關(guān)于免疫組化封閉液原理的討論.ppt

1、但個(gè)人認(rèn)為并不全面，如果封閉僅僅是填補(bǔ)空隙的話，那封閉僅僅是起到降低背景的作用。如果是這樣的話雜帶的問題怎么解釋呢？還有免疫組化的封閉是怎么個(gè)原理呢？ 個(gè)人覺得從抗原決定簇的角度來說可能會(huì)更好一點(diǎn)?？贵w是識(shí)別抗原決定簇，然后與之結(jié)合，奶粉和BSA起封閉作用主要是通過蛋白起作用的，就是能夠非特異性地將表面的抗原決定簇結(jié)合，這樣特異性的抗體就不會(huì)跟這些非特異性的抗原決定簇結(jié)合，這樣背景就會(huì)降低。 可能有人會(huì)問，那目的蛋白為什么不能被封閉掉？ 因?yàn)榭贵w跟目的蛋白的結(jié)合是非常特異的，結(jié)合能力很強(qiáng)，封閉之后依然能夠結(jié)合。當(dāng)然如果封閉是太長，也能影響抗體的特異性結(jié)合，導(dǎo)致最后顯影信號(hào)變?nèi)酰@就是有時(shí)候封閉

2、時(shí)間長了信號(hào)變?nèi)醯脑?。同樣，通過延長封閉時(shí)間來去除非特性條帶以及免疫組化中延長封閉時(shí)間降低背景都是這么個(gè)原理。,skykiller認(rèn)為，封閉時(shí)的封閉蛋白不僅是吸附到膜上的空白位置（此點(diǎn)與zzz198506相同），而且還會(huì)和膜上已有的蛋白（目標(biāo)蛋白和雜蛋白）產(chǎn)生競爭性的洗脫作用，而不是和膜上的蛋白產(chǎn)生結(jié)合作用。即不是用封閉液封閉雜蛋白的非特異性的抗原決定簇（用抗原決定簇這個(gè)詞不是很妥當(dāng)，但好理解一些），而是將雜蛋白從膜上部分洗脫下來，從而減輕了非特異性的條帶信號(hào)。這種洗脫也會(huì)對目標(biāo)蛋白產(chǎn)生作用，同樣減輕其條帶信號(hào)。 zzz198506的這句話：“當(dāng)然如果封閉是太長，也能影響抗體的特異性結(jié)合，導(dǎo)

3、致最后顯影信號(hào)變?nèi)?，這就是有時(shí)候封閉時(shí)間長了信號(hào)變?nèi)醯脑颉辈荒苡媒Y(jié)合來解釋，但用洗脫就比較好理解。抗體與目標(biāo)抗原的親和結(jié)合常數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于這個(gè)zzz198506戰(zhàn)友假說的非特異性結(jié)合，即使封閉液中的蛋白可能有與目標(biāo)蛋白的非特異性結(jié)合，在抗體孵育過程中也會(huì)完全被替代，而不會(huì)影響到最后的顯影信號(hào)。 用吸附-洗脫假說來看封閉的操作，就能明白為什么封閉液的組成、濃度、時(shí)間等等要素的對WB的影響。封閉液中要有可以和膜產(chǎn)生非特異性吸附的分子量適中的蛋白，太大了可能對鄰近的目標(biāo)蛋白產(chǎn)生位置阻礙，太小了容易從膜上的孔洞里脫落。封閉液的pH，鹽，表面活性劑等一方面影響封閉液中的蛋白與膜的結(jié)合吸附，另一方面還會(huì)對膜

4、上的已有的蛋白產(chǎn)生不同洗脫作用，這也是WB中選用不同封閉液的原因，即為了盡可能多的洗脫雜蛋白，盡量減少對目標(biāo)蛋白的洗脫作用。封閉液的濃度越高，封閉時(shí)間越長，對膜上孔洞的覆蓋越好，由于競爭性的作用，對雜蛋白的洗脫也越好，但對目標(biāo)蛋白的洗脫也越強(qiáng)。也就是說在相同曝光條件下背景更干凈，雜帶更淡，但目標(biāo)條帶也更淡。,樓上說的都很精彩，借你們的文字和理論，我也自己總結(jié)一下，對錯(cuò)與否，懇請賜教。 1、轉(zhuǎn)膜后蛋白以機(jī)械填補(bǔ)（堆積）和吸附的方式結(jié)合于膜上，這種結(jié)合是很牢固的。 2、封閉液中的蛋白可以與膜上的空白位置結(jié)合，同樣以機(jī)械填補(bǔ)（堆積）和吸附覆蓋的方式結(jié)合在膜上，因?yàn)橛小疤钛a(bǔ)”和“覆蓋”蛋白結(jié)合位點(diǎn)以避

5、免一抗的非特異結(jié)合，所以有“封閉”的說法。同樣這兩種作用使封閉液中的蛋白能夠很牢固的結(jié)合在空白位置上。 3、同時(shí)，封閉液中的蛋白與膜上的蛋白（抗原決定簇）進(jìn)行非特異性結(jié)合，說明與目的蛋白也是有結(jié)合的。但這種結(jié)合強(qiáng)度不強(qiáng)，起碼比1或2的結(jié)合方式要弱得多。 4、不排除“封閉液中的蛋白與膜上的蛋白存在一種競爭性洗脫作用，無選擇性”。但應(yīng)該說這種競爭是很微弱的，因?yàn)樵瓉碓谀ど系牡鞍缀湍そY(jié)合得很牢固，這種洗脫作用不至于對膜上蛋白的數(shù)量造成實(shí)質(zhì)性影響。 5、一抗和目的蛋白的結(jié)合是特異性結(jié)合，這種結(jié)合力比較強(qiáng)。 6、結(jié)合能力比較：1253 7、理由： a、抗體洗脫液可以洗脫抗體，卻不能洗脫膜上的蛋白，故25

6、。（另外，洗滌劑如免疫組化的PBS或wetern的TBST無法洗脫2和5、3這三種結(jié)合，只是洗去未結(jié)合一抗。因?yàn)樵诩佣骨坝邢礈?，如果能洗脫的話，二抗就?huì)取代被洗掉的蛋白而與膜或其他蛋白產(chǎn)生非特異結(jié)合。所以，在封閉后也可洗滌也可不洗滌，但不洗會(huì)保險(xiǎn)一點(diǎn)，因?yàn)樵诙挤忾]的情況下，一抗終究會(huì)取代封閉液中的蛋白。） b、1和2有著相同的結(jié)合方式，但1的機(jī)械填補(bǔ)是在電場的作用下完成的，綜合起來認(rèn)為12。 c、一抗和目的蛋白的結(jié)合是特異性的，這種結(jié)合在封閉后進(jìn)行就存在這一抗和封閉液中蛋白對目的蛋白的競爭，但這種競爭很不平衡，因?yàn)樘禺愋越Y(jié)合比非特異性結(jié)合牢固得多（53），也就是說一抗最終肯定取代封閉液中的蛋

7、白結(jié)合在目的蛋白上；但畢竟是存在著競爭，所以一抗的取代不是完全絕對的，還受封閉液的濃度等因素的影響，因此，封閉液的不同會(huì)影響一抗和目的蛋白的結(jié)合率，也就解釋了封閉時(shí)間長短，濃度會(huì)影響目的條帶的現(xiàn)象。雖然這種影響很微弱。 8、最后，結(jié)合的強(qiáng)弱都是相對的，非特異條帶的出現(xiàn)首要考慮一抗的特異性，其他只是輔助因素，只有衡量利弊，才能有合適的實(shí)驗(yàn)方案。,展開引用 leeo2636 wrote: supermaltose說的形象，讓人一目了然。但個(gè)人認(rèn)為并不全面，如果封閉僅僅是填補(bǔ)空隙的話，那封閉僅僅是起到降低背景的作用。如果是這樣的話雜帶的問題怎么解釋呢？還有免疫組化的封閉是怎么個(gè)原理呢？個(gè)人覺得從抗原

8、決定簇的角度來說可能會(huì)更好一點(diǎn)?？贵w是識(shí)別抗原決定簇，然后與之結(jié)合，奶粉和BSA起封閉作用主要是通過蛋白起作用的，就是能夠非特異性地將表面的抗原決定簇結(jié)合，這樣特異性的抗體就不會(huì)跟這些非特異性的抗原決定簇結(jié)合，這樣背景就會(huì)降低。可能有人會(huì)問，那目的蛋白為什么不能被封閉掉？因?yàn)榭贵w跟目的蛋白的結(jié)合是非常特異的，結(jié)合能力很強(qiáng)，封閉之后依然能夠結(jié)合。當(dāng)然如果封閉是太長，也能影響抗體的特異性結(jié)合，導(dǎo)致最后顯影信號(hào)變?nèi)?，這就是有時(shí)候封閉時(shí)間長了信號(hào)變?nèi)醯脑?。同樣，通過延長封閉時(shí)間來去除非特性條帶以及免疫組化中延長封閉時(shí)間降低背景都是這么個(gè)原理。 個(gè)人拙見，不知道說沒說清楚，不對之處歡迎指正 我有個(gè)疑問

9、，既然抗體的結(jié)合是特異性的，其與目的蛋白的結(jié)合是非常特異且結(jié)合能力很強(qiáng)，其辨識(shí)目的蛋白的能力應(yīng)該很強(qiáng)，那特異性的抗體怎么會(huì)與非特異性的抗原決定簇結(jié)合？ . 這里有2種情況 1，IgG本身也是一種蛋白質(zhì)，是蛋白質(zhì)就有疏水作用或者親水基團(tuán)，這樣和別的物質(zhì)就會(huì)發(fā)生一定牢固程度的結(jié)合，當(dāng)然這種結(jié)合總是強(qiáng)不過特意性的“抗原-抗體”結(jié)合。 2，相似表位的問題（半特異結(jié)合），一個(gè)表位一般是有4-6個(gè)氨基酸組成的，一個(gè)抗原或者說一個(gè)蛋白質(zhì)本身可以組合出很多種表位（包括線形和空間兩種表位）。當(dāng)你的抗體的特異性不是非常好（識(shí)別的表位屬于一些類似蛋白的同源性或者保守區(qū)），或者一些蛋白有3-4個(gè)氨基酸序列和你抗體所識(shí)

10、別的表位序列相似時(shí)（轉(zhuǎn)膜的蛋白種類越多，發(fā)生這種撞衫情況的幾率也越高），抗體也是有一定的親和性。這個(gè)時(shí)候就是考驗(yàn)一個(gè)抗體表位特異性的時(shí)候了，高質(zhì)量的單抗，這方面應(yīng)該是盡量避免發(fā)生的，所以做QC的時(shí)候需要用全細(xì)胞裂解液作為轉(zhuǎn)膜的蛋白，來測試細(xì)胞中是否有雜蛋白能“非特異”或者“半特異”結(jié)合。,給大家講一個(gè)故事： 有一面墻，墻上布滿膠水，膠水很黏。 有一個(gè)人，開著一輛車，從垃圾回收站把一堆廢銅爛鐵拉到墻邊，并粘在上邊。 有一群孩子很頑皮，把好多的破爛東西往墻上粘，有塑料、木頭，甚至少量鐵屑，最后都粘滿了。 車主想看看自己撿到的東西里有多少鐵。 他用水龍頭往下沖，結(jié)果只沖下少量泥土。 他想了個(gè)好辦法，

11、將一些彩色的磁石粉撒到了墻上，然后又用水沖 他看到了那些彩色的東西在一個(gè)地方閃閃發(fā)光，很特異 首先，nc膜靠疏水性結(jié)合蛋白，力量大；pvdf膜也靠疏水性但它還帶正電荷，所以和帶sds的蛋白正好結(jié)合，力量更大。大家所說的堵上窟窿雖然很形象，但是實(shí)質(zhì)上不是靠窟窿，而是靠蛋白與膜的結(jié)合力，電轉(zhuǎn)只是將蛋白送過去，是一輛車，而不是把蛋白訂到膜上的錘子。 所以無論是電轉(zhuǎn)上去的蛋白條帶，還是滴加上去的封閉液，作用力相差不大，封閉后的結(jié)果就是膜上布滿蛋白！而且結(jié)合力都很強(qiáng)！ 有少量的封閉劑會(huì)和我們的目的蛋白發(fā)生一些作用力，有可能堵住抗原決定簇，但這種力量很小，所以我們用低濃度tween20去洗，其實(shí)tween洗的就是他們！如果你用tween80去洗，結(jié)果幾乎就是一張新膜 一抗也是蛋白，但來晚了，膜上沒有位子了，只有一些蛋白上有它的抗原決定簇可以結(jié)合，所以它就被特異了！一些不太合適的決定簇也可能被結(jié)合，但又可以用tween20了 就這樣，一抗特異了,在不斷的思考過程當(dāng)中，覺得無論 封閉（膜與封閉蛋白或非蛋白）、 特異性的抗體結(jié)合（抗原抗體，一抗二抗）、 非特異性的蛋白相互作用（雜帶與封閉蛋白，雜帶與一抗二抗，封閉蛋白與一抗二抗）、 洗脫液中各種成分的