第六章_生產(chǎn)菌種的生產(chǎn).ppt

1、第六章 生產(chǎn)菌種 的生產(chǎn),種子擴(kuò)大培養(yǎng)是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng),最終獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。,種子擴(kuò)大培養(yǎng)的概念:,種子擴(kuò)培的目的：,接種量的需要,菌種的馴化,縮短發(fā)酵時(shí)間、保證生產(chǎn)水平,種子的要求：,總量及濃度能滿足要求,生理狀況穩(wěn)定，個(gè)體與群體活力強(qiáng)，移種 至發(fā)酵罐后，能夠迅速生長(zhǎng),無雜菌污染,一、孢子的制備 （一）放線菌孢子的制備 采用瓊脂斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含適合產(chǎn)包子的麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨和無機(jī)鹽等，碳源和氮源不要太豐富。溫度28或37，培養(yǎng)514天。,第一節(jié) 種子制備

2、過程,（二）霉菌孢子的制備 以大米、小麥、玉米、麩皮等天然農(nóng)產(chǎn)品為培養(yǎng)基。溫度25 28，培養(yǎng)4 14天。,（三）細(xì)菌孢子的制備 細(xì)菌的斜面培養(yǎng)多采用限制碳源而氮源豐富的牛肉膏、蛋白胨培養(yǎng)基。溫度37 或28，培養(yǎng)510天。,二、種子的制備,實(shí)驗(yàn)室階段：不用種子罐，所用的設(shè)備為培養(yǎng)箱、搖床等實(shí)驗(yàn)室常見設(shè)備，在工廠這些培養(yǎng)過程一般都在菌種室完成，因此將這些培養(yǎng)過程稱為實(shí)驗(yàn)室階段的種子培養(yǎng)。,生產(chǎn)車間階段：種子培養(yǎng)在種子罐里面進(jìn)行，一般在工程歸為發(fā)酵車間管理，因此形象地稱這些培養(yǎng)過程為生產(chǎn)車間階段。,（一）實(shí)驗(yàn)室階段,1、培養(yǎng)物選擇的原則,目的：種子擴(kuò)培到一定的量和質(zhì)，根據(jù)菌種的特點(diǎn)最終的培養(yǎng)物可

3、分為兩類：,對(duì)于不產(chǎn)孢子和芽胞的微生物 獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體,對(duì)于不產(chǎn)芽孢和孢子的微生物，實(shí)驗(yàn)室階段的種子擴(kuò)培最終是獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體，如谷氨酸的種子培養(yǎng)。,獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的孢子,菌絲體培養(yǎng)步驟少，因而更容易獲得量和質(zhì)穩(wěn)定的種子，但操作繁瑣。,對(duì)于產(chǎn)孢子的微生物,獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌絲體,便于操作，但需要更仔細(xì)的控制。,2、培養(yǎng)基選擇的原則,培養(yǎng)基的選擇應(yīng)該是有利于菌體的生長(zhǎng)，對(duì)孢子培養(yǎng)基應(yīng)該是有利于孢子的生長(zhǎng)。,在原料方面，實(shí)驗(yàn)室種子培養(yǎng)階段，規(guī)模一般比較小，因此為了保證培養(yǎng)基的質(zhì)量，培養(yǎng)基的原料一般都比較精細(xì)。,3、起始接種物的傳代問題,細(xì)菌,保藏斜面 活化斜面,產(chǎn)孢子,保

4、藏 母斜面 子斜面,目的：使菌種的傳代次數(shù)盡可能的少。,（二）生產(chǎn)車間階段,1、培養(yǎng)物的選擇原則,在生產(chǎn)車間階段，最終一般都是獲得一定數(shù)量的菌絲體。,縮短發(fā)酵時(shí)間,有利于獲得好的發(fā)酵結(jié)果,菌絲體比孢子要有利：,2、培養(yǎng)基選擇的原則,目的：獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體，因此培養(yǎng)基的選擇應(yīng)首先考慮的是有利于孢子的發(fā)育和菌體的生長(zhǎng)，所以營(yíng)養(yǎng)要比發(fā)酵培養(yǎng)基豐富。,在原料方面：不如實(shí)驗(yàn)室階段那么精細(xì)，而是基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基，這有兩個(gè)方面的原因: 一是成本 二是馴化,3、發(fā)酵級(jí)數(shù)的確定,谷氨酸：三級(jí)發(fā)酵,一級(jí)種子（搖瓶）二級(jí)種子 （小罐）發(fā)酵,青霉素：三級(jí)發(fā)酵,一級(jí)種子 （小罐）二級(jí)種子（中罐）發(fā)酵,一般由

5、菌絲體培養(yǎng)開始計(jì)算發(fā)酵級(jí)數(shù)，但有時(shí)，工廠從第一級(jí)種子罐開始計(jì)算發(fā)酵級(jí)數(shù),發(fā)酵級(jí)數(shù)確定的依據(jù),級(jí)數(shù)受發(fā)酵規(guī)模、菌體生長(zhǎng)特性、接種量的影響,級(jí)數(shù)大，難控制、易染菌、易變異，管理困難，一 般2-4級(jí)。,在發(fā)酵產(chǎn)品的放大中，反應(yīng)級(jí)數(shù)的確定是非常重要 的一個(gè)方面,放線菌發(fā)酵生產(chǎn)的工藝流程,菌種 母斜面 子斜面 搖瓶種子 種子罐 發(fā)酵罐,青霉素生產(chǎn)的種子制備制備過程,安培管, 斜面孢子, 大米孢子, 一級(jí)種子, 二級(jí)種子, 發(fā)酵,1.斜面孢子,培養(yǎng)基：甘油、 葡萄糖、 蛋白胨等,培養(yǎng)基特點(diǎn)：有利于長(zhǎng)孢子，用量少而精細(xì),培養(yǎng)條件：25、7天, 注意濕度50%左右,2.大米孢子,培養(yǎng)基：大米及氮源（玉米漿）,

6、培養(yǎng)基的特點(diǎn)：成本低、米粒之間結(jié)構(gòu)疏松提高比表面積和氧的傳質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)適當(dāng)（要求大米的白點(diǎn)?。┯欣阪咦拥纳L(zhǎng)。,培養(yǎng)條件：25、7天，控制濕度,大米孢子的要求：1粒米含1.4*106個(gè)孢子,3.一級(jí) 種子,培養(yǎng)基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米漿,目的：長(zhǎng)菌體,培養(yǎng)條件：27，40小時(shí),接種量：200億孢子/噸,4.二級(jí) 種子,培養(yǎng)基：同上,培養(yǎng)條件：27、10-14小時(shí),接種量：10%,谷氨酸生產(chǎn)的種子制備制備過程,斜面菌種,一級(jí)種子培養(yǎng),二級(jí)種子培養(yǎng),發(fā)酵,1、斜面,培養(yǎng)基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化鈉 0.5 瓊脂 2%， pH 7.0-7.2,培養(yǎng)基特點(diǎn)：有利于菌體的生長(zhǎng)，原料比較精細(xì)

7、,培養(yǎng)條件：32，生長(zhǎng)18-24小時(shí),生長(zhǎng)斜面要求：生長(zhǎng)良好，所使用斜面連續(xù)傳代不超過 3次,2. 一級(jí)種子（搖瓶）,培養(yǎng)條件：于1000ml三角瓶中，裝液200-250ml,32培 養(yǎng)12小時(shí)。,培養(yǎng)基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米漿 2.5%， K2HPO4 0.1%,培養(yǎng)基特點(diǎn)：有利于菌體的生長(zhǎng)，所使用的原料已經(jīng)基 本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基,3. 二級(jí)種子(種子罐),培養(yǎng)條件：在種子罐中培養(yǎng)（容積為發(fā)酵罐的1%）， 32培養(yǎng)7-10個(gè)小時(shí),培養(yǎng)基：和一級(jí)種子相似，其中葡萄糖用水解糖代替， 濃度為2.5%,培養(yǎng)基的特點(diǎn)：長(zhǎng)菌體，更接近于發(fā)酵培養(yǎng)基,種子的質(zhì)量要求：,108-109個(gè)/ml 大小

8、均勻，呈單個(gè)或八字排列 PH 7.0-7.2時(shí)結(jié)束，6.887.0-7.2 活力旺盛,第二節(jié) 種子質(zhì)量的控制,種子質(zhì)量是影響發(fā)酵生產(chǎn)水平的重要因素。種子質(zhì)量的優(yōu)劣，主要取決于菌種本身的遺傳特性和培養(yǎng)條件。,一、影響孢子質(zhì)量的因素及其控制,孢子質(zhì)量與培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間和接種量等因素有關(guān)，這些因素相互聯(lián)系、相互影響。,（一）培養(yǎng)基,原材料的質(zhì)量 水,（二）培養(yǎng)溫度和濕度,1.溫度 獲得孢子的最適溫度范圍區(qū)間很窄。 例如：龜裂鏈霉菌斜面的最適溫度為36.537。 2.濕度 北方濕度控制在4045，南方濕度控制在3542，所得孢子質(zhì)量好。一般來說，真菌對(duì)濕度要求高，放線菌對(duì)濕度要求低。,（三）

9、培養(yǎng)時(shí)間和冷藏時(shí)間,絲狀菌在斜面培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)發(fā)育過程可分為五個(gè)階段：孢子發(fā)芽和基質(zhì)菌絲生長(zhǎng)階段、氣生菌絲生長(zhǎng)階段、孢子形成階段、孢子成熟階段、斜面衰老菌絲自溶階段。,過于年輕的孢子經(jīng)不起冷藏，過于衰老的孢子會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)能力下降。 孢子冷藏的時(shí)間宜短不宜長(zhǎng)。,母瓶：活化、純化，使保藏菌種生長(zhǎng)，并去處變異株。 所以接種時(shí)要稀一點(diǎn)、便于純化生長(zhǎng)到單菌落。,子瓶: 大量繁殖，得到大量孢子。 接種：從母斜面上點(diǎn)接種，選取生長(zhǎng)好的單菌落 接種時(shí)密一點(diǎn)，得到大量的孢子。,孢子培養(yǎng)時(shí)注意濕度，且子斜面使用一般不超過1個(gè)月,（四）接種量,二、影響種子質(zhì)量的因素及其控制,種子的質(zhì)量要求：,量：要求達(dá)到一定的濃度,

10、質(zhì): 形態(tài) （生長(zhǎng)處于某個(gè)階段、均勻等等） 理化指標(biāo)：C、N、P的含量，pH、酶活等,無污染,種子質(zhì)量重要受孢子質(zhì)量、培養(yǎng)基、種齡和接種量等因素影響。搖瓶種子的質(zhì)量主要以外觀顏色、效價(jià)、菌絲濃度和黏度以及糖代謝、pH變化為指標(biāo)。,（一）培養(yǎng)基,易于被菌體直接吸收和利用，營(yíng)養(yǎng)成分適當(dāng)豐富和完全，氮源和維生素含量較高，總濃度較細(xì)薄。,（二）培養(yǎng)條件,溫度 pH 通氣攪拌,（三）種齡,種齡是指種子罐中培養(yǎng)的菌體開始移入下一級(jí)種子罐或發(fā)酵罐時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間。,種齡短：生長(zhǎng)緩慢、泡沫多、發(fā)酵周期延長(zhǎng)以及菌體太少,菌絲結(jié)團(tuán)； 種齡長(zhǎng)：生產(chǎn)能力下降。,原則：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末，細(xì)胞活力強(qiáng)，菌體濃度相對(duì)較大，但是最終由

11、實(shí)驗(yàn)結(jié)果定。,細(xì)菌 724小時(shí) 霉菌 16 50小時(shí) 放線菌 21 64小時(shí),（四）接種量,移入種子的體積 接種量 接種后培養(yǎng)液的體積,大接種量可加速產(chǎn)物的形成，但會(huì)導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)過快、過稠，造成營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)缺乏和溶解氧不足。 接種量過小會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵前期菌體生長(zhǎng)緩慢，發(fā)酵周期延長(zhǎng)，菌絲量少，產(chǎn)生菌絲結(jié)團(tuán)。,過大過小都不好，最終以實(shí)踐定，如霉菌素發(fā)酵的接種量為0.1%1%，肌苷酸發(fā)酵接種量為1.5% 2%，霉菌的發(fā)酵接種量為10%，大多數(shù)抗生素為7-15%。但是一般認(rèn)為大一點(diǎn)好。,雙種：兩個(gè)種子罐接種到一個(gè)發(fā)酵罐中。,倒種：一部分種子來源于種子罐，一部分來源于發(fā)酵罐。,（五）種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),細(xì)胞或菌體（菌

12、體形態(tài)、濃度、培養(yǎng)液外觀） 生化指標(biāo)（糖、氮、磷含量的變化和pH) 產(chǎn)物生成量 酶活力,（六）種子異常分析,菌種生長(zhǎng)發(fā)育緩慢或過快 菌絲結(jié)團(tuán) 菌絲粘壁,（七）種子質(zhì)量的控制措施,種子質(zhì)量的優(yōu)劣是通過它在發(fā)酵罐中所表示的生產(chǎn)率體現(xiàn)的。因此必須保證生產(chǎn)菌種的穩(wěn)定性，在種子培養(yǎng)期間保證提供適宜的環(huán)境條件，保證無雜菌浸入，從而獲得優(yōu)良的種子。,菌種穩(wěn)定性的檢查,生產(chǎn)中所用的菌種必須保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力，不能有變異種。盡管變異的可能性很小，但不能完全排除這一危險(xiǎn)。所以，定期檢查和挑選穩(wěn)定菌株是必不可少的一項(xiàng)工作。,方法是：將保藏菌株溶于無菌的生理鹽水中，逐級(jí)稀釋，然后在培養(yǎng)皿瓊脂固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，長(zhǎng)出菌落，選擇形態(tài)優(yōu)良的菌落接入三角瓶進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)，檢測(cè)出生產(chǎn)率高的菌種備用。 這一分離方法適用于所有的保藏菌種，并且一年左右必須做一次。,雜菌檢查,在種子制備過程中，每移種一次都需要