單分子測(cè)序PacBio技術(shù)和應(yīng)用解決方案

1、單分子測(cè)序PacBio技術(shù)和應(yīng)用解決方案 一、 技術(shù)原理 SMRT：single molecular real time Sequencing PacBio RS，RS表示Real time Sequencing 關(guān)鍵之一：DNA聚合酶 基本原理：DNA聚合酶和模板結(jié)合，4色熒光標(biāo)記4種堿基，經(jīng)過(guò)Watson配對(duì)后不同的堿基加入，會(huì)發(fā)出不同光，根據(jù)光的波長(zhǎng)與峰值可判斷進(jìn)入的堿基類型。和其他基本測(cè)序技術(shù)一樣，在反應(yīng)管中進(jìn)行的是大規(guī)模平行的多分子反應(yīng)，怎樣在其中進(jìn)行單分子反應(yīng)檢測(cè)？周圍有大量的熒光標(biāo)記的游離堿基，怎樣將反應(yīng)信號(hào)與周圍游離堿基的強(qiáng)大熒光背景區(qū)別出來(lái)？ 通過(guò)一個(gè)物理現(xiàn)象解釋：ZMW（z

2、ero-mode waveguides，零模波導(dǎo)孔）。例如微波爐壁上可看到有很多密集的小孔。小孔直徑有考究，如果直徑大于微波波長(zhǎng)，能量就會(huì)穿透面板泄露。如果孔徑小于波長(zhǎng)，能量不會(huì)輻射外部，起保護(hù)作用。 在一個(gè)反應(yīng)管（SMRTCell：?jiǎn)畏肿訉?shí)時(shí)反應(yīng)孔）中有許多這樣的圓形納米小孔，即ZMW（零模波導(dǎo)孔），外徑100多納米，比檢測(cè)激光波長(zhǎng)?。〝?shù)百納米），激光從底部打上去后不能穿透小孔進(jìn)入上方溶液區(qū)，能量被限制在一個(gè)小范圍（體積20X 10-21L）里，正好足夠覆蓋需要檢測(cè)的部分，使得信號(hào)僅來(lái)自這個(gè)小反應(yīng)區(qū)域，孔外過(guò)多游離核苷酸單體依然留在黑暗中，將背景降到最低。 單個(gè)ZMW底部固定有一個(gè)結(jié)合了模板

3、DNA的聚合酶，當(dāng)加入測(cè)序反應(yīng)試劑后，每個(gè)堿基配對(duì)合成后會(huì)發(fā)出相應(yīng)的光并被檢測(cè)。一個(gè)SMRTCell中有15萬(wàn)個(gè)ZMW，每個(gè)孔中有一個(gè)單分子DNA鏈在高速合成，如眾星閃爍。原始檢測(cè)數(shù)據(jù)的結(jié)果，每合成一個(gè)堿基即顯示為一個(gè)脈沖峰，每分鐘100個(gè)堿基的速度，配上高分辨率的光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，就能實(shí)時(shí)檢進(jìn)行檢測(cè)。 關(guān)鍵點(diǎn)之二：熒光標(biāo)記位點(diǎn)。這是影響測(cè)序長(zhǎng)度的非常關(guān)鍵的因素。二代測(cè)序都標(biāo)記在5端甲基上，在合成過(guò)程中，熒光標(biāo)記物保留在DNA鏈上，隨DNA鏈的延伸會(huì)產(chǎn)生三維空間阻力導(dǎo)致DNA鏈延長(zhǎng)到一定程度后會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)讀。這是NGS的測(cè)序讀長(zhǎng)僅能達(dá)到100多bp到200bp的一個(gè)原因。 PacBio平臺(tái)的堿基熒光標(biāo)

4、記在3端磷酸鍵。在DNA合成過(guò)程中正確的堿基進(jìn)入時(shí)，在3端磷酸鍵的標(biāo)記是會(huì)隨磷酸鍵斷裂自動(dòng)被打斷，標(biāo)記物被棄去，亦即合成的DNA鏈不帶熒光標(biāo)記，和天然的DNA鏈合成產(chǎn)物一致，可以達(dá)到很長(zhǎng)的讀長(zhǎng)。關(guān)鍵點(diǎn)之三：時(shí)空段概念 合成過(guò)程中，每次進(jìn)入一個(gè)堿基，原始數(shù)據(jù)會(huì)實(shí)時(shí)地產(chǎn)生一個(gè)脈沖峰，每?jī)蓚€(gè)相鄰的脈沖峰之間有一定的距離，也就是有一個(gè)時(shí)間段的概念。距離與模板上堿基是否存在修飾有關(guān)，如果有堿基修飾，就像開(kāi)車經(jīng)過(guò)路障時(shí)，通過(guò)速度會(huì)減慢，導(dǎo)致兩個(gè)相鄰峰之間距離加大。根據(jù)這個(gè)距離的變化，可以判斷模板相應(yīng)位點(diǎn)是否出現(xiàn)堿基修飾，并且結(jié)果是實(shí)時(shí)的。甲基化就是一種主要的堿基修飾，PacBio技術(shù)不僅可以提供序列信息，

5、還可提供實(shí)時(shí)信息了解模板修飾的情況，用于甲基化等堿基修飾研究。 二、 測(cè)序流程和策略 配件：SMRT cell chip（小拇指指甲蓋大小）。一條strip可以放8個(gè)SMRT cell，儀器一次可運(yùn)行2條strip，共16個(gè)SMRT cell 文庫(kù)構(gòu)建試劑盒，測(cè)序試劑盒 流程和策略 1. 文庫(kù)制備 材料：全基因組DNA，或者cDNA，或者目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物 片段化：全基因組太大需要片段化，因?yàn)闇y(cè)序讀長(zhǎng)很長(zhǎng)，可以做很大的片段文庫(kù)（3-10kb） 連接：先把片段粘末端變成平端，兩端分別連接環(huán)狀單鏈：?jiǎn)捂渻啥朔謩e與雙鏈正負(fù)鏈連接上，得到一個(gè)類似啞鈴（“套馬環(huán)”）的結(jié)構(gòu)，稱為SMRT Bell。連接半小時(shí)內(nèi)

6、完成。（問(wèn)題：片段化用什么方法？?jī)啥说沫h(huán)狀單鏈?zhǔn)峭恍蛄袉?？如何確定單鏈方向？如果兩端一樣，如何分辨正負(fù)鏈？如何排除其他連接產(chǎn)物？連接效率有多高？如何純化去掉酶？） 關(guān)于以上文庫(kù)制備問(wèn)題跟NGS類似，比如用片段化儀進(jìn)行片段化，加接頭等等。通過(guò)優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)protocol進(jìn)行各步驟的優(yōu)化。 如此，文庫(kù)制備完成，簡(jiǎn)單快速。無(wú)需擴(kuò)增。沒(méi)有擴(kuò)增偏向性，高或低GC含量區(qū)域覆蓋均勻，尤其不會(huì)湮沒(méi)稀有突變。 2 引物退火 + 聚合酶結(jié)合 當(dāng)引物與模板的單鏈環(huán)部位退火后，這個(gè)雙鏈部位就可以結(jié)合到已固定在ZWM底部的聚合酶上（問(wèn)題：大分子DNA進(jìn)入小孔的擴(kuò)散速度？是否會(huì)存在有的ZMW沒(méi)有模板進(jìn)入的情況？SMRTC

7、ell中樣本和測(cè)序反應(yīng)體系的配置都是在測(cè)序儀中程序化自動(dòng)完成的，簡(jiǎn)單快捷，標(biāo)準(zhǔn)化。會(huì)，目前的通量基于目前的進(jìn)入效率，因此這方面還有提高的空間）。 3. 測(cè)序策略 萬(wàn)事俱備，一旦向反應(yīng)中加入正常的離子，DNA聚合反應(yīng)開(kāi)始了。模板雙鏈打開(kāi)成環(huán)形，先合成正鏈，單鏈區(qū)，跟著合成負(fù)鏈。聚合酶每合成一圈，對(duì)于定向目標(biāo)序列，就相當(dāng)于2x覆蓋度。由于合成產(chǎn)物和天然產(chǎn)物一致，聚合酶可以持續(xù)合成很長(zhǎng)很長(zhǎng)的產(chǎn)物，亦即循環(huán)合成很多圈（重復(fù)多次），對(duì)于定向單分子目標(biāo)序列來(lái)說(shuō)就可以得到很高的覆蓋度，即獲得很多subread，這就意味著可以對(duì)非常低的頻率的片段獲得很高的準(zhǔn)確度，這稱為環(huán)形一致序列（circle consen

8、sus）模式，該模式適用于稀有突變及需要高精確度的測(cè)序。這也是單分子測(cè)序能比NGS靈敏度更高地，高準(zhǔn)確度地檢測(cè)到稀有突變的原理。 除了特有的環(huán)形一致序列（circle consensus）模式外，也可以通過(guò)增加同一序列的覆蓋度（在不同ZMW中）獲取高的一致性準(zhǔn)確度。單分子覆蓋度和獲取序列一致性準(zhǔn)確度的關(guān)系 QV 10代表90%準(zhǔn)確度，20代表99%準(zhǔn)確度，30代表99.9%準(zhǔn)確度，40代表99.99%準(zhǔn)確度，50代表99.999%準(zhǔn)確度。由圖可見(jiàn)，5個(gè)單分子疊加可以得到99%準(zhǔn)確度，10個(gè)單分子疊加可以得到99.9%準(zhǔn)確度，15個(gè)單分子疊加可以得到99.99%，20個(gè)單分子疊加可以得到5個(gè)9的

9、準(zhǔn)確度。類推。而對(duì)于因此可以看出，利用環(huán)形一致序列模式這個(gè)策略，對(duì)同一單分子就可以得到非常非常高的準(zhǔn)確度。 三、 Q&A 1. 關(guān)于準(zhǔn)確度差的說(shuō)法如何解釋？ 回答補(bǔ)充于此：?jiǎn)畏肿訙y(cè)序1覆蓋度的精確度為87.5，這是由于在測(cè)序過(guò)程中單個(gè)分子信號(hào)弱，偶爾會(huì)出現(xiàn)信號(hào)難于分辨的情況。出錯(cuò)幾率是隨機(jī)的，和序列長(zhǎng)度、序列組成無(wú)關(guān)。要提高準(zhǔn)確率，只需要提高循環(huán)次數(shù)，提高單分子覆蓋度即可，15個(gè)單分子疊加可以得到99.99的精確度。（問(wèn)題：是否就是相當(dāng)于200bp長(zhǎng)度目標(biāo)序列，15個(gè)循環(huán)？用PCR擴(kuò)增結(jié)果測(cè)序是否能通過(guò)提高重復(fù)拷貝數(shù)而提高覆蓋度，從而同時(shí)達(dá)到長(zhǎng)片段和高度精確的目的？是，可以通過(guò)提高重復(fù)拷貝數(shù)或

10、對(duì)同一單分子環(huán)形測(cè)序兩種方式，或二者結(jié)合，達(dá)到要求的覆蓋度及準(zhǔn)確度。）一代和二代測(cè)序的每一個(gè)反應(yīng)，本來(lái)就是N個(gè)分子同時(shí)疊加反應(yīng)所得到的平均信號(hào)。如果需要很長(zhǎng)的讀取，策略是構(gòu)建3 kb-10 kb的文庫(kù)，就可以獲得長(zhǎng)的讀長(zhǎng)，這就是continuous longread模式。這種模式，很長(zhǎng)的讀長(zhǎng)適合做全基因組序列組裝骨架。讀長(zhǎng)分布圖。平均讀長(zhǎng)3.1kb，top 5% 讀長(zhǎng)大于8kb，最長(zhǎng)讀長(zhǎng)14.7kb。（問(wèn)題：按照每分鐘100bp速度，平均30分鐘內(nèi)完成測(cè)序，最長(zhǎng)需要2個(gè)多小時(shí)？如何平衡時(shí)間？讀最長(zhǎng)的酶有何不同？為何能讀這么長(zhǎng)？是序列變化，還是構(gòu)象變化，還是固定的問(wèn)題？目前有標(biāo)準(zhǔn)的protoco

11、l，長(zhǎng)片段測(cè)序推薦為90min，實(shí)時(shí)上酶反應(yīng)速度非?？?，100bp，讀長(zhǎng)主要跟酶的活性保持有關(guān)，主要受激光對(duì)它的損傷的影響，當(dāng)然其它如序列本身，構(gòu)象也會(huì)有一定影響。廠家還在不斷優(yōu)化聚合酶的性能，比如給聚合酶加上免受激光影響的保護(hù)基團(tuán)等，進(jìn)一步地提高讀長(zhǎng)，提高測(cè)序質(zhì)量和通量）。四、 技術(shù)應(yīng)用 一種新技術(shù)的應(yīng)用，通常倚借其技術(shù)特長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)。 PacBio單分子測(cè)序的技術(shù)特征 超長(zhǎng)的讀長(zhǎng)de novo測(cè)序中完整基因組的組裝； Target測(cè)序中多個(gè)突變位點(diǎn)的單倍體型檢測(cè)，復(fù)雜的多個(gè)重復(fù)片段的準(zhǔn)確測(cè)定，長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本及可變剪切體測(cè)定等等 超高測(cè)序準(zhǔn)確度及單分子分辨率特定序列的SNP檢測(cè)，稀有突變及其頻率測(cè)定

12、動(dòng)態(tài)信息可獲得甲基化等多種堿基修飾信息 1. 超長(zhǎng)的讀長(zhǎng) 二代測(cè)序的短處在于讀長(zhǎng)太短。就像拼圖游戲，越碎的碎片就越難拼接。雖然提供海量的數(shù)據(jù)，但是依然不足以完成全基因組拼接。去年在Nature上發(fā)表的一篇綜述文章指出，二代測(cè)序讀長(zhǎng)太短是其技術(shù)的內(nèi)有問(wèn)題（fundamental data properties），數(shù)學(xué)模式所不能解決的。算法已經(jīng)很成熟，算法再好，也不足以解決這個(gè)問(wèn)題。 PacBio的超長(zhǎng)讀長(zhǎng)，可實(shí)現(xiàn)以相對(duì)較低的覆蓋度達(dá)到很好的序列組裝。有助于產(chǎn)生較少的重疊群，幫助全基因組組裝。還可以獲得復(fù)雜的DNA重組信息，比如由于斷裂造成的融合基因的Breakpoint，cDNA里包含的剪切，內(nèi)

13、外顯子間的關(guān)系，都需要很長(zhǎng)的讀長(zhǎng)幫助組裝跨越的區(qū)域。 因此，對(duì)于全基因組de novo測(cè)序來(lái)說(shuō)，更適宜用組合的方法，將第三代和第二代測(cè)序方式結(jié)合。冷泉港去年宣布研發(fā)一個(gè)軟件，能將PacBio結(jié)果和二代測(cè)序結(jié)果結(jié)合。 舉例： 美國(guó)能源部對(duì)一個(gè)微生物進(jìn)行測(cè)序，用二代測(cè)序最好的結(jié)果可以組裝得到58個(gè)重疊群contig.，而用PacBio可以直接得到一個(gè)contig，一步完成全基因組組裝。 轉(zhuǎn)錄本剪切變異體：可檢測(cè)出一個(gè)基因的13個(gè)剪切變異體，原因在于讀長(zhǎng)大，跨度大。 美國(guó)農(nóng)業(yè)部對(duì)羊體內(nèi)微生物進(jìn)行測(cè)序。用二代測(cè)序沒(méi)能組裝起全基因組，最少也有18個(gè)contig。用PacBio，用6K長(zhǎng)度21x覆蓋度，可

14、以組裝成單個(gè)contig。這說(shuō)明長(zhǎng)序列測(cè)序確實(shí)可以幫助組裝。另外一個(gè)重要問(wèn)題，GC%對(duì)測(cè)序覆蓋度的影響：對(duì)于二代測(cè)序技術(shù)，GC含量高的地方覆蓋度低，即使再提高全基因組覆蓋度，但富含GC的區(qū)域覆蓋度還是難以提高，無(wú)法填補(bǔ)。這就造成用二代測(cè)序很難完成一些物種的全基因組測(cè)序的原因，或者有的全基因組測(cè)序結(jié)果存在不少洞的原因。 單分子測(cè)序平臺(tái)很適合困難基因組的測(cè)序，比如GC含量很高，AT含量很高，多堿基串聯(lián)重復(fù)（如CGG重復(fù)），普通測(cè)序技術(shù)很難獲得結(jié)果。這個(gè)平臺(tái)對(duì)這類很難測(cè)序的區(qū)域都能平穩(wěn)的測(cè)序。單分子測(cè)序結(jié)果顯示這種技術(shù)覆蓋度不隨GC含量變化而變化，曲線平穩(wěn)。均一的覆蓋度對(duì)全基因組測(cè)序的完成非常重要。

15、 舉例，全長(zhǎng)cDNA測(cè)序結(jié)果。5端轉(zhuǎn)錄本開(kāi)始，4號(hào)外顯子，5號(hào)外顯子，3UTR，polyA區(qū)。polyA區(qū)域100多個(gè)A的測(cè)序峰非常清晰。然后到套馬環(huán)區(qū)，然后到PolyT 區(qū)。能測(cè)長(zhǎng)PolyA對(duì)研究RNA的代謝有重要意義，RNA的半衰期和PolyA長(zhǎng)度有關(guān)，對(duì)其穩(wěn)定性很有意義。 中心粒測(cè)序：中心粒的一段序列有很高重復(fù)，用Sanger和二代測(cè)序都很難得到結(jié)果，用PacBio能夠完成。 脆性X綜合癥的大量重復(fù)的CGG序列都可以測(cè)序。 2. 動(dòng)態(tài)信息可獲得甲基化等修飾信息的例子 PacBio提供實(shí)時(shí)的測(cè)序，一能提供測(cè)序結(jié)果，即堿基的排列組合，二是可以提供基因修飾的信息（PacBio技術(shù)對(duì)甲基化的檢測(cè)

16、可參考Nature Method發(fā)表的一篇文章）其原理在于，當(dāng)聚合酶合成每一個(gè)堿基，都有一個(gè)時(shí)間段，兩個(gè)相鄰的脈沖峰之間的距離和參考序列的距離可以算一個(gè)比值，稱為IPD。當(dāng)模板堿基帶有修飾時(shí)，聚合酶會(huì)慢下來(lái)，就像行車過(guò)程中遇到路障。兩個(gè)相鄰的脈沖峰之間的距離就會(huì)延長(zhǎng)。當(dāng)看到某個(gè)堿基IPD比例明顯大于1時(shí)，就可以推斷這個(gè)位置有修飾。 德國(guó)致命性大腸桿菌爆發(fā)事件 由于食物污染了致命性大腸桿菌而導(dǎo)致數(shù)千人出現(xiàn)了腸出血性急性腹瀉，導(dǎo)致50人死亡。3個(gè)研究小組分別對(duì)該事件中的爆發(fā)性大腸桿菌進(jìn)行測(cè)序，來(lái)分析其基因型。 德國(guó)小組采用二代測(cè)序，2個(gè)樣本，參照序列比對(duì)測(cè)序，聚類分析結(jié)果得出是EHEC亞型。Pac

17、Bio與哈佛大學(xué)合作，對(duì)2711爆發(fā)株進(jìn)行的de novo測(cè)序組裝。證實(shí)是EAEC亞型，結(jié)果發(fā)表在同一期的新英格蘭雜志。測(cè)序結(jié)果也發(fā)現(xiàn)基因組出現(xiàn)了一個(gè)外源嗜菌體帶入的一段基因，上面有志賀毒素基因。 PacBio小組邀請(qǐng)New England Biolabs公司協(xié)助對(duì)該大腸桿菌株測(cè)序結(jié)果進(jìn)行甲基化方面的生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明該基因組上確實(shí)有很多甲基化出現(xiàn)（約45000個(gè)）。通過(guò)排除法，發(fā)現(xiàn)爆發(fā)株里有CTGCAG motif特有的甲基化，還發(fā)現(xiàn)插入的外源序列中還有一段序列類似甲基化酶，可專門對(duì)CTGCAG的序列進(jìn)行甲基化。對(duì)CTGCAG甲基化有關(guān)的基因表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)表達(dá)上調(diào)的基因包括菌毛，鞭毛體

18、和與細(xì)胞注入有關(guān)的基因，這些結(jié)果也許可能解釋為嗜菌體侵染而注入一段外源基因，其中包含一種甲基化酶，導(dǎo)致爆發(fā)株表達(dá)改變，提高對(duì)宿主吸附性，連同志賀毒素，而導(dǎo)致毒性升高。最后功能學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，將該爆發(fā)株注入兔子，同樣出現(xiàn)出血性腹瀉癥狀，而當(dāng)基因敲除這個(gè)甲基化酶，再注入兔子，癥狀消失。由此可見(jiàn)，正由于Pacbio的第三代測(cè)序系統(tǒng)得到堿基序列信息的同時(shí)獲得了堿基修飾的信息，我們可同時(shí)對(duì)堿基序列和堿基修飾兩方面測(cè)序信息進(jìn)行分析，可以完整解釋爆發(fā)株的強(qiáng)毒性的基因組機(jī)制，為表觀遺傳學(xué)及疾病基因組學(xué)開(kāi)辟了新的研究思路。目前該論文正在接受評(píng)議之中。 5hmC的檢測(cè) 5hmC非常重要的表觀標(biāo)記，被譽(yù)為第6個(gè)堿基。是

19、細(xì)胞分化和組織發(fā)育中的重要的標(biāo)記。在PacBio測(cè)序過(guò)程中發(fā)現(xiàn)IPD峰值不夠明顯，需要對(duì)其進(jìn)行富集修飾。經(jīng)過(guò)富集和修飾的序列測(cè)序結(jié)果可以顯著檢測(cè)出5hmC，甚至還可以檢測(cè)到單鏈上（另一鏈不含）出現(xiàn)的5hmC（hemi-）。PacBio技術(shù)的獨(dú)到之處在于：不單可以區(qū)分5mC 和5hmC，還能識(shí)別其位于DNA的哪一條鏈上。 3. 超高測(cè)序準(zhǔn)確度及單分子分辨率特定序列的SNP檢測(cè)，稀有突變及其頻率測(cè)定 定向測(cè)序中的SNP檢測(cè) 高精確，可做稀有SNP的檢測(cè)?？梢詸z測(cè)多個(gè)SNP的單倍體型 ，即兩個(gè)臨近的SNP在同一鏈上還是在不同鏈上。由于GC含量不影響單分子測(cè)序，片段讀長(zhǎng)長(zhǎng)，可將靶片段準(zhǔn)確定位到參考序列

20、上，加上單分子測(cè)序的錯(cuò)誤隨機(jī)，沒(méi)有PCR引入的偏向性系統(tǒng)誤差，很容易通過(guò)提高覆蓋度得到高準(zhǔn)確的的數(shù)據(jù)。Broad研究院經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)比得出的結(jié)論，PacBio做SNP檢測(cè)假陽(yáng)性率低，在后續(xù)的SNP驗(yàn)證上是最好的技術(shù)手段，該論文即將在Nature Methods上發(fā)表，可以先觀看以下Broad在今年的AGBT上的相關(guān)報(bào)道視頻： /u/UMTQ2NjcwMTEy/videos 白血病中的突變檢測(cè)實(shí)例 兩個(gè)基因融合突變?cè)斐衫野彼峒っ竿樊a(chǎn)生的失調(diào)。其中一個(gè)基因突變會(huì)產(chǎn)生二級(jí)突變，這種突變會(huì)導(dǎo)致病人對(duì)激酶抑制劑藥物產(chǎn)生抗藥性。激酶區(qū)域突變有兩種不同方式產(chǎn)生，一種是poly

21、colonal突變，另一種是compound 方式產(chǎn)生。不同的突變方式導(dǎo)致對(duì)不同藥物的不同抗藥性。需要有好的方法在臨床上區(qū)分兩種突變產(chǎn)生以個(gè)性化用藥。數(shù)天前（4月15日）在Nature發(fā)布的一篇文章。FLT3過(guò)去一直被認(rèn)為是急性髓細(xì)胞白血?。ˋML）的有效治療靶標(biāo)，可患者接受靶向FLT3新藥治療后若復(fù)發(fā)會(huì)產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致對(duì)FLT3是否真正有效靶標(biāo)產(chǎn)生質(zhì)疑后來(lái)出現(xiàn)很多爭(zhēng)議。 FLT3呈受體結(jié)構(gòu)，有一段激酶區(qū)域，還有一段稱為ITD的重復(fù)序列，ITD上有很多突變，是過(guò)去藥物篩選的靶標(biāo)。這個(gè)研究針對(duì)ITD突變外部的二級(jí)突變與抗藥性的關(guān)系。 研究發(fā)現(xiàn)ITD外部下游區(qū)也有很多二級(jí)突變產(chǎn)生，和抗藥性有關(guān)。二級(jí)突變產(chǎn)生的頻率很低，很難找到，所以不受重視，在很多研究中，沒(méi)有將其與抗藥性關(guān)聯(lián)起來(lái)。長(zhǎng)度超過(guò)1kb。這個(gè)長(zhǎng)度二代測(cè)序是測(cè)不到的。傳統(tǒng)Sanger技術(shù)可以了解突變的空間關(guān)系，但處理起來(lái)非常麻煩，還需要擴(kuò)增，挑克隆。PacBio技術(shù)正好可以很容易解決這個(gè)問(wèn)題。結(jié)果表明，在沒(méi)用藥前，ITD下游二級(jí)突變出現(xiàn)頻率不高，但用藥后二級(jí)突變出現(xiàn)頻率升高。8個(gè)例子中，不同的病人出現(xiàn)突變的頻率和模式是不同的，其中有的突變頻率很低，不到3%。正是由于第三代測(cè)序?qū)﹂L(zhǎng)片段及稀有突變的高靈敏度高準(zhǔn)確度檢測(cè)，重新證