第二章 酶的結(jié)構(gòu)與功能.ppt

1、,第二章,酶的結(jié)構(gòu)與功能,在生物化學(xué)發(fā)展歷史上，酶學(xué)是個(gè)經(jīng)久不衰的主題，一方面，代謝途徑及其調(diào)控機(jī)制的闡明有賴于關(guān)鍵酶的分離、純化及其動(dòng)力學(xué)和調(diào)控的研究，另一方面，許多酶又是研究蛋白質(zhì)、核酸和聚糖結(jié)構(gòu)與功能的重要工具。隨著生物化學(xué)和分子生物學(xué)相關(guān)領(lǐng)域以及其它學(xué)科的發(fā)展，尤其是結(jié)構(gòu)生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、基因工程、蛋白質(zhì)工程和免疫學(xué)的理論和技術(shù)向酶學(xué)的滲透，為酶學(xué)發(fā)展注入新的活力。當(dāng)前，酶學(xué)發(fā)展主要有兩大方向：即分子酶學(xué)和應(yīng)用酶學(xué)。分子酶學(xué)重點(diǎn)研究酶的分子生物學(xué)，酶的分子結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制和調(diào)控，酶的合成、分揀、轉(zhuǎn)運(yùn)和定位等。應(yīng)用酶學(xué)則包括酶法分析、酶工程、組織酶學(xué)、藥理酶學(xué)、食品酶學(xué)等。,2.1.酶促

2、反應(yīng)動(dòng)力學(xué),化學(xué)熱力學(xué)說明反應(yīng)的起點(diǎn)和終點(diǎn)，解決反應(yīng)的方向和限度。動(dòng)力學(xué)研究反應(yīng)速度及各種因素如何定量地影響反應(yīng)速度。酶僅在熱力學(xué)允許的范圍內(nèi)加速反應(yīng)進(jìn)程，或?qū)⒑哪芊磻?yīng)與放能過程相偶聯(lián)。,2.1.1 單底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué),2.1.1.1 MichaelisMenten方程：,2.1.1.2 Km和Vmax的意義,2.1.1.3 催化常數(shù)（Catalytic constant, Kcat）或轉(zhuǎn)換數(shù)（turnover number,TN） 常用Kcat/Km表示酶的催化效率，為酶專一性的定量尺度。,2.1.1.4 作圖法求Km和Vmax,（1）Lineweaver-Burk作圖法： （2）Eadi

3、e-Hofstee作圖法： （3）Hanes-Woolf作圖法： （4）Eisenthal和Cornish-Bowden作圖法,2.1.2 多底物酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué),2.1.2.3 雙底物產(chǎn)物反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)方程,2.1.2.1 Cleland命名與表示法,雙底物雙產(chǎn)物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分類,2.1.2.2,（2）序列隨機(jī)反應(yīng),（1）序列有序反應(yīng),（1）乒乓機(jī)制的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)及作圖,（2）序列機(jī)制的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程及作圖,（3）乒乓反應(yīng),序列有序反應(yīng),序列隨機(jī)反應(yīng),乒乓反應(yīng),乒乓機(jī)制的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)及作圖,序列機(jī)制的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程及作圖,2.2 酶的抑制作用,凡能降低酶催化活性的物質(zhì)均可認(rèn)為是酶的抑制劑。酶在抑

4、制劑作用下活力下降甚至喪失，稱為抑制作用。 （1）抑制程度表示方法： （2）抑制作用的分類： （3）不可逆抑制與可逆抑制的鑒別：,2.2.1 可逆抑制作用,2.2.1.1 競(jìng)爭(zhēng)性抑制,圖2.10 竟?fàn)幮砸种频亩巫鲌D,競(jìng)爭(zhēng)性抑制,競(jìng)爭(zhēng)性抑制 的雙倒數(shù)作圖,氨甲喋呤,四氫葉酸,水合型,水合型瞟,水合型嘌呤核糖核苷,2003年美國(guó)FDA批準(zhǔn)的抗HIV藥是HIV蛋白酶抑制劑,過渡態(tài)（transition state）底物（S）比基態(tài)底物（S）更易與酶結(jié)合并形成產(chǎn)物，因而過渡態(tài)類似物比一般的底物類似物有更強(qiáng)的抑制效應(yīng)。 2.2.1.2 非競(jìng)爭(zhēng)性抑制 2.2.1.3 反競(jìng)爭(zhēng)性抑制 2.2.1.4 混合性

5、抑制 表2.2 幾種同位抑制作用動(dòng)力學(xué)的比較 表2.3 雙底物反應(yīng)中同位可逆抑制劑的抑制類型 2.2.1.5 底物抑制與產(chǎn)物抑制,反競(jìng)爭(zhēng)性抑制,混合性抑制,混合性抑制 的雙倒數(shù)作圖,2.2.2 不可逆抑制作用,2.2.2.1 非專一性不可逆抑制劑：主要有以下幾類 （1）有機(jī)磷化合物 （2）有機(jī)汞、有機(jī)砷化合物 （3）烷基化試劑 （4）青霉素、頭孢霉素 （5）氰化物、硫化物和CO （6）重金屬鹽Ag+、Cu2+、Hg2+、Pb2+等重金屬離子,胰蛋白酶與牛胰胰蛋白酶抑制劑的復(fù)合物,2.2.2.2 專一性不可逆抑制劑,（1）KS型專一性不可逆抑制劑（活性部位定向抑制劑或親和標(biāo)記試劑）：部分結(jié)構(gòu)與底

6、物類似，可直接結(jié)合于活性部位，另一部分則與活性中心某基團(tuán)反應(yīng)，對(duì)其進(jìn)行共價(jià)修飾使E失活，如TPCK對(duì)胰凝乳蛋白酶。 （2）Kcat型專一性不可逆抑制劑（自殺性底物，suicide substrate）：具有類似于底物的結(jié)合和反應(yīng)基團(tuán)，可結(jié)合于酶的活性部位并在其作用之下發(fā)生反應(yīng)；與底物不同的是它還有潛伏的反應(yīng)基團(tuán)，受酶催化之后即被活化，與酶活性中心某基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，使酶喪失活性。,KS型專一性不可逆抑制劑,對(duì)甲苯磺酰L苯丙氨酰氯甲基酮（TPCK）,對(duì)甲苯磺酰L苯丙氨酰氯甲基酮（TPCK）,對(duì)甲苯磺酰L苯丙氨酰氯甲基酮（TPCK）,Kcat型專一性不可逆抑制劑,2.3 酶的作用機(jī)制,酶催化的專一性包

7、括底物結(jié)合專一性和催化作用專一性。前者要求酶選擇與其活性部位的幾何形狀和大小相吻合的底物；后者要求底物具備合適的鍵或基團(tuán)，在ES中與酶的催化基團(tuán)間有足夠大的作用力。底物結(jié)合專一性與KS相關(guān)，而Kcat/Km反映催化專一性。,2.3.1 酶的活性中心,2.3.1.1 活性中心的特點(diǎn)：僅占酶分子總體積的一小部分（通常約12%），催化中心一般由23個(gè)殘基（和輔因子）組成，最常見的殘基如His、Ser、Asp等。結(jié)合中心因酶而異；活性中心的三維結(jié)構(gòu)由其一級(jí)結(jié)構(gòu)決定，與特定的環(huán)境有關(guān)，凡破壞蛋白質(zhì)構(gòu)象的因素（變性）均使酶失活；酶在與底物結(jié)合的過程中相互誘導(dǎo)，使酶的活性中心的幾何形狀和大小與底物相吻合（互

8、補(bǔ)），催化基團(tuán)與底物反應(yīng)基團(tuán)定向靠近；活性中心通常在酶分子表面疏水的裂隙或凹陷中。,溶菌酶的結(jié)構(gòu),溶菌酶多肽鏈上活性中心殘基的位置,2.3.1.2 研究酶活性中心結(jié)構(gòu)的方法,（1）化學(xué)修飾法 非專一性修飾試劑僅用于初篩 差示標(biāo)記法 親和標(biāo)記 （2）動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定可為了解酶活性中心的結(jié)構(gòu)提供有關(guān)信息。 （3）X-射線晶體衍射仍是迄今最主要的研究大分子三維結(jié)構(gòu)的技術(shù)手段。 （4）分子生物學(xué)方法已廣泛用于酶結(jié)構(gòu)的研究。,親和標(biāo)記,乙酰膽堿酯酶,二異丙基氟磷酸,2.3.2 酶的催化機(jī)制：對(duì)酶作用高效性作出貢獻(xiàn)的基元反應(yīng),2.3.2.1 底物的鄰近效應(yīng)（approximation）和定向效應(yīng) 2.3.2

9、.2 廣義酸堿催化 2.3.2.3 共價(jià)催化 2.3.2.4 誘導(dǎo)契合與底物扭曲,鄰近效應(yīng)與定向效應(yīng),ATP,Adenylate Kinase,.Adenylate Kinase.ATP,以,2.3.3 酶促反應(yīng)機(jī)制實(shí)例 以研究得最為深入的胰凝乳蛋白酶為例,胰凝乳蛋白酶的催化三元組,底物與酶結(jié)合時(shí)，疏水側(cè)鏈進(jìn)入酶的底物結(jié)合部位疏水蛋袋,底物與酶結(jié)合時(shí)，肽鏈?zhǔn)?底物與酶結(jié)合時(shí)，大的芳香族側(cè)鏈進(jìn)入酶的底物結(jié)合部位疏水袋內(nèi)，恰好讓敏感肽鍵處于易受攻擊的位置。,活性中心的Ser-195與His-57相互作用，在Ser-195上生成一個(gè)強(qiáng)烈親核的醇鹽離子，隨即對(duì)敏感肽鍵碳原子進(jìn)行親核攻擊，形成正四面體酰

10、基化酶。與此相伴，底物C=O氧形成一個(gè)短命的負(fù)電荷，通過H結(jié)合于氧陰離子洞，使之得以穩(wěn)定。,底物C=O氧上負(fù)電荷的不穩(wěn)定性導(dǎo)致四面體中間物瓦解；重新形成與碳原子間的雙鍵，代替碳與肽鍵氨基間的鍵，使得肽鍵裂解。His-57促使產(chǎn)物1的氨基質(zhì)子化，以利于它從酶上釋放。,通過廣義堿催化，進(jìn)入活性中心的水分子去質(zhì)子化，形成強(qiáng)有力的親核氫氧離子。氫氧離子對(duì)?；傅孽ユI進(jìn)行攻擊， 氧陰離子洞再次獲得一個(gè)負(fù)電荷。,酰基化酶中間物隨即去?；啥虊勖闹虚g物。,短壽命的四面體中間物瓦解，形成第二個(gè)產(chǎn)物，一個(gè)羧酸陰離子，置換出Ser-195。,Asp-102的負(fù)電荷與第二種產(chǎn)物羧基陰離子間的靜電斥力有助于

11、該產(chǎn)物離開酶的活性部位，酶又回到游離狀態(tài)。,酶活性的調(diào)節(jié),2.4 酶活性的調(diào)節(jié),新陳代謝受到精密靈活高效的調(diào)控，調(diào)控作用在不同層次上進(jìn)行，其中最基本的是對(duì)酶的數(shù)量和酶活性的調(diào)控。以下重點(diǎn)介紹酶活性調(diào)節(jié)的分子機(jī)理。 2.4.1 別構(gòu)酶 E.coli天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶（ATCase）的別構(gòu)調(diào)節(jié)效應(yīng)。這種酶分子由6個(gè)催化亞基和6個(gè)調(diào)節(jié)亞基組成（圖2.18）。,E.coli天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶(ATCase),2.4.1.1 協(xié)同效應(yīng)：,S曲線：正協(xié)同81V隨S而加快,a 、僅底物是別構(gòu)調(diào)節(jié)物,雙曲線：負(fù)協(xié)同81V隨S而減慢,b、當(dāng)其他別構(gòu)物參與調(diào)節(jié)時(shí),整體上產(chǎn)生激活、抑制現(xiàn)象,改變了調(diào)節(jié)的敏感區(qū)位置,

12、圖2.20 正、負(fù)協(xié)同別構(gòu)酶與非別構(gòu)酶的動(dòng)力學(xué)曲線比較,2.4.1.2 別構(gòu)酶的一般特性：,2.4.1.3 別構(gòu)酶的調(diào)節(jié),（1）齊變模型（concerted modle）或?qū)ΨQ（symmetry）模型,（2）序變模型,圖2.26 別構(gòu)酶的序變模型,2.4.2 共價(jià)修飾調(diào)節(jié)酶,（1）酶原激活： （2）可逆的共價(jià)修飾：,共價(jià)修飾調(diào)節(jié)酶的級(jí)聯(lián)放大效應(yīng),2.4.4 酶活性的其它調(diào)節(jié)方式,（2）通過與細(xì)胞骨架或細(xì)胞器表面的締合 解離調(diào)節(jié)酶活性 （1）寡聚酶通過聚集 解聚調(diào)節(jié)活性： （3）有些酶的調(diào)節(jié)亞基具有抑制蛋白或改性亞基的功能，或者有接應(yīng)蛋白的功能，催化亞基可逆地與這樣的調(diào)節(jié)亞基結(jié)合對(duì)活性進(jìn)行調(diào)控。

13、,2.4.5 酶活性調(diào)節(jié)實(shí)例,2.4.5.1 天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶,2.4.5.3 E.coli谷酰胺合成酶,2.4.5.4 6-磷酸果糖-1-激酶(6-phosphofructo-1-Kinase, 6PF-1-K)/果糖1，6-二磷酸酶(fructose-1,6-bisphosphatase,Fru-1,6-P2ase),圖 2.31 可逆磷酸化對(duì)6PF-2，6-P2ase活性的調(diào)節(jié) 圖2.32 糖酵解與糖異生途徑的協(xié)調(diào)控制,糖酵解與糖異生途徑的協(xié)調(diào)控制,可逆磷酸化對(duì)6PF-2，6-P2ase活性的調(diào)節(jié),2.4.5.5 Pyruvate Dehydrogenase Complex,原核生物的丙酮酸脫氫酶復(fù)合物