針與固定在膜上的待測核酸單鏈在一定溫度和條件下進(jìn)行復(fù)性反應(yīng)的過程。雜交反應(yīng)結(jié)束后，應(yīng)進(jìn)行洗膜處理以洗去非特異性雜交以及未雜交的標(biāo)記探針，以避免干擾特異性雜交信號的檢測。膜洗凈后,將繼續(xù)進(jìn)行雜交信號的檢測。,基因芯片(gene chip)的原型是80年代中期提出的。基因芯片的測序原理是雜交測序方法，即通過與一組已知序列的核酸探針雜交進(jìn)行核酸序列測定的方法，可以用圖11-5-1來說明。在一塊基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探針。當(dāng)溶液中帶有熒光標(biāo)記的核酸序列TATGCA