06 連續(xù)培養(yǎng)操作技術(shù)

1、連續(xù)培養(yǎng)操作技術(shù),專題：,第一節(jié) 概 述一、基本概念,連續(xù)培養(yǎng)又稱連續(xù)發(fā)酵，是指以一定的速度向發(fā)酵罐內(nèi)添加新鮮培養(yǎng)基，同時以相同的速度流出培養(yǎng)液，從而使發(fā)酵罐內(nèi)的發(fā)酵液總量維持恒定，使培養(yǎng)物在近似恒定狀態(tài)下生長的微生物培養(yǎng)方式。,分批培養(yǎng)：細(xì)胞是在封閉的系統(tǒng)中進(jìn)行生長的。細(xì)胞的生長周期并不是微生物內(nèi)在特性的表現(xiàn)，而是培養(yǎng)液中營養(yǎng)物受到一定限制的結(jié)果；細(xì)胞生長的中斷是必需營養(yǎng)物消耗或有毒物質(zhì)積累的結(jié)果。 連續(xù)培養(yǎng)：細(xì)胞是在開放系統(tǒng)中進(jìn)行生長的?？稍谂囵B(yǎng)過程中移去部分培養(yǎng)液，同時以同樣的速度加入新的培養(yǎng)基質(zhì)，使整個系統(tǒng)中的微生物數(shù)量維持在連續(xù)的穩(wěn)定生長狀態(tài)。,與分批培養(yǎng)根本區(qū)別：,二、連續(xù)培養(yǎng)的特

2、點(diǎn),1、就實(shí)用性而言：生產(chǎn)效率高、占地面積小、節(jié)省勞力、節(jié)約能量(如接種體的制備、反應(yīng)器的清洗、滅菌)、產(chǎn)物質(zhì)量一致、自動化程度高、可控性好，培養(yǎng)基制備技術(shù)和下游加工技術(shù)更為有效和經(jīng)濟(jì)。,2. 連續(xù)培養(yǎng)的最大特點(diǎn)是： 微生物細(xì)胞的生長速度和產(chǎn)物的代謝均處于一個恒定的狀態(tài)，可以達(dá)到穩(wěn)定、高速培養(yǎng)微生物細(xì)胞或產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物的目的。,在連續(xù)培養(yǎng)過程中微生物細(xì)胞所處的環(huán)境條件，如營養(yǎng)物質(zhì)的濃度、產(chǎn)物濃度、pH以及微生物細(xì)胞的濃度、比生長速率等可以始終維持不變，甚至還可以根據(jù)需要來調(diào)節(jié)微生物細(xì)胞的生長速度。,3、作為一種研究工具：連續(xù)培養(yǎng)可以提供一種恒定的培養(yǎng)狀態(tài)，在此狀態(tài)下微生物的比生長速度恒定，細(xì)

3、胞的生理生化特性較為一致，是研究微生物生理學(xué)、遺傳學(xué)及生態(tài)學(xué)的理想材料。 4、連續(xù)培養(yǎng)用于生產(chǎn)：有利于生產(chǎn)效率和控制技術(shù)自動化程度的提高。,5、工業(yè)化應(yīng)用的主要障礙： （1）一些生產(chǎn)株系在連續(xù)培養(yǎng)過程中會由于篩選壓力而產(chǎn)生一定的變異和變得不穩(wěn)定。這是其工業(yè)化應(yīng)用的主要障礙，對于基因修飾細(xì)胞尤為如此。 （2）另外，在大規(guī)模生產(chǎn)過程中，要在長時間內(nèi)保持同樣的培養(yǎng)環(huán)境是很難的。 （3）有時，細(xì)胞在反應(yīng)器壁和傳感器上的黏附會妨礙培養(yǎng)過程的長期運(yùn)轉(zhuǎn)。,三、連續(xù)培養(yǎng)的應(yīng)用,1、在連續(xù)培養(yǎng)過程中可以獨(dú)立地改變某一個生長參數(shù)，從而有利于在加工過程的優(yōu)化中對細(xì)胞的生長和代謝動力學(xué)進(jìn)行研究。 2、與分批培養(yǎng)方式相

4、比，連續(xù)性混合培養(yǎng)方式更易于進(jìn)行多菌種間的競爭作用或相互作用方面的研究。,3、在連續(xù)培養(yǎng)過程中可以“捕捉”到一些在分批培養(yǎng)過程中很難觀察到的現(xiàn)象，如：同步生長和振蕩現(xiàn)象。 4、對連續(xù)培養(yǎng)在一個變量上浮或下滑過程中的過渡性質(zhì)進(jìn)行觀察，是研究細(xì)胞生長和代謝規(guī)律的一種有效手段。這種過渡特性也可用于培養(yǎng)方式的設(shè)計(jì)與優(yōu)化。 5、除此之外，連續(xù)培養(yǎng)還是篩選那些具有優(yōu)良生物學(xué)特性和繁殖力的菌系的有效手段。,在20世紀(jì)70年代，連續(xù)培養(yǎng)的應(yīng)用使生物學(xué)和細(xì)胞生理學(xué)方面的基礎(chǔ)研究受益匪淺，并在80年代和90年代初期重新得到使用。 其主要原因是：連續(xù)培養(yǎng)在單細(xì)胞蛋白、乙醇、溶劑、食品的工業(yè)化生產(chǎn)及廢水處理中具有巨大

5、的應(yīng)用潛力。,目前，連續(xù)培養(yǎng)在生物技術(shù)中的應(yīng)用多集中在廢水處理、初級代謝物 (如乙醇、有機(jī)酸) 和發(fā)酵型食品的生產(chǎn)、酶的催化反應(yīng)等方面。 另外，對動物細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，可以進(jìn)行單克隆抗體和重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。,原因：難以保證在長時間的連續(xù)培養(yǎng)過程中進(jìn)行純種培養(yǎng)，而且菌種在此培養(yǎng)條件下發(fā)生變異的可能性較大，在工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)上很少采用連續(xù)發(fā)酵。 目前，只有在丙酮丁醇厭氧發(fā)酵、紙漿液生產(chǎn)飼料酵母以及活性污泥處理各種廢水等方面，才使用連續(xù)發(fā)酵工藝。,但是，工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)上很少采用連續(xù)發(fā)酵,連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)的主要用途依然局限于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的基礎(chǔ)研究和工藝優(yōu)化。 例如： 1、利用連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)可以對一些新型生物技術(shù)

6、，如通過基因修飾細(xì)胞對動物細(xì)胞和微生物培養(yǎng)進(jìn)行定量研究。 2、連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)還可用于生物反應(yīng)器的定性、控制及放大試驗(yàn)等方面的研究。,新型恒化器(如自動恒化器)的開發(fā)與使用，不僅克服了恒化器的一些不足之處，而且開辟了連續(xù)培養(yǎng)的新途徑。 隨著高穩(wěn)定性重組菌株和細(xì)胞系的出現(xiàn)以及高穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性在線檢測及控制技術(shù)的發(fā)展，作為研究工具，連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)在基礎(chǔ)研究和工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用將更為廣泛。,發(fā)展?jié)摿?四、連續(xù)培養(yǎng)的操作簡介,根據(jù)控制模式，可分為兩種類型。 、恒化器(Chemostat)系統(tǒng)：以恒定不變的速度加入某一必需的限制性營養(yǎng)物，從而使系統(tǒng)中的細(xì)胞密度與生長速度發(fā)生相應(yīng)變化。 、恒濁器系統(tǒng)：在此系統(tǒng)的

7、控制過程中加入新鮮培養(yǎng)基,從而使系統(tǒng)中的細(xì)胞密度維持不變。 雖然控制菌體生長速度的方法并不一樣，但他們是互相補(bǔ)充的，可用相同的動力學(xué)表達(dá)式來表示。,最簡單的方法是在生化反應(yīng)器內(nèi)部的一定高度處安裝一個溢流管，從而當(dāng)一定的新基質(zhì)進(jìn)入反應(yīng)器時，就會有等量的培養(yǎng)液進(jìn)入溢流管，并在重力作用下通過收集器；也可使泵體與培養(yǎng)液出口相連,但必須要保證新基質(zhì)的壓入速度與流出速度相等。,這兩種系統(tǒng)的基本要求是使生化反應(yīng)器中的培養(yǎng)液體積保持不變?？刂婆囵B(yǎng)液體積的方法:,(一) 典型恒化裝置：,包括：滅菌的培養(yǎng)基貯存器、加料和出料泵、附攪拌器的培養(yǎng)罐、流出液面指示器(以保持培養(yǎng)罐恒定的容積)、pH控制器及取樣裝置，對需

8、氧微生物還有通入無菌空氣的裝置。系統(tǒng)的pH、溫度、溶解氧等控制恒定。 比較復(fù)雜的系統(tǒng)是把整個反應(yīng)器放在一個天平或負(fù)荷單元上，通過控制培養(yǎng)液的出口速度來保證反應(yīng)器的重量保持不變。,在實(shí)際操作過程中，除了對基質(zhì)進(jìn)入反應(yīng)器的量進(jìn)行控制以外，還需要考慮一些其他的環(huán)境參數(shù)，如溫度、pH、溶解氧。,除恒化器之外，能夠進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)的設(shè)備還有： 1、維持細(xì)胞密度恒定不變的恒濁器 2、不改變剩余底物濃度的營養(yǎng)恒定反應(yīng)器(nutri-stat) 3、維持pH不變的pH自動恒化器(pH-auxostat) 4、控制CO2排出速率(CER)為恒值的CER-恒化器(CER-stat) 5、維持氧量不變的溶氧恒化器(DO

9、2-stat)和攝氧恒化器(OUR-stat)等。,其他連續(xù)培養(yǎng)設(shè)備,第二節(jié) 連續(xù)培養(yǎng)的控制技術(shù)一、連續(xù)培養(yǎng)的基本理論,連續(xù)培養(yǎng)的方式有：單級連續(xù)培養(yǎng)、細(xì)胞回流單級連續(xù)培養(yǎng)和多級連續(xù)培養(yǎng)。,根據(jù)控制參數(shù)和操作模式不同，可將連續(xù)培養(yǎng)分為4種類型：,這些培養(yǎng)方式的共同點(diǎn)是： 在培養(yǎng)過程中，新鮮的滅菌培養(yǎng)基以恒定的流速(F，單位為L/h)輸入，與原有培養(yǎng)液瞬時混合后，以同等速度從培養(yǎng)罐流出，因而培養(yǎng)罐內(nèi)液體體積(V ，單位為L)保持不變。 流速與液體體積之比定義為稀釋速度(D)，即： D =F/V。,1、單級連續(xù)培養(yǎng)恒化器,整個培養(yǎng)過程是在一個培養(yǎng)罐中完成的連續(xù)裝置稱為單級連續(xù)培養(yǎng)裝置。 細(xì)胞在恒化

10、器中的生長速度是由必需營養(yǎng)物的供應(yīng)速度所決定的。這些營養(yǎng)物可以是碳、氮、磷或一些微量元素或維生素，而所有的其他必需營養(yǎng)物必須保持過量。 在此，以最常用的完全混合型單級連續(xù)培養(yǎng)恒化器為例介紹恒定狀態(tài)理論及其特性。,(1) 菌體平衡,圖6-2(a)是一個典型的單級恒化器示意。 在恒化器連續(xù)培養(yǎng)的初始階段，是一種分批培養(yǎng)。在一種營養(yǎng)物成為限制性因素之前，就要開始加入該營養(yǎng)物。直至所選擇的營養(yǎng)物成為限制性因素時細(xì)胞才停止生長。在此之后，細(xì)胞的生長受制于培養(yǎng)基的添加速率。為了描述恒定狀態(tài)下恒化器的特性，必須求出細(xì)胞和限制性營養(yǎng)物濃度與培養(yǎng)基流速(主要的獨(dú)立操作變量)之間關(guān)系的方程。,利用物料平衡可以很容

11、易地建立出有關(guān)的方程。對發(fā)酵罐而言菌體平衡可表示為：,這些方程成立的前提條件是假設(shè): 、細(xì)胞在反應(yīng)器中的分布是完全隨機(jī)的，即細(xì)胞未產(chǎn)生相互粘連或黏附于反應(yīng)器壁上，而且懸浮液混合充分; 、細(xì)胞群體是不可分隔的，且其中細(xì)胞的生理學(xué)特性完全一致; 、細(xì)胞群體濃度X是一個持續(xù)性變量，即細(xì)胞的數(shù)目足夠大，單個細(xì)胞的尺寸小得足以使生物基質(zhì)的不連續(xù)性可以忽略不計(jì); 、與培|養(yǎng)基的總體積相比，細(xì)胞所占據(jù)的體積可以忽略不計(jì)。,(2)、限制營養(yǎng)物的物料平衡,在連續(xù)培養(yǎng)的恒化器中，進(jìn)料速度是外定的，細(xì)胞生長受制于所選擇的營養(yǎng)物。也就是說,微生物的特定生長速率(,單位為h-1)是限制營養(yǎng)物一次函數(shù)。當(dāng)連續(xù)培養(yǎng)同時受制

12、于一種以上的營養(yǎng)物時，該定義就會得到拓展。但是,加人長抑制性營養(yǎng)物或者能夠產(chǎn)生毒素的營養(yǎng)物就會在所有營養(yǎng)物都保持充足的情況下抑制菌體的生長。嚴(yán)格來講,這些都不能稱為恒化器連續(xù)培養(yǎng)。,假設(shè)培養(yǎng)基一進(jìn)入反應(yīng)器中,就可以立即均勻地分布在整個培養(yǎng)基中,那么對于發(fā)酵罐,而言,限制營養(yǎng)物的物料平衡可表示為:,式(6-7)表示了連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞濃度與限制底物濃度的關(guān)系。這里有幾個假設(shè),即:假設(shè)細(xì)胞產(chǎn)率與比生長速度或稀釋速度無關(guān),細(xì)胞濃度除一種限制底物外與其他營養(yǎng)組分無關(guān)(它們都過量存在);其他環(huán)境因子都保持恒定。這些假設(shè)都近似或完全切合實(shí)際。,(3)、細(xì)胞濃度與稀釋速度的關(guān)系,方程(68)和方程(69)分別表示

13、了S和X對培養(yǎng)基流速(也就是D)的依賴關(guān)系。當(dāng)流速很低時,即D很小時,營養(yǎng)物全部被細(xì)胞利用,S0,細(xì)胞濃度X=S0/YX/S。如果D增加,開始X呈線性慢慢下降,然后,當(dāng)D =Dc= max時,X下降到0。開始時S隨D的增加而緩慢增加,當(dāng)D = max時,S接近于S0。在方程(69)中,當(dāng)X=0時,達(dá)到清洗點(diǎn)。,（4）實(shí)際操作與理想化單級恒化器連續(xù)培養(yǎng)動力學(xué)的偏離,上述簡單的單級恒化器連續(xù)培養(yǎng)動力學(xué)在某些微生物中的適應(yīng)性已得到證明，其中包括細(xì)菌、酵母菌以及植物細(xì)胞和動物細(xì)胞的培養(yǎng)。 大多數(shù)情況下，在這些培養(yǎng)過程中營養(yǎng)物質(zhì)的進(jìn)料速度很低、在小型生物反應(yīng)器中進(jìn)行、而且/或者其稀釋速度的范圍相對較窄。

14、在這些條件及倍增時間(td)的關(guān)系曲線下，在建立上述方程時所做的假設(shè)是成立的。,然而，偏離這種理論的現(xiàn)象也時常發(fā)生。 如圖64所示，在連續(xù)培養(yǎng)過程中，由于稀釋速度的變化而導(dǎo)致生物量的變化情況偏離單級恒化器動力學(xué)理論的典型曲線。 導(dǎo)致這種偏離的原因：可能是細(xì)胞與設(shè)備和反應(yīng)器的流體力學(xué)作用，如細(xì)胞的貼壁生長和攪拌不充分。,貼壁生長是由細(xì)胞在玻璃或金屬器皿的表面產(chǎn)生黏附所造成的。 如圖6-4(a)所示，貼壁生長會增大穩(wěn)定狀態(tài)下的生物基質(zhì)的濃度，從而導(dǎo)致操作過程中的稀釋速度大于最大特定生長率。,貼壁生長的影響,Brown等人研究了不充分的攪拌(滯流區(qū))對連續(xù)操作培養(yǎng)的影響圖64(b)。 在一定的稀釋速

15、度范圍內(nèi)細(xì)胞濃度會顯著下降，其下降程度取決于滯流區(qū)的大小以及滯流區(qū)和充分?jǐn)嚢鑵^(qū)間的液體交換速度。,不充分的攪拌的影響,在簡單的恒化器動力學(xué)中，人們假設(shè)培養(yǎng)基是攪拌充分的，即一滴培養(yǎng)基在進(jìn)入反應(yīng)器后應(yīng)該能夠立刻、均勻地分布在整個培養(yǎng)系統(tǒng)中。量化地講，這就意味著攪拌所需時間小于物質(zhì)傳遞和生物反應(yīng)需時間。 在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的反應(yīng)器中，所用的培養(yǎng)基只有幾升，這時通過維持適當(dāng)?shù)臄嚢杷俾示涂梢垣@得近乎充分的攪拌效果，除非反應(yīng)器具有攪拌不到的區(qū)域或者培養(yǎng)基質(zhì)變得很黏稠。 然而，在大型反應(yīng)器中攪拌不完全的現(xiàn)象是不可避免的。,在實(shí)驗(yàn)室用反應(yīng)器中連續(xù)培養(yǎng)動力學(xué)的偏離通常是由生物反應(yīng)所致。 其他因素包括：由于溢出代謝現(xiàn)

16、象和產(chǎn)物或底物對菌體生長抑制作用的存在，維持需要量(維持菌時所需要的營養(yǎng)物量)和菌體生長量會產(chǎn)生變化；當(dāng)菌體處于或低、或高的生長速率時都需要進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)節(jié)和分離操作。,如圖64c和圖64d所示，維持代謝和生長受到抑制都會使穩(wěn)定培養(yǎng)狀態(tài)下的菌體濃度有所降低，當(dāng)稀釋速度較低時尤為如此。當(dāng)菌體的生長受到強(qiáng)烈抑制時，只有當(dāng)稀釋速度明顯低于max時，才能進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。 上述操作因子可能會同時存在于一個培養(yǎng)系統(tǒng)。在這種情況下，菌體濃度和稀釋速度間的關(guān)系則變得更為復(fù)雜。,維持代謝和生長受到抑制的影響,（5）連續(xù)培養(yǎng)生產(chǎn)率與分批培養(yǎng)生產(chǎn)率的比較,目前在工業(yè)生產(chǎn)中連續(xù)培養(yǎng)主要用于生產(chǎn)微生物菌體。 以此為例，可比

17、較一下連續(xù)培養(yǎng)的生產(chǎn)率與分批培養(yǎng)的生產(chǎn)率。,連續(xù)培養(yǎng)的生產(chǎn)率可表示如下:,由式(6-16)可見，max越大，連續(xù)培養(yǎng)生產(chǎn)率與分批培養(yǎng)生產(chǎn)率之比越大，采用連續(xù)培養(yǎng)越有利，如max過小，則不宜采用連續(xù)培養(yǎng)。,2. 自動恒化器連續(xù)培養(yǎng),在自動恒化器中可以通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的輸入速度來使菌體生長依賴性參數(shù)保持恒定，稀釋速度和菌體的生長速度也得到相應(yīng)調(diào)節(jié)。 對于自動恒化器而言，可選擇性控制的反饋參數(shù)是相當(dāng)廣泛的，其中包括細(xì)胞濃度(濁度)、pH、溶解氧的濃度、氣體流中的C02含量以及營養(yǎng)物和產(chǎn)物的濃度。 有些時候參照自動恒化器的控制方式，以營養(yǎng)物為反饋生長參數(shù)可以將營養(yǎng)恒定反應(yīng)器改進(jìn)為營養(yǎng)自動恒化器。在不同種

18、類的自動恒化器中應(yīng)用最多的是恒濁器和pH自動恒化器。,恒濁器中的控制參數(shù)是菌體濃度。 由菌體濃度傳感器產(chǎn)生的信號傳給泵體，當(dāng)菌體濃度高于所規(guī)定的水平時泵體自動加入培養(yǎng)基。這樣通過恒濁器控制的反應(yīng)器中的菌體濃度是一定的，稀釋速度則自行調(diào)節(jié)至穩(wěn)態(tài)值。 （而在恒化器中稀釋速度是一定的，菌體濃度則自行調(diào)節(jié)至穩(wěn)態(tài)值）。,恒濁器,從原則上來講，恒濁器適用于菌體濃度隨稀釋速度改變(如接近于極限稀釋速度)而產(chǎn)生明顯變化的培養(yǎng)過程。 另外，恒濁器也可在有多余底物存在的一定情況下進(jìn)行菌體培養(yǎng)。,既然菌體的生長速度并不是固定的，利用該培養(yǎng)系統(tǒng)就可以篩選出生長較快的微生物。 通過不同基因型微生物(突變體)的篩選和細(xì)胞

19、代謝的調(diào)節(jié)可以增大菌體的最大生長速度。,但是由于微生物在傳感器表面的黏附，恒濁培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用僅局限于單細(xì)胞微生物，而且也難于進(jìn)行長期和大規(guī)模培養(yǎng)。 隨著以激光或近紅外透射/散射為基礎(chǔ)的光學(xué)傳感器的發(fā)展，與菌體長期控制有關(guān)的問題可能會得到部分解決。,在pH自動恒化器中，結(jié)合使用了新鮮培養(yǎng)基的加入和pH的控制技術(shù)。 當(dāng)pH偏離設(shè)定的pH時，就通過加入新鮮培養(yǎng)基的方式使pH回到設(shè)定值。 培養(yǎng)基的加入速度取決于培養(yǎng)基中營養(yǎng)物的緩沖能力的濃度。,pH自動恒化器,在用新鮮培養(yǎng)基控制pH的過程中，通過調(diào)整進(jìn)料的緩沖能力和（或）其中的限制營養(yǎng)物濃度，可以控制反應(yīng)器中限制營養(yǎng)物的水平。 當(dāng)培養(yǎng)系統(tǒng)的產(chǎn)酸量或產(chǎn)堿

20、量比較高時，培養(yǎng)基的緩沖能力可能達(dá)不到要求。在這種情況下可將營養(yǎng)物和培養(yǎng)基分別加入。 營養(yǎng)物的濃度決定了菌體在攝入營養(yǎng)物時產(chǎn)生和釋放出的離子種類和數(shù)量。,菌體在pH自動恒化器中的特異性生長速率與培養(yǎng)基的緩沖力和培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的濃度呈反比。 簡而言之，菌體在低緩沖力培養(yǎng)基中的生長速率是其在緩沖良好的培養(yǎng)基中的10倍以上。菌體濃度也主要取決于培養(yǎng)基的緩沖力。,培養(yǎng)系統(tǒng)中pH的變化是細(xì)胞生長情況及其代謝活力的良好指示。它是菌體在吸收營養(yǎng)物的過程中產(chǎn)生不同離子種類和所釋放出的離子數(shù)目的一個綜合表現(xiàn)。 導(dǎo)致培養(yǎng)系統(tǒng)中pH下降的原因：通常是有機(jī)酸的生成和銨的吸收。 然而對于在蛋白質(zhì)或氨基酸富裕的培養(yǎng)基上

21、生長的微生物而言，pH將會隨著菌體的生長而增大，因?yàn)榫w在此過程中產(chǎn)生了多余的氨。,一般而言，自動恒化器優(yōu)于傳統(tǒng)的恒化器。 首先，自動恒化器可以在接近最大生長速率的“高獲取量(high gain)”范圍內(nèi)進(jìn)行操作。 其次，在高的稀釋速度下，自動恒化器達(dá)到穩(wěn)定態(tài)的速度比開放循環(huán)式恒化器更快。 再次，在自動恒化器中菌群選擇壓力下可以加快培養(yǎng)的進(jìn)程。 最后，自動恒化器可以設(shè)計(jì)成雙點(diǎn)式(dual set-point)自動恒化器，可以同時控制兩種生長參數(shù)(如兩種營養(yǎng)物的濃度)。這種雙點(diǎn)式自動恒化器可以很容易地控制營養(yǎng)物的濃度比例。 但從另一方面來講，自動恒化器的試驗(yàn)計(jì)劃和操作過程是比較復(fù)雜的。,3. 細(xì)

22、胞再循環(huán)單級恒化器,細(xì)胞循環(huán)是在連續(xù)培養(yǎng)過程中提高菌體和產(chǎn)物濃度的一種有效途徑。在此系統(tǒng)的操作過程中稀釋速度高于菌體的最大生長速度，從而導(dǎo)致較高的反應(yīng)器產(chǎn)出量。這種反應(yīng)器的另一特點(diǎn)是，稀釋速率幾乎與菌體的生長速率無關(guān)。由于菌體再循環(huán)操作增大了稀釋速率的臨界值，從而可以防止底物抑制作用所帶來的菌體生長休克現(xiàn)象。 特別是它具有以下優(yōu)點(diǎn)：、在流出物的處理過程中生長限制營養(yǎng)物不可避免地得到稀釋；、當(dāng)所用的底物為氣體時，底物的溶解性低；、因?yàn)檠鲋菩援a(chǎn)物的形成，生長限制底物的濃度必須處于有限水平；、產(chǎn)物的形成與菌體的生長無關(guān)。,用于回收菌體的方法很多，如過濾、沉淀、離心和固定化。 根據(jù)反應(yīng)器內(nèi)部或外部的分

23、離設(shè)施，可將這些方法進(jìn)一步分為內(nèi)部系統(tǒng)和外部系統(tǒng)。 除廢水的生物處理以外，最常用的一種方法是，在反應(yīng)器外部用膜過濾的方法對培養(yǎng)物進(jìn)行濃縮。 廢水的生物處理中長期使用的一種方法是，對污泥進(jìn)行沉淀后再進(jìn)行循環(huán)處理。,圖62(c)所示，單級恒化器的流出液經(jīng)過濾、沉淀、離心或固定化后，再將得到的微生物細(xì)胞部分地回加到發(fā)酵罐內(nèi)，形成再循環(huán)系統(tǒng)。這樣可以增加系統(tǒng)的穩(wěn)定性，而且可以增加恒化器內(nèi)的細(xì)胞濃度。 X1、 X2分別代表從發(fā)酵罐和離心機(jī)流出的細(xì)胞濃度，F(xiàn)和F1分別代表流入發(fā)酵罐的培養(yǎng)基流速和流出離心機(jī)的培養(yǎng)液流速。如果引入再循環(huán)比率和濃縮因子C兩個參數(shù)，再采取與前述類似方法可推導(dǎo)出，在恒定狀態(tài)下:,動

24、力學(xué)：,由此可見，當(dāng)存在細(xì)胞再循環(huán)時不再等于D0，因?yàn)镃 1，所以1+一C永遠(yuǎn)小于1，則永遠(yuǎn)小于D。這就表明，在帶有細(xì)胞再循環(huán)的單級恒化器中，有可能達(dá)到很高的稀釋速度，而細(xì)胞沒有被“清洗”的危險(xiǎn)。同樣，恒定狀態(tài)下的細(xì)胞濃度比不具有再循環(huán)功能的恒化器中的細(xì)胞濃度高出一個因子1/(1+一C)。,4. 多級連續(xù)培養(yǎng),圖6-2(d)為一種簡單的多級連續(xù)培養(yǎng)：,由表6-2可見，在第2個發(fā)酵罐內(nèi) 2D2，如果不向第2個發(fā)酵罐補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，則第2個發(fā)酵罐內(nèi)的凈生長速度就會很??；如果向第2個發(fā)酵罐內(nèi)補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，不僅可以促進(jìn)細(xì)胞的生長，而且可以使D處于比 max更大的數(shù)值。,二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與操作1. 實(shí)驗(yàn)的

25、設(shè)計(jì)與操作原則,在設(shè)計(jì)一個長期運(yùn)轉(zhuǎn)的連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)時，必須要注意到，由于選擇壓力的存在有可能使菌體產(chǎn)生自發(fā)性突變。具有競爭優(yōu)勢的菌體遲早會戰(zhàn)勝反應(yīng)器中的原始菌株。因此在研究均一細(xì)胞群體生理特性的過程中，為了研究細(xì)胞對環(huán)境條件變化的反應(yīng)和由于突變所導(dǎo)致的基因變化，一次培養(yǎng)的時間不應(yīng)過長。,（1）實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì),在培養(yǎng)時間過長(例如：對于腸桿菌來講，大約為23周)時，一些培養(yǎng)物會在代謝壓力(例如：底物過量、生長因子的限制、產(chǎn)物抑制等)下產(chǎn)生聚集或產(chǎn)生強(qiáng)烈的貼壁生長。 當(dāng)對在這種情況下獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析時應(yīng)該加以注意。對于這些類型的培養(yǎng)來講，也應(yīng)對操作時間進(jìn)行限制。 如果計(jì)劃進(jìn)行長時期操作，應(yīng)該考慮到，對

26、管道(由于泵送和酸、堿溶液的作用產(chǎn)生破壞)和加工中所用到的氣體輸入和流出管道進(jìn)行必要的替換。,對培養(yǎng)基進(jìn)行設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)是，用于細(xì)胞生長和產(chǎn)物合成所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，除了含有平衡生長所必需的所有組分或那些有可能對菌體的生長動力學(xué)和產(chǎn)物形成產(chǎn)生干擾的營養(yǎng)物質(zhì)以外，還應(yīng)在連續(xù)培養(yǎng)中建立起營養(yǎng)物質(zhì)的適當(dāng)濃度。特別是，要對某種生長因子進(jìn)行限制時更要如此。隨著新型生物技術(shù)(如重組DNA)在高價值產(chǎn)物的生產(chǎn)過程中變得越來越重要，化學(xué)合成培養(yǎng)和適應(yīng)進(jìn)料方式的應(yīng)用也越來越廣泛。對于這些目的來講化學(xué)計(jì)量學(xué)和代謝調(diào)控的思路是特別重要的。,（2）培養(yǎng)基的配制,為了避免沉淀物的產(chǎn)生，應(yīng)該考慮到培養(yǎng)基的穩(wěn)定性和營養(yǎng)物質(zhì)間的相

27、互作用。 培養(yǎng)基中組分產(chǎn)生沉淀的原因可能是，高濃度的金屬離子(如鐵、鈣、鎂等離子)、高壓滅菌過程中的高溫以及高pH。這會導(dǎo)致金屬離子和一些其他痕量元素的損失以及對細(xì)胞的生長和產(chǎn)物的形成產(chǎn)生不良影響。 為了獲得較高的細(xì)胞濃度，應(yīng)該對金屬離子和痕量元素進(jìn)行仔細(xì)控制(或減少)。EDTA和檸檬酸之類鰲合劑的使用，特別是與其他方法結(jié)合使用，可以有效地減少沉淀的產(chǎn)生。 正確地選擇金屬離子也是很重要的，因?yàn)槟切┡c磷酸鹽和鎂離子相關(guān)的不溶性鹽的形成通常也會帶來一定的問題。,連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)的滅菌比分批培養(yǎng)系統(tǒng)更為復(fù)雜，因?yàn)樗枰嗪透蟮馁A液槽來貯存喂料培養(yǎng)基和酸、堿溶液，而且在操作過程中需要對其進(jìn)行重新填充和

28、替換(圖65)。,（3）培養(yǎng)基和設(shè)備的滅菌,培養(yǎng)基中的一些組分或酸、堿溶液需要進(jìn)行滅菌。 與各種貯液槽連接的輸送管道和與反應(yīng)器連接的肉湯容器會成為污染源，因此應(yīng)該對其進(jìn)行滅菌處理，并進(jìn)行仔細(xì)連接。應(yīng)在無菌環(huán)境下進(jìn)行連接操作，例如，如果反應(yīng)器系統(tǒng)較小，則要在干凈的操作臺上進(jìn)行連接。 當(dāng)反應(yīng)器的體積大于5L時需要進(jìn)行原位滅菌?？梢杂?21的濕蒸汽進(jìn)行原位滅菌?？蓪⒄羝ㄟ^雙層或反應(yīng)器內(nèi)部的熱交換器對設(shè)備進(jìn)行間接滅菌,也可將蒸汽直接通人反應(yīng)器中進(jìn)行直接滅菌。直接通入蒸汽是比較快速和容易的操作方法，但是，由于蒸汽的冷凝作用會使培養(yǎng)基的體積增大10%15%。,大型反應(yīng)器的管道系統(tǒng)一般用蒸汽進(jìn)行原位滅菌。

29、管道系統(tǒng)應(yīng)該盡量地短、直,并呈一定坡度向下走向,從而保證蒸汽及冷凝蒸汽在重力的作用下順利流出。應(yīng)該盡量避免T形連接。 為了將污染減少到最低程度,所有與反應(yīng)器的無菌操作部分連接的管道都應(yīng)該進(jìn)行焊接處理,而不應(yīng)有可以拆卸的連接部分。這是非常昂貴的,因此只用于特殊的加工過程(如細(xì)胞培養(yǎng))。 在生物反應(yīng)器的實(shí)際操作中需要用可以拆卸的連接方式，從而使反應(yīng)器具有較高的靈活性。在這種情況下與滅菌設(shè)備相適應(yīng),所有的連接部分都應(yīng)設(shè)計(jì)成凸緣形。為了避免塵土的積累,凸緣連接點(diǎn)處的管道交叉部分既不能減少也不能增加。最普遍的兩種凸緣系統(tǒng)是所謂的快速連接夾環(huán)系統(tǒng)和螺絲系統(tǒng)。這些凸緣連接的共同特點(diǎn)是,通過O形環(huán)可以達(dá)到無菌

30、連接。O形環(huán)是自動密封元件,其所用的全部密封壓力隨著系統(tǒng)壓力的增大而增大。,連續(xù)培養(yǎng)過程中,溫度、pH和溶解氧（PO2)的測定和控制方法與分批培養(yǎng)相似。然而,在連續(xù)培養(yǎng)過程中,pH和PO2有些在短期發(fā)酵過程是不常遇到的問題。由于生物膜的生長及蛋白質(zhì)和其他物質(zhì)在探測器頂部的吸附,會引起pH和PO2探測結(jié)果產(chǎn)生一定的偏移。然而可以通過改變培養(yǎng)系統(tǒng)的pH,并與非在線檢測的測定結(jié)果進(jìn)行對比,就可以對pH探針進(jìn)行粗略校對。但是溶氧探針則不能進(jìn)行如此校對。在任何時候只要可能,就應(yīng)該用極譜儀溶氧探針。在自動清洗以后它比電流溶氧探針更為穩(wěn)定,可用零點(diǎn)電極對其零點(diǎn)進(jìn)行校對。.,（4）環(huán)境的控制,微生物的連續(xù)培養(yǎng)

31、是以分批培養(yǎng)的方式開始的。在底物徹底消耗完之前,這種培養(yǎng)系統(tǒng)一般會在菌體指數(shù)生長期轉(zhuǎn)換為連續(xù)培養(yǎng)。在系統(tǒng)發(fā)生轉(zhuǎn)換以后培養(yǎng)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)運(yùn)動力學(xué)特性會發(fā)生很大變化,其變化情況取決于轉(zhuǎn)換發(fā)生時的培養(yǎng)特性及反應(yīng)器的環(huán)境。環(huán)境因素的突然變動,特別是當(dāng)?shù)孜镉上拗扑睫D(zhuǎn)變?yōu)檫^剩水平時,就會產(chǎn)生振蕩性轉(zhuǎn)換。如果培養(yǎng)系統(tǒng)中突然進(jìn)入一種濃度非常高的有毒性底物,就會產(chǎn)生非常強(qiáng)烈的振蕩性轉(zhuǎn)換,以至于要將菌體全部洗出。如果系統(tǒng)表現(xiàn)出特別的復(fù)雜,連接培養(yǎng)啟動的時間和操作模式會導(dǎo)致不同的轉(zhuǎn)換特性和不同的穩(wěn)定狀態(tài)。,（5）操作系統(tǒng)的啟動,在大多數(shù)情況下,在起始的分批生長階段只用一半濃度的培養(yǎng)基就可以使分批培養(yǎng)平緩地進(jìn)入連續(xù)培養(yǎng)階

32、段。當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)中細(xì)胞濃度的一半時開始補(bǔ)入營養(yǎng)料。通過這種方式,在轉(zhuǎn)換發(fā)生以后培養(yǎng)系統(tǒng)開始進(jìn)入一種營養(yǎng)物限制性供給的分批培養(yǎng)階段。隨著細(xì)胞濃度的增大,細(xì)胞的生長速度不斷下降,直至達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)時的細(xì)胞濃度。此時,開啟液面控制器,開始進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵。,穩(wěn)定狀態(tài)的定義為,細(xì)胞生理機(jī)能上的加工參數(shù)(如底物濃度、菌體、產(chǎn)物)不再發(fā)生變化時的連接培養(yǎng)條件。通常情況下,只通過在線或非在線地檢測加工參數(shù)的水平來判斷培養(yǎng)系統(tǒng)是否達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。在這種情況下可能會涉及到許多參數(shù)。如果有產(chǎn)物形成,應(yīng)對產(chǎn)物的濃度給予特別重視。通常情況下產(chǎn)物到達(dá)恒值的時間晚于菌體和底物濃度。甚至細(xì)胞生理機(jī)能到達(dá)穩(wěn)定狀態(tài)的速度更慢

33、,當(dāng)其需要進(jìn)行長期適應(yīng)時尤其如此。 在由Monod動力學(xué)控制的理想恒化器中,達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)所需要的時間大約為, 在條件發(fā)生變化以后進(jìn)行34次培養(yǎng)轉(zhuǎn)換所用的時間。培養(yǎng)的替換時間(剩余時間)表示為1/D。實(shí)際上,達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)所需要的時間一般更長,其具體的時間取決于培養(yǎng)系統(tǒng)的動力學(xué)特性和變化的大小。,（6）穩(wěn)定狀態(tài)下的動力學(xué)特性和檢測,圖66給出了一些例子,它們說明了當(dāng)培養(yǎng)基的進(jìn)料速度一定時連續(xù)培養(yǎng)在底物濃度發(fā)生不同變化以后的轉(zhuǎn)換特性。當(dāng)新的料液濃度(y0)剛好處于前面穩(wěn)定狀態(tài)值(y01)之上時,大約在停留40次時間以后才重新達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。停留24次以后,才能看出其中的變化。,在一些培養(yǎng)系統(tǒng)中會發(fā)生多

34、重穩(wěn)定狀態(tài)。根據(jù)操作模式,在相同的培養(yǎng)條件下可以得出兩種顯著不同的穩(wěn)定狀態(tài)。近年來,人們對連續(xù)培養(yǎng)中微生物的多重性和穩(wěn)定性進(jìn)行了理論分析和數(shù)學(xué)分析,并將其與實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對比。圖67描述了在一定的底物濃度下進(jìn)行培養(yǎng)的一些結(jié)果。就目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看,對于在沒有底物限制條件下生長的微生物來講,在底物過量的情況下,產(chǎn)物抑制作用和產(chǎn)物形成速度增大的結(jié)合作用成為形成多重性和滯后現(xiàn)象的主要原因。這些因素的綜合影響也能導(dǎo)致不正常的動力學(xué)特性,即產(chǎn)生振蕩性轉(zhuǎn)換,由一個穩(wěn)定態(tài)轉(zhuǎn)向另一個穩(wěn)定態(tài),并且繼續(xù)產(chǎn)生振蕩性轉(zhuǎn)換。,第三節(jié) 連續(xù)培養(yǎng)的附屬設(shè)備,一、連續(xù)培養(yǎng)的一般設(shè)備,在連續(xù)反應(yīng)系統(tǒng)中至少含有3個這樣的單元。 (

35、1) 反應(yīng)容器: 即在生物反應(yīng)器。處于中心位置，其上裝有用于輸送氣體、攪拌液體(培養(yǎng)基)和固體(細(xì)胞或不溶性物質(zhì))的裝置，取樣孔以及溫度、pH、溶解氧、泡沫和反應(yīng)體積的控制設(shè)備。,(2) 適于滅菌的培養(yǎng)基貯存器、pH和泡沫控制液貯存器 一般而言，其中貯存的應(yīng)為均質(zhì)的混合培養(yǎng)基，其中含有碳源物質(zhì)和能源物質(zhì)(如葡萄糖)以及一定濃度的其他營養(yǎng)物。 如果所用的組分為對熱比較敏感，所需容器還要更多，因?yàn)樗鼈冃枰獑为?dú)滅菌?？梢栽谶M(jìn)入反應(yīng)器以前，用具計(jì)量功能的儀器(如泵)將組分混合在一起，或者將各組分用不同的輸送管道分別連接在反應(yīng)器上。,(3) 肉湯的取出和連接容器 雖然不是必需的，但其在培養(yǎng)基流速的檢測方

36、面是十分有用的，而且還可以避免微生物流失到環(huán)境中。 此裝置與滿足一些用途如菌系(或突變體)篩選的連續(xù)培養(yǎng)配置相比要簡單得多。,二、設(shè)備的選擇與設(shè)計(jì),發(fā)酵類型決定了設(shè)備的選擇。 培養(yǎng)基的組成(化學(xué)的或復(fù)合的)和微生物形態(tài)(絲狀的或單細(xì)胞的)嚴(yán)格地決定了所用的設(shè)備類型。 因此，以下建議只能作為指導(dǎo)，在實(shí)際應(yīng)用過程中還應(yīng)根據(jù)實(shí)際需要對其進(jìn)行改進(jìn)或替換。,1. 反應(yīng)器.,反應(yīng)器的規(guī)模是在連續(xù)培養(yǎng)中進(jìn)行設(shè)備選擇和制訂培養(yǎng)計(jì)劃時所要考慮的重要因素。反應(yīng)器的工作體積在很大程度上決定了培養(yǎng)基的消耗量和其他附屬設(shè)備。 用于研究目的的小試反應(yīng)器操作起來比較方便，所需資金和空間適中，所用蠕動泵的可信度高。而且這種反

37、應(yīng)器易于進(jìn)行拆分清洗。,然而，小型容器具有一些獨(dú)特的問題： 當(dāng)培養(yǎng)基的體積少于500ml時，取樣會導(dǎo)致培養(yǎng)液體積的顯著減少，從而對稀釋速度產(chǎn)生影響并導(dǎo)致培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)生振蕩。 在低稀釋速度水平上，很難對流速進(jìn)行控制，而且進(jìn)料流速較低時混合培養(yǎng)基中的物質(zhì)會在輸送線中產(chǎn)生沉淀，從而產(chǎn)生堵塞現(xiàn)象。 在較低的壓力和通氣速度下，通常很難對氣體進(jìn)行在線檢測。 當(dāng)培養(yǎng)容器小時貼壁生長菌體在全部菌群中所占的比例會變得相當(dāng)大。,在大多數(shù)情況下，工作體積為15L (整體體積為27L)的微型培養(yǎng)系統(tǒng)是比較合適的。 動物細(xì)胞培養(yǎng)用反應(yīng)器理想的工作體職較小(如0.52L),因?yàn)樗玫呐囵B(yǎng)基比較昂貴。 另外，在選擇反應(yīng)器時還

38、應(yīng)考慮到其在分批培養(yǎng)或補(bǔ)料分批培養(yǎng)中的應(yīng)用。 雖然也有其他類型的小型反應(yīng)器，如氣升式反應(yīng)器和流化床反應(yīng)器，但是在小試培養(yǎng)系統(tǒng)中常用的仍然是攪拌釜反應(yīng)器。,對于反應(yīng)器類型的選擇在很大程度上取決于研究目的。 小型攪拌釜反應(yīng)器還包括各種不同的設(shè)計(jì)，例如：容器的底部可以設(shè)計(jì)成平底或圓底的。 平底反應(yīng)器易于臺式操作和自動清洗。 圓底反應(yīng)器的攪拌性能較好，多用于剪切力敏感細(xì)胞的培養(yǎng)。 還有夾套式的反應(yīng)器，玻璃夾套式反應(yīng)器比熱交換器內(nèi)置式反應(yīng)器的控溫效果要好，夾套式反應(yīng)器更適用于熱敏性培養(yǎng)系統(tǒng)。,2. 營養(yǎng)物貯液槽及其附件,營養(yǎng)物貯液槽應(yīng)具有輸料孔、熱敏性營養(yǎng)物、底物添加孔和/或攪拌孔、通風(fēng)孔及營養(yǎng)物排泄孔

39、。 進(jìn)料孔和排料孔應(yīng)該通過不銹鋼管道與容器的底部相連。通風(fēng)孔與無菌過濾器相連。 貯液槽中必需有一個磁力攪拌棒，以便使所有的顆粒都能懸浮起來，并對后來加入的滅菌培養(yǎng)基進(jìn)行攪拌。 專用的取樣孔可用于從貯液槽中取樣，以便測定再次注滿的貯液槽中底物的準(zhǔn)確濃度。,可用(外有木箱保護(hù)的)小口大玻璃瓶或玻璃燒瓶作為中轉(zhuǎn)貯液槽，瓶的容量應(yīng)足夠大，其中所裝的培養(yǎng)基應(yīng)至少能夠滿足一次穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)的要求。 中轉(zhuǎn)貯液槽中培養(yǎng)基的量可用體積表示，可將貯液槽放在一個稱重器上，以便在幾個小時或幾天后檢查營養(yǎng)物的進(jìn)料速度。另外，它還應(yīng)具有足夠的靈活性，以便在菌體生長限制物不同時進(jìn)行營養(yǎng)物濃度的調(diào)整。,中轉(zhuǎn)貯液槽,系統(tǒng)中所用的管道

40、應(yīng)為硅膠管或特殊的不透氣性管道。這種管道應(yīng)能夠耐受重復(fù)滅菌, 并能保持其原有的彈力，且具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性。 在進(jìn)行管道的連接時應(yīng)做到無菌、快速、可靠。 應(yīng)意識到，蠕動泵的流速取決于管道的彈性。因?yàn)殡S著使用時間的延長，硅膠管會失去其原有的彈性，所用的管道應(yīng)該有足夠的長度，以便每隔一天就剪掉一段，使泵與新的管道部分相連。在必要時對管道進(jìn)行更換,以便進(jìn)行連續(xù)操作。,管道及其連接,培養(yǎng)基輸入口可與離反應(yīng)器很近的一個滴管相連。滴管在培養(yǎng)基的流動途徑中起到一種緩沖作用，并且能夠防止微生物感染料液輸送管道。 這種滴管可從發(fā)酵罐生產(chǎn)廠家購買或自行設(shè)計(jì)，如圖69所示。如果反應(yīng)器中的壓力增大,滴管的緩沖作用就會

41、失靈。,3.液體培養(yǎng)基的排出及其水平的控制,為了準(zhǔn)確和持續(xù)的控制稀釋速度，必須測定和控制培養(yǎng)系統(tǒng)的工作體積。 培養(yǎng)系統(tǒng)的工作體積通常定義為：未通氣的液體體積。,用于控制未通氣的液體體積的參數(shù)有兩個： 1、通氣后的液體體積(假設(shè)液體的持氣量為常數(shù)) 2、反應(yīng)器內(nèi)容物的重量。 由于通氣后的體積易于控制，其應(yīng)用范圍較為廣泛。如果換為重量控制，則只要安裝正確就能進(jìn)行準(zhǔn)確控制，但是對于分批培養(yǎng)來講，這種控制方式的成本太高。在圖65所示的反應(yīng)系統(tǒng)中，工作體積的控制為重量控制單元。根據(jù)天平上的信號來控制泵體除去培養(yǎng)基。,用于控制通氣后液面的基本途徑有兩種。 1、最簡單的一種是通過由通氣產(chǎn)生的壓力控制。 氣流

42、的排出設(shè)備可置于液體培養(yǎng)基的表面。氣流直接通入一個廢物貯液槽中，后者由無菌空氣通氣并通過空氣滅菌設(shè)備與大氣相連。當(dāng)培養(yǎng)基的體積增大至高于氣體流出孔時，液體培養(yǎng)基被壓進(jìn)一個含氣的貯液槽中。有時，可用泵體抽出液體培養(yǎng)基,而不是用氣流。 這兩種系統(tǒng)都存在一個問題，即處于氣/液界面的細(xì)胞濃度與其在整體液體的濃度大不相同，當(dāng)有泡沫形成時更是如此。這就會導(dǎo)致由反應(yīng)器中取出的培養(yǎng)基不具有代表性。,2. 另一種方法是用液面控制器進(jìn)行控制。 雖然這一技術(shù)所需要的設(shè)備較多，但用它可以從液體表面的下部取出肉湯。 目前已有一定數(shù)量的液面控制器面世。其中大多數(shù)控制器的基礎(chǔ)是容器內(nèi)部與液體培養(yǎng)基進(jìn)行物理性接觸的傳感器。由

43、于傳感器位于反應(yīng)器的內(nèi)部，一旦探測失靈，就不能再用。所用傳感器的類型不同，導(dǎo)致體積控制有所偏差的原因有由攪動、通氣、泡沫的產(chǎn)生以及貼壁生長等現(xiàn)象所造成的振蕩。 除此之外，還有超聲波水平控制器。它可以連接在玻璃或不銹鋼容器的外側(cè)。如果傳感器發(fā)生故障,可以在對無菌操作狀態(tài)不產(chǎn)生任何影響的情況下對其進(jìn)行替換。,4.氣體的輸入與輸出系統(tǒng),圖610所示為氣體供給與流出系統(tǒng)的一個例子。 氣體的濕度阻止了容器中培養(yǎng)基水分的蒸發(fā)，如果在氣體輸出管中對培養(yǎng)基的流速進(jìn)行測定，還可以提高判斷稀釋速度的準(zhǔn)確程度。當(dāng)操作溫度相對較高(如高于35)時，當(dāng)所用的壓縮氣體很干燥時，或者當(dāng)稀釋速度小于0.1h-1時，這一點(diǎn)就顯

44、得非常重要。 可以用適當(dāng)孔徑的膜過濾器或包裝好的玻璃纖維過濾器對氣體輸入系統(tǒng)進(jìn)行滅菌。 用由T字形物連接起來的兩個過濾器進(jìn)行預(yù)處理，當(dāng)用到加濕器時更要進(jìn)行如此處理。當(dāng)一個過濾器產(chǎn)生堵塞時,可以松開另一個過濾器的夾子,馬上投入使用。,為了安全起見，對氣體供入量進(jìn)行調(diào)節(jié)是非常重要的。當(dāng)氣體輸出管發(fā)生堵塞時氣壓應(yīng)當(dāng)?shù)偷米阋苑乐谷萜鳟a(chǎn)生爆炸。 流出的氣體應(yīng)直接進(jìn)入一個溢流貯液槽(安全容器)中。通過這種方式可以控制泡沫溢出現(xiàn)象。然后溢流貯液槽與裝有0.5%漂白劑的刻度圓筒相連。 如果要對氣體進(jìn)行在線檢測，就需要從貯液槽中引出一個氣體支路。,剩余的排出氣體引入圓柱體液體中，然后由滅菌過的過濾器中排出。 這

45、個圓柱體有多種功能。 首先，它為容器提供了一定的回壓，這種壓力是對流出氣體進(jìn)行分析時所需要的，也有利于取樣。 其次，它是目測氣體流速是否達(dá)到足以進(jìn)行氣體分析或反應(yīng)系統(tǒng)是否密封完好的一種手段。沒有氣泡產(chǎn)生時，表明系統(tǒng)失去控制。當(dāng)培養(yǎng)的菌體為致病性微生物或重組微生物時，特別要考慮這一點(diǎn)。 最后，它可以作為一種清除器，以減少實(shí)驗(yàn)室中的不良?xì)馕丁?5. 細(xì)胞再循環(huán)裝置,在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模上，通過使用可進(jìn)行蒸汽滅菌的微濾膜組件，可以很容易對細(xì)胞進(jìn)行再循環(huán)處理。 圖611所示為這種組件的一個簡化結(jié)構(gòu)。它由毛細(xì)管狀微孔膜組成。 膜通常由聚丙烯或與其相似的材料制成，而且最初是疏水性的。當(dāng)用乙醇進(jìn)行濕潤以后變成親水性

46、的。通過改變膜組件的直徑和孔徑，可以獲得不同的過濾面積。,微濾過程中常見的一個問題是，在操作過程中過濾速度會有所降低。這主要是因?yàn)樵谀け砻嫘纬闪松锬ず偷鞍踪|(zhì)膜(膜污染)，和膜親水性能的喪失。影響膜污染的因素包括細(xì)胞的濃度與特性、循環(huán)速度以及液體培養(yǎng)基的特性和過濾速度。消泡劑的使用也會對膜的操作特性產(chǎn)生顯著影響。為了減小膜的浸染程度，通常用齒輪泵來使液體培養(yǎng)基的循環(huán)速度最低維持在0.51mA。當(dāng)所培養(yǎng)的菌體為剪切力敏感性細(xì)胞時，這種操作就會帶來一定的損傷。,應(yīng)該定期用滲透液對膜組件進(jìn)行反沖。 這種反沖操作的示意如圖所示。進(jìn)行沖洗時可用小型滲透液貯備槽。這一操作過程可由計(jì)算機(jī)或計(jì)時器進(jìn)行控制。當(dāng)

47、進(jìn)行反沖時，打開氣體(N2)輸送管道，關(guān)閉滲透液管道和泵體。滲透液通過反沖管路被壓回膜組件。反沖壓力(如105Pa)不應(yīng)超過生產(chǎn)廠家所提供的膜組件的最大操作壓力(對于大多數(shù)膜組件來講，大約為2105Pa到3105pa。,對于長期運(yùn)轉(zhuǎn)的系統(tǒng)來講，應(yīng)該每天用無菌蒸餾水對膜組件進(jìn)行反沖洗。在此之前，用NaOH溶液進(jìn)行清洗或用乙醇進(jìn)行濕潤可以從本質(zhì)上恢復(fù)膜組件的過濾性能。操作時應(yīng)該注意防止NaOH和/或乙醇流入反應(yīng)器中。 建議用兩個平行的膜組件，當(dāng)一個膜組件正在清洗時,可用另一個膜組件進(jìn)行操作。,第四節(jié) 連續(xù)培養(yǎng)的應(yīng)用,早在20世紀(jì)20年代，連續(xù)培養(yǎng)已被用于生產(chǎn)飼料酵母，但直到1950年，Monod等

48、才對連續(xù)培養(yǎng)的理論加以分析討論。 連續(xù)培養(yǎng)在工業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用雖不如分批培養(yǎng)普遍，但在科學(xué)研究中日益得到廣泛的應(yīng)用。 本節(jié)擬對連續(xù)培養(yǎng)的應(yīng)用情況進(jìn)行簡要介紹和舉例說明。,一、概述,如前所述，連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞生產(chǎn)速率高于分批培養(yǎng)，因此連續(xù)培養(yǎng)在單細(xì)胞蛋白的生產(chǎn)和丙酮、丁醇、啤酒等生產(chǎn)中得到了廣泛應(yīng)用。在廢水的生化處理中采取對活性污泥進(jìn)行循環(huán)利用的連續(xù)培養(yǎng)方式，有利于增加設(shè)備的處理能力和提高水的處理質(zhì)量。,但是連續(xù)培養(yǎng)在工業(yè)上的應(yīng)用遠(yuǎn)不如分批培養(yǎng)那樣普遍。 這主要是因?yàn)檫B續(xù)培養(yǎng)的時間長、容易染菌及菌種易發(fā)生退化。當(dāng)退化細(xì)胞所占的比例逐漸增大時,生產(chǎn)能力就會逐漸下降。另外,細(xì)胞在反應(yīng)器、攪拌軸、排液管中

49、的生長也增大了長期進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)的難度。,連續(xù)培養(yǎng)的特性決定了其在實(shí)驗(yàn)室具有廣泛的用途,可分為以下幾個方面。,1. 菌體生產(chǎn),和分批培養(yǎng)相比，連續(xù)培養(yǎng)省去了反復(fù)的放料、清洗、裝料、滅菌等步驟，避免了延遲期，因而設(shè)備的利用率高，菌體的生產(chǎn)率相應(yīng)提高。,另外，在連續(xù)培養(yǎng)時選用適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)物質(zhì)作為限制性基質(zhì)，也有可能提高產(chǎn)物的生產(chǎn)率。 舉例： 利用連續(xù)培養(yǎng)變異鏈球菌生產(chǎn)乳酸時，利用碳源作為限制性基質(zhì)時乳酸產(chǎn)量較低，但當(dāng)用磷酸鹽或氮源作為限制性基質(zhì)時，菌體的生長受到限制，培養(yǎng)基中碳源轉(zhuǎn)化為乳酸的效率提高，生產(chǎn)速率也大有提高。,有時可采用多級連續(xù)培養(yǎng)提高生產(chǎn)速率。 例如： PHB的生產(chǎn)中，整個發(fā)酵過程可分為

50、兩個階段來進(jìn)行，即菌體生長階段和PHB合成階段。 根據(jù)這一特點(diǎn)，考慮采用二級連續(xù)培養(yǎng)，第一級以碳源為生長限制性基質(zhì)和氮源豐富的條件下，菌體細(xì)胞大量繁殖而胞內(nèi)積累的PHB量很少，以獲得大量菌體，第二級只流加PHB合成所需的碳源，而不補(bǔ)加氮源，促進(jìn)PHB的生產(chǎn)。,2. 代謝產(chǎn)物生產(chǎn),連續(xù)培養(yǎng)在工業(yè)上用于大量生產(chǎn)微生物代謝產(chǎn)物的實(shí)例較少，原因： 1、主要原因：長期運(yùn)行時易發(fā)生雜菌污染和菌種退化。 2、菌體在反應(yīng)器壁、攪拌軸、排液管等處生長，增加了實(shí)施連續(xù)培養(yǎng)的困難。 3、菌體在連續(xù)培養(yǎng)時不斷被稀釋，菌體濃度比分批培養(yǎng)時低，雖然連續(xù)培養(yǎng)在一些操作條件下有非常高的產(chǎn)物比生產(chǎn)速率，但胞外產(chǎn)物的濃度往往比分

51、批培養(yǎng)低得多，這也是其應(yīng)用受到限制的一個重要原因。 已在工業(yè)上應(yīng)用的有啤酒和丙酮-丁醇等的生產(chǎn)。,采用連續(xù)培養(yǎng)的方法生產(chǎn)微生物的代謝產(chǎn)物時，應(yīng)注意選用恰當(dāng)?shù)南拗菩曰|(zhì)。 例如：利用以葡萄糖為碳源來生產(chǎn)乳酸時，若限制性基質(zhì)為葡萄糖，則乳酸的比生產(chǎn)率很低。若以氮源為限制性基質(zhì)，乳酸的比生產(chǎn)率有很大提高，而且乳酸的濃度最大；若限制性基質(zhì)為磷酸鹽，則乳酸的比生產(chǎn)率達(dá)最大。,3. 微生物的生理特性研究,在分批培養(yǎng)中微生物的比生長速率很難加以控制，而在連續(xù)培養(yǎng)中，微生物的比生長速率可通過改變稀釋率來加以控制，因而在連續(xù)培養(yǎng)的穩(wěn)定狀態(tài)下可以從容地研究微生物在不同生長速率下的生理特性。,連續(xù)培養(yǎng)也被成功地用于微生物代謝調(diào)節(jié)的研究。 舉例：精氨酸合成途徑中的阻遏和解阻遏問題。 通過對一些變異株的連續(xù)培養(yǎng)證實(shí)，由谷氨酸合成精氨酸的第6個酶鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲基酶的合成受精氨酸的阻遏;鳥氨酸或瓜氨酸具有解阻遏作用