第三章-蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及分離分析.ppt

1、第三章蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及分離分析,蛋白質(zhì)的理化性質(zhì),一、兩性性質(zhì)及等電點 二、膠體性質(zhì) 三、變性與復性作用 四、蛋白質(zhì)的沉淀作用 五、沉降作用 六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng) 七、蛋白質(zhì)的紫外吸收性質(zhì),一、蛋白質(zhì)的兩性解離與等電點,蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的側(cè)鏈上存在游離的氨基和羧基，因此蛋白質(zhì)與氨基酸一樣具有兩性解離性質(zhì)，具有特定的等電點（pI）。 溶液pHpI時，蛋白質(zhì)所帶正負電荷相等； pHpI時，蛋白質(zhì)帶凈負電荷； pHpI時，蛋白質(zhì)帶凈正電荷。,等電點時特點： （1）凈電荷為零 （2）一定離子強度的緩沖液 （3）多數(shù)蛋白質(zhì)在水中等電點偏酸 堿性AA/酸性AA比例 等電點 胃蛋白酶 0.2 1.0

2、 血紅蛋白 1.7 6.7 細胞色素C 2.9 10.7 菊糖酶 0.34 8.2 （4）在等電點時蛋白質(zhì)的導電性、溶解度、黏度及滲透壓都最小。 等電沉淀和蛋白電泳： 遷移率與凈電荷量、分子大小、分子形狀等有關(guān),帶電粒子在電場中移動的現(xiàn)象稱為電泳（electrophoresis） 。,電泳（ electrophoresis）,蛋白質(zhì)分子在一定pH的溶液中可帶凈的負電荷或正電荷，故可在電場中發(fā)生移動。 不同蛋白質(zhì)分子所帶電荷量不同，且分子大小也不同，故在電場中的移動速度也不同，據(jù)此可互相分離。,凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠（蛋白質(zhì)和多核苷酸） 瓊脂糖凝膠（核酸）,單體：丙烯酰胺（Acrylamide

3、），甲叉雙丙烯酰胺(N,N-Methylenebisacrylamide) 增速劑：TEMED（N,N,N,N-四甲基乙二胺） 引發(fā)劑：過硫酸銨、過硫酸鉀、核黃素 特性：機械性能、彈性、透明度、粘著度、孔徑大小,分子篩效應(yīng),聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE） 不連續(xù)：濃縮膠和分離膠 電泳遷移率決定于所帶的凈電荷以及分子大小和形狀等因素。,濃縮膠,分離膠,巰基乙醇：打開二硫鍵。 SDS：變性劑，破裂蛋白質(zhì)分子中的氫鍵和疏水作用。 SDS以其氫鍵與蛋白質(zhì)分子的側(cè)鏈結(jié)合成復合體。 帶有很多負電荷遠遠超過蛋白質(zhì)分子原有電荷 改變了蛋白質(zhì)單體分子的構(gòu)象：近似雪茄煙形的長橢圓棒，短軸長度相同，長軸長度隨蛋白質(zhì)

4、的相對分子質(zhì)量成正比例變化。,遷移率主要取決于蛋白質(zhì)相對分子量,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（ SDS- PAGE）,遷移率,等電聚焦電泳 高分辨率的蛋白質(zhì)分離技術(shù)。 在具有pH梯度的介質(zhì)中進行的。在外電場的作用下各種蛋白質(zhì)將移向并聚焦（停留）在等于其等電點的pH梯度處，并形成一個很窄的區(qū)帶。 特別適用于同功酶的鑒定。只要它們的pI有0.02pH單位的差別就能分開。,等電聚焦電泳,電泳時，每種蛋白遷移至 與它的pI相一致的pH處,加入 蛋白樣品,電場作用下在凝膠中建 立穩(wěn)定的一個pH梯度,（等）電聚焦（IEF）：,等電聚焦電泳 + SDS- PAGE 第一向進行等電聚焦，蛋白質(zhì)沿pH梯度分離至各

5、自的等電點； 再沿垂直的方向進行分子量的分離.,雙向電泳,兩性電解質(zhì)溶液,等電聚焦電泳,SDS- PAGE,二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì),蛋白質(zhì)分子的顆粒直徑已達1100nm，處于膠體顆粒的范圍。（親水膠體） 蛋白質(zhì)具有膠體溶液的性質(zhì)：布朗運動、丁道爾現(xiàn)象、不能透過半透膜、具有吸附力等。,1、蛋白質(zhì)具有膠體溶液的性質(zhì),水化膜：通過氫鍵與水結(jié)合 表面電荷：在非等電點狀態(tài)下，蛋白質(zhì)分子表面的親水基團帶電荷，與極性水分子中的異性電荷吸引形成雙電層，帶同性電荷蛋白質(zhì)分子互相排斥。,2、穩(wěn)定蛋白質(zhì)親水溶膠的兩個重要因素：,蛋白質(zhì)顆粒的表面電荷和水化膜,3.蛋白質(zhì)凝膠 凝膠作用： 蛋白質(zhì)顆粒周圍的水膜是不均勻,使

6、它們以一定的部位結(jié)合形成長鏈。這些長鏈又彼此結(jié)合成為復雜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠體。,3.蛋白質(zhì)凝膠 凝膠具有脹潤作用： 分類：（1）可逆性凝膠 （2）不可逆性凝膠 部分破壞水化膜、適當加熱和遠離等電點 4.蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)的應(yīng)用 滲析（透析） 超濾,透析（dialysis）,三、蛋白質(zhì)的變性、復性與凝固作用,在某些物理或化學因素的作用下，蛋白質(zhì)嚴格的空間結(jié)構(gòu)被破壞（肽鍵不斷裂，一級結(jié)構(gòu)不變），從而引起蛋白質(zhì)若干理化性質(zhì)和生物學性質(zhì)的改變，稱為蛋白質(zhì)的變性(denaturation)。,（denaturation of protein）,1、變性理論 蛋白質(zhì)的變性就是天然蛋白質(zhì)分子中肽鏈的高度規(guī)則的緊密

7、排列方式因氫鍵及其他次級鍵的破壞而變成不規(guī)則的松散排列方式。 2、引起蛋白質(zhì)變性的因素： 物理因素： 高溫、高壓、紫外線、電離輻射、超聲波、機械攪拌 化學因素： 強酸、強堿、有機溶劑、尿素、胍、重金屬鹽等。,變性的因素及作用機制, 物理性質(zhì)： 旋光性改變，溶解度下降，結(jié)晶能力下降，沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等； 化學性質(zhì)： 官能團反應(yīng)性增加，呈色反應(yīng)增強，易被蛋白酶水解。 生物學性質(zhì)： 原有生物學活性喪失，抗原性改變。,變性蛋白質(zhì)的性質(zhì)改變,蛋白質(zhì)變性的可逆性復性： 某些蛋白質(zhì)變性后可以在一定的條件下重新形成原來的空間結(jié)構(gòu)，并恢復原來部分理化特性和生物學活性，這個過程稱為蛋白質(zhì)的復性（

8、renaturation）。,蛋白質(zhì)變性的可逆性與復性,蛋白質(zhì)在體外變性后，絕大多數(shù)情況下不能復性； 如變性程度淺，蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象未被嚴重破壞；或蛋 白質(zhì)具有特殊的分子結(jié)構(gòu),并經(jīng)特殊處理則可以復性。,核糖核酸酶的變性與復性,天然構(gòu)象,蛋白質(zhì)的熱變性與凝固作用,蛋白質(zhì)的凝固作用 天然蛋白質(zhì)變性后，變性蛋白質(zhì)分子互相凝集或相互穿插纏繞在一起的現(xiàn)象成為蛋白質(zhì)的凝固（coagulation） 。,凝固作用分兩個階段： 首先是變性； 其次失去規(guī)律性的肽鏈聚集纏繞在一起而凝固或結(jié)絮;,蛋白質(zhì)變性的應(yīng)用,理論上： 研究蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能,分子量測定,亞單位拆分； 生產(chǎn)生活中有利的一面： 食品加工，消毒滅

9、菌等； 非蛋白生物物質(zhì)提取純化，終止酶促反應(yīng)； 生產(chǎn)生活中不利的一面： 活性蛋白制品（酶、抗體）的分離提取和保存；,外加一些因素去除蛋白質(zhì)膠體的穩(wěn)定因素后，使蛋白質(zhì)分子相互聚集而從溶液中析出的現(xiàn)象稱為沉淀（precipitation）。,（precipitation of protein）,變性后的蛋白質(zhì)由于疏水基團的暴露而易于沉淀，但沉淀的蛋白質(zhì)不一定都是變性后的蛋白質(zhì)。,四、蛋白質(zhì)的沉淀作用,2.沉淀種類：可逆與不可逆,四、蛋白質(zhì)的沉淀作用,3.沉淀方法： 沉淀后蛋白質(zhì)仍能保持生物活性的沉淀方法, 鹽析法 有機溶劑沉淀法 重金屬鹽沉淀法 生物堿試劑和某些酸類沉淀法 加熱變性沉淀法,鹽析法,

10、鹽析法向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽（硫酸胺、硫酸鈉或氯化鈉等），使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀。鹽析沉淀一般不引起蛋白質(zhì)變性。當除去鹽后，復可溶解。,有機溶劑沉淀法,向蛋白質(zhì)溶液中加入一定量的極性有機溶劑（甲醇、乙醇或丙酮等），因引起蛋白質(zhì)脫去水化層以及降低介電常數(shù)而增加帶電質(zhì)點間的相互作用，致使蛋白質(zhì)顆粒容易凝集而沉淀。有機溶劑沉淀法，如果控制在低溫下操作并且盡量縮短處理的時間則可使變性速度減慢。,重金屬鹽沉淀法,當溶液pH大于等電點時，蛋白質(zhì)顆粒帶負電荷，這樣它就容易與重金屬離子結(jié)合成不溶性鹽而沉淀。誤服重金屬鹽的病人可口服大量牛乳或豆?jié){等蛋白質(zhì)進行解救就是因為它能和重金屬離子形成不溶性鹽

11、，然后再服用催吐劑排出體外。重金屬鹽常能使蛋白質(zhì)變性，這可能是因為重金屬鹽水解生成酸或堿的緣故。,生物堿試劑和某些酸類沉淀法,生物堿試劑是指能引起生物堿沉淀的一類試劑，如驟酸也稱單寧酸苦味酸即2，4，6-三硝基酚，鎢酸和碘化鉀等。 某些酸類指的是三氯醋酸，磺基水楊酸和硝酸等。當溶液pH小于等電點時，蛋白質(zhì)顆粒帶正電荷，容易與生物堿試劑和酸類的酸根負離子發(fā)生反應(yīng)生成不溶性鹽而沉淀。這類沉淀反應(yīng)經(jīng)常被臨床檢驗部門用來除去體液中干擾測定的蛋白質(zhì)。,加熱變性沉淀法,幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固。少量鹽類促進蛋白質(zhì)加熱凝固。當?shù)鞍踪|(zhì)處于等電點時，加熱凝固最完全和最迅速。加熱變性引起蛋白質(zhì)凝固沉淀的

12、原因可能是由于熱變性是蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)解體，疏水基外露，因而破壞了水化層，同時由于蛋白質(zhì)處于等電點也破壞了帶電狀態(tài)。我國很早就創(chuàng)造了將大豆蛋白質(zhì)的濃溶液加熱并點入少量鹽鹵（含MgCl2 )的制豆腐的方法，這是成功的應(yīng)用加熱變性沉淀蛋白質(zhì)的一個例子。,1、沉降概念： 蛋白質(zhì)溶液經(jīng)高速離心分離時，由于比重關(guān)系，蛋白質(zhì)分子趨于下沉，離心管底部的蛋白質(zhì)濃度增高。 2、沉降速率： 在離心時，蛋白質(zhì)分子在單位時間t（以秒計）內(nèi)下沉的距離x（以cm計）。以v表示。 v= dx/dt,五、蛋白質(zhì)的沉降作用,沉降作用,3、沉降常數(shù)（沉降系數(shù)，S） 單位引力場沉降分子下沉的速率。 S= v /2x v：沉降速率（d

13、x/dt）可以從實驗測得。 ：離心機轉(zhuǎn)子每秒鐘的角速度，以弧度/秒計。（即2 轉(zhuǎn)子每秒鐘的轉(zhuǎn)速） x：蛋白質(zhì)界面中點與轉(zhuǎn)子中心之間的距離（以cm計）。,Svedberg單位的定義：,單位引力場沉降分子下沉的速率。 取 1 10-13秒為一個Svedberg單位。 例： 牛血清清蛋白的沉降常數(shù)為:4.410-13 用Svedberg單位則為: 4.4 S 原核細胞核糖體的沉降常數(shù)為:7010-13 用Svedberg單位則為: 70 S,六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng),1. 雙縮脲反應(yīng) 2. 茚三酮反應(yīng) 3. 考馬斯亮藍G250 4. 福林酚試劑反應(yīng) 5. 黃色反應(yīng)-芳香族氨基酸的特有反應(yīng) 6. 米倫氏反

14、應(yīng)酪氨酸的特有反應(yīng) 7. 乙醛酸反應(yīng)色氨酸的特有反應(yīng) 8. 坂口反應(yīng)精氨酸特有的反應(yīng),六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng),1. 雙縮脲反應(yīng),兩分子雙縮脲與堿性硫酸銅作用，生成粉紅色復合物 含有兩個或兩個以上肽鍵的化合物，能發(fā)生同樣反應(yīng) 肽鍵的反應(yīng)，肽鍵越多顏色越深，粉紅，紫紅，藍紫 受蛋白質(zhì)特異性影響小 蛋白質(zhì)定量測定；測定蛋白質(zhì)水解程度,六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng),2. 茚三酮反應(yīng) 靈敏度差。 3.考馬斯亮藍G-250 本身為棕色，與蛋白質(zhì)反應(yīng)呈藍色 與蛋白的親和力強，靈敏度高 1-1000微克/毫升,六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng),4. 福林酚試劑反應(yīng) 酪氨酸、色氨酸的反應(yīng)（還原反應(yīng)） 福林試劑：磷鉬酸-磷鎢酸 與雙縮

15、脲法結(jié)合-Lowry法 在堿性條件下，蛋白質(zhì)與硫酸銅發(fā)生反應(yīng) 蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物，將福林試劑還原，產(chǎn)生磷鉬藍和磷鎢藍混合物 靈敏度提高100倍,六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng),5. 黃色反應(yīng)-芳香族氨基酸的特有反應(yīng) 濃硝酸與酪氨酸、色氨酸的反應(yīng) 生成黃色化合物 指甲、皮膚、毛發(fā),6. 米倫氏反應(yīng)酪氨酸的特有反應(yīng) 酪氨酸的顯色反應(yīng)（酚羥基反應(yīng)） 米倫試劑為硝酸、亞硝酸、硝酸汞、亞硝酸汞的混合物 蛋白溶液中，加入米倫試劑，產(chǎn)生白色沉淀，加熱后變成紅色,六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng),7. 乙醛酸反應(yīng)色氨酸的特有反應(yīng) 在蛋白質(zhì)溶液中加入HCOCOOH，將濃硫酸沿管壁緩慢加入，不使相混，在液面交界處，即有紫色環(huán)形成 色氨酸

16、的反應(yīng)（吲哚環(huán)的反應(yīng)） 鑒定蛋白質(zhì)中是否含有色氨酸 明膠中不含色氨酸,六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng),8. 坂口反應(yīng)精氨酸特有的反應(yīng) 精氨酸的反應(yīng)（胍基的反應(yīng)） 精氨酸與-萘酚在堿性次氯酸鈉（或次溴酸鈉）溶液中發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生紅色產(chǎn)物 鑒定蛋白質(zhì)中是否含有精氨酸 定量測定精氨酸,蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng),七、蛋白質(zhì)的紫外吸收性質(zhì),大部分蛋白質(zhì)均含有帶芳香環(huán)的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。 這三種氨基酸在280nm 附近有最大吸收。因此，大多數(shù)蛋白質(zhì)在280nm 附近顯示強的吸收?？梢詫Φ鞍踪|(zhì)進行定性和定量檢測。 蛋白質(zhì)濃度（mg/ml） =1.45A2800.74A260,蛋白質(zhì)的分離純化,蛋白質(zhì)的提取、分離純化技術(shù)

17、路線,細胞破碎,蛋白質(zhì)提取,蛋白質(zhì)分離純化,濃縮,貯存,動物、植物或微生物細胞,發(fā)酵液,離心分離，過濾分離，沉淀分離，層析分離，電泳分離，萃取分離，結(jié)晶分離等。,粗分級分離,預處理,細分級分離,成品加工,細胞破碎 許多酶存在于細胞內(nèi)。為了提取這些胞內(nèi)酶，首先需要對細胞進行破碎處理。 1）機械破碎 2）物理破碎 3）化學破碎 4）酶解破碎,JY92-II D超聲波 細胞粉碎機,細胞破碎珠,高壓細胞破碎機,DY89-I型 電動玻璃勻漿機,預處理,機械破碎,搗碎法 研磨法 勻漿法,物理破碎,溫度差破碎法 壓力差破碎法 超聲波破碎法,化學破碎,有機溶劑： 甲苯、丙酮 丁醇、氯仿 表面活性劑： Trit

18、on、Tween,酶促破碎,自溶法 外加酶制劑法,通過機械運動產(chǎn)生的剪切力，使組織、細胞破碎。,通過各種物理因素的作用，使組織、細胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細胞破碎。,通過各種化學試劑對細胞膜的作用，而使細胞破碎,通過細胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達到細胞破碎,細胞破碎方法及其原理,細胞的破碎,機械法,勻漿：破碎機體軟組織最常用方法之一,組織搗碎：注意維持低溫環(huán)境,研磨：破碎單一細胞的有效方法，主要用于細菌、酵母等的破碎,物理法,超聲法：輸入高能超聲波可以破碎細胞，破碎效率取決于聲頻、聲能、處理時間、細胞濃度及細胞類型等,在處理少量樣品時操作簡便、效率高，液量損失

19、少，適于實驗室使用,注意: 超聲波產(chǎn)生的化學自由基團能使敏感的活性物質(zhì)變性失活，另外噪聲也比較大,反復凍融法：由于在此過程中易使活性蛋白失活，故適用于提取非常穩(wěn)定的蛋白質(zhì),冷熱交替法：絕大多數(shù)細胞被破壞，一般適用于從細菌或病毒中提取蛋白質(zhì),低滲裂解：是指無胞壁細胞在低滲溶液中通過滲透張力作用裂解的方法，常用于紅細胞的裂解,化學法,有機溶劑法：有些有機溶劑(如苯、甲苯等)可以改變細胞壁或膜的通透性，使內(nèi)含物有選擇性的滲透出來,表面活性劑(surfactant)：常用的有十二烷基磺酸鈉、TritonX-100、去氧膽酸鈉等,酶解法：必須根據(jù)細胞的結(jié)構(gòu)和化學組成選擇適當?shù)拿?總之，選擇合適的細胞破碎

20、方法需要考慮下列因素：細胞的數(shù)量，所需要酶對破碎條件（溫度、化學試劑等）的敏感性，要達到的破碎程度及破碎所必須的速度等。 一般動物組織和細胞可用電動搗碎機、勻漿器或用超聲波處理破碎；植物組織和細胞，由于具有纖維素、半纖維素和果膠等物質(zhì)組成的細胞壁，一般需要與石英沙或玻璃粉和適當?shù)奶崛∫阂黄鹧心サ姆椒ㄆ扑椋蛴美w維素酶處理也可；破碎細菌的常用方法有超聲波震蕩、與砂研磨、高壓擠壓或溶菌酶處理等。組織和細胞破碎后，即可選擇適當?shù)木彌_液把所需要的酶提取出來，細胞碎片等不溶物用離心或過濾等方法除去。,蛋白質(zhì)分離純化的基本原則,1.防止蛋白質(zhì)變性失效 （1）一般在低溫下進行 （2）控制pH不要過酸、過堿

21、（3）盡量減少泡沫 （4）防止重金屬、有機溶劑引起蛋白質(zhì)變性，防止微生物污染和蛋白酶水解。 2.選擇有效的純化方式 （1）在不破壞待純化蛋白質(zhì)酶的限度內(nèi)，使用各種“激烈” 手段。 （2）使用親和劑進行純化。 3.蛋白質(zhì)酶活性測定貫穿純化過程始終。,一、分離純化的基本方法,1、鹽析與等電點沉淀-根據(jù)溶解度不同分離 2、層析法 離子交換層析法-根據(jù)電荷不同分離 凝膠過濾法-根據(jù)分子量、分子形狀不同分離 親和層析-根據(jù)特異性親和力不同分離 3、梯度離心法,1.鹽析和等電點沉淀 鹽析法：中性鹽分級沉淀法，常用的鹽為硫酸銨。不同的蛋白質(zhì)由于所帶的電荷和水化程度不同，鹽析時所需的鹽的濃度也不相同，因而可以

22、將不同的蛋白質(zhì)加以分離。 等電點沉淀法：凈電荷為零，分子之間的靜電排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。該法適用于在等電點pH穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。 有機溶劑沉淀法：甲醇、乙醇、丙酮等（保持低溫），破壞蛋白質(zhì)的水化層，使蛋白質(zhì)的溶解度降低而沉淀。,2、層析法,層析技術(shù)，亦稱色譜技術(shù)， 是利用混合物中各組分的物理化學性質(zhì)(分子的形狀和大小、分子極性、吸附力、 分子親和力、分配系數(shù)等)的不同，使各組分以不同程度分布在固定相和流動相中，當流動相流過固定相時，各組分以不同的速度移動，而達到分離的技術(shù)。 層析技術(shù)操作簡便，樣品可多可少，既可用于實驗室的研究工作，又可用于工業(yè)生產(chǎn)， 還可與其他分析儀器配合，組成各種自

23、動分析儀器。,層析技術(shù)的分類 (1) 按流動相的狀態(tài)分類：用液體作為流動相的稱為液相層析，或稱液相色譜；以氣體作為流動相的稱為氣相層析，或稱氣相色譜。 (2) 按固定相的使用形式分類：可分為柱層析(固定相填裝在玻璃或不銹鋼管中構(gòu)成層析柱) 、紙層析、薄層層析、薄膜層析等。 (3) 按分離過程所主要依據(jù)的物理化學原理分類：可分為吸附層析、分配層析、離子交換層析、分子排阻層析、親和層析等。,層析分離方法,（1）吸附層析,吸附層析是利用吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中的各組分分離的方法。 吸附層析在各種層析技術(shù)中應(yīng)用最早，由于吸附劑來源豐富，價格低廉，易再生，裝置簡單 ，又具有一定的分辯率等

24、優(yōu)點，故至今仍廣泛使用。,凡能夠?qū)⑵渌镔|(zhì)聚集到自己表面上的物質(zhì)，都稱為吸附劑。能聚集于吸附劑表面的物質(zhì)稱為被吸附物。在吸附層析中應(yīng)用的吸附劑一般為固體。 固體內(nèi)部的分子所受的分子間的作用力是對稱的，而固體表面的分子所受的力是不對稱的。 向內(nèi)的一面受內(nèi)部分子的作用力較大，而表面向外的一面所受的作用力較小，因而當氣體分子或溶液中溶質(zhì)分子在運動過程中碰到固體表面時就會被吸引而停留在固體表面上。 吸附劑與被吸附物分子之間的相互作用是由可逆的范德華力所引起的，故在一定的條件下，被吸附物可以離開吸附劑表面，這稱為解吸作用。 吸附層析就是通過連續(xù)的吸附和解吸附完成的。,吸附柱層析,將吸附劑填裝在玻璃或不銹

25、鋼管中，構(gòu)成層析柱，層析時欲分離的樣品自柱頂加入，當樣品溶液全部流入吸附層析柱后，再加入溶劑沖洗。沖洗的過程稱為洗脫，加入的溶劑稱為洗脫劑。,在洗脫過程中，柱內(nèi)不斷地發(fā)生解吸、吸附，再解吸、再吸附的過程。即被吸附的物質(zhì)被溶劑解吸而隨溶劑向下移動，又遇到新的吸附劑顆粒被再吸附，后面流下的溶劑又再解吸而使其下移動。經(jīng)過一段時間以后，該物質(zhì)會向下移動一定距離。此距離的長短與吸附劑對該物質(zhì)的吸附力以及溶劑對該物質(zhì)的解吸(溶解)能力有關(guān)。不同的物質(zhì)由于吸附力和解吸力不同 ，移動速度也不同。吸附力弱而解吸力強的物質(zhì)，移動速度就較快。,經(jīng)過適當?shù)臅r間以后，不同的物質(zhì)各自形成區(qū)帶，如果被分離的是有色物質(zhì)的話，

26、就可以清楚地看到色帶(色層)。 如果被吸附的物質(zhì)沒有顏色，可用適當?shù)娘@色劑或紫外光觀察定位，也可用溶劑將被吸附物從吸附柱洗脫出來,再用適當?shù)娘@色劑或紫外光檢測，以洗脫液體積對被洗脫物質(zhì)濃度作圖，可得到洗脫曲線。,理想的洗脫曲線如圖所示。圖中的A峰和B峰均呈對稱形，二者沒有重疊，這表明樣品液中的組分已完全分開。層析峰的面積(FEG)、峰高(BE)和半峰高寬度(HI)等參數(shù)是定性、定量洗脫物的依據(jù)。,A,B,（2）分配層析,分配層析是利用各組分的分配系數(shù)不同而予以分離的方法。 分配系數(shù)(K)是指一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中溶解達到平衡時，該溶質(zhì)在兩相溶劑中的濃度比值： K=固定相中溶質(zhì)的濃度/流

27、動相中溶質(zhì)的濃度 分配系數(shù)與溶劑和溶質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)，同時受溫度、壓力的影響。所以不同物質(zhì)的分配系數(shù)不同。而在恒溫恒壓條件下，某物質(zhì)在確定的層析系統(tǒng)中的分配系數(shù)為一常數(shù)。,在分配層析中，通常用多孔性固體支持物如濾紙、硅膠等吸著一種溶劑作為固定相，另一種與固定相溶劑互不相溶的溶劑沿固定相流動構(gòu)成流動相，某溶質(zhì)在流動相的帶動下流經(jīng)固定相時，會在兩相間進行連續(xù)的動態(tài)分配。當樣品中含有多種分配系數(shù)各不相同的組分時，分配系數(shù)越小的組分，隨流動相遷移的越快。兩個組分的分配系數(shù)差別越大，在兩相中分配的 次數(shù)越多，越容易被徹底分離。 紙層析屬于典型的分配層析，且系統(tǒng)簡單，使用方便，在生物化學的發(fā)展中發(fā)揮過極其重要

28、的作用。,此外，將硅膠、硅藻土等鋪在玻璃或金屬板上進行層析可構(gòu)成薄層層析系統(tǒng)； 可做吸附、離子交換等層析；在硅藻土上吸附或化學鍵合一定的溶劑，裝到層析柱上，以氣體為流動相可構(gòu)成氣液分配層析，即氣相色譜系統(tǒng)； 在硅膠等固體材料上吸附或化學鍵合一定的溶劑，裝到層析柱中，用一定的洗脫劑洗脫， 可構(gòu)成液液分配層析，這種系統(tǒng)在高效液相色譜中應(yīng)用普遍。,紙層析,原理 濾紙一般能吸收22%-25%的水，其中6%-7%的水是以氫鍵與濾紙纖維上的羥基結(jié)合，一般情況下較難脫去。紙層析實際上是以濾紙纖維的結(jié)合水為固定相，而以有機溶劑(與水不相混溶或部分混溶)作為流動相。展開時，有機溶劑在濾紙上流動，樣品中各物質(zhì)在兩

29、相之間不斷地進行分配。由于各物質(zhì)有不同的分配系數(shù)，移動速度因此不同，從而達到分離的目的。,溶質(zhì)在濾紙上移動的速率可用Rf值表示： Rf= a/ b 式中a：溶質(zhì)斑點中心的移動距離 b：溶劑前沿移動的距離 Rf值決定于被分離物質(zhì)在兩相間的分配系數(shù)以及兩相間的體積比。由于在同一實驗條件下，兩相體積比是一常數(shù)，所以Rf值決定于分配系數(shù)。不同物質(zhì)的分配系數(shù)不同，Rf值也不相同，由此可以根據(jù)Rf值的大小對物質(zhì)進行定性分析。, 影響Rf值的主要因素,a.物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和極性 物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和分子極性是影響Rf值的主要因素。極性較大的物質(zhì)，在水中的溶解度較大，其Rf值就較小，反之亦然。 b.濾紙 不同濾紙的厚薄程度

30、和纖維松緊度各不相同，因此結(jié)合的水量不一樣，兩相的體積比也就不同。所以同一種物質(zhì)在不同型號的濾紙上進行層析時，所得到的Rf值也不相同。 層析濾紙由高純度的棉花制成。要求質(zhì)地均一，厚薄一致，纖維松緊度適中，具有一定的機械強度，并具有一定的純度。國產(chǎn)新華濾紙、日本東洋濾紙等均經(jīng)常被采用。,c.層析所用的溶劑 同一物質(zhì)在不同的溶劑系統(tǒng)中進行層析時，Rf值不同。所以溶劑的配制和使用必須嚴格，才能使Rf值的重現(xiàn)性好。在好的溶劑系統(tǒng)中被分離物質(zhì)的Rf值應(yīng)在0.05-0.85之間，樣品中被分離組分的Rf之差最好大于0.05。,d.pH值 溶劑和樣品的pH值會影響物質(zhì)的解離，從而影響物質(zhì)的極性和溶解度，使Rf

31、值改變。溶劑的酸堿度增大則流動相的含水量增高，使極性物質(zhì)的Rf值增加；反之則降低。 為了避免或減少pH值對Rf值的影響，可將濾紙和溶劑用緩沖溶液處理，使之保持一定的pH值，通過調(diào)節(jié)溶劑或樣品溶液的pH值，使pH值保持恒定。,e.溫度 溫度能影響物質(zhì)在兩相中的溶解度，即影響分配系數(shù)；也影響濾紙纖維的水合作用，即影響固定相的體積；同時在多元溶劑系統(tǒng)中，溫度顯著地影響溶劑系統(tǒng)的含水量，即影響流動相的組分比例。所以溫度的改變使Rf值變化很大，為此，層析必須在恒溫條件下進行。,f.展開方式 同一物質(zhì)在其他層析條件完全相同的情況下，用不同的展開方式進行層析時，所得到的Rf 值不相同。用下行法展開時，Rf值

32、較大；用上行法展開時，Rf值較小 g.樣品溶液中雜質(zhì) 樣品溶液中存在雜質(zhì)時，有時對Rf值有所影響。例如：氯化鈉的存在會影響氨基酸的Rf 值。,紙層析（Filter-paper chromatography）,薄層層析（Thin-layer chromatography）,柱層析,（4）凝膠層析 凝膠層析，又稱為凝膠過濾、分子排阻層析或分子篩層析。是以各種凝膠為固定相，利用流動相中所含各物質(zhì)的相對分子質(zhì)量不同而達到物質(zhì)分離的一種層析技術(shù)。 其設(shè)備簡單，操作方便，不需要再生處理即可反復使用，適用于不同相對分子質(zhì)量的各種物質(zhì)的分離，已廣泛地用于生物化學、生物工程和工業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域。,基本原理 當含有

33、各種組分的樣品流經(jīng)凝膠層析柱時，大分子物質(zhì)由于分子直徑大，不易進入凝膠顆粒的微孔，沿凝膠顆粒的間隙以較快的速度流過凝膠柱。而小分子物質(zhì)能夠進入凝膠顆粒的微孔中，向下移動的速度較慢，（分子篩效應(yīng)）從而使樣品中各組分按相對分子質(zhì)量從大到小的順序先后流出層析柱，而達到分離的目的。,介質(zhì)：凝膠顆粒（多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)） 交聯(lián)度或孔度（網(wǎng)孔大?。┠z的分級分離范圍 交聯(lián)葡聚糖Sephadex G-50（1500-30000） 瓊脂糖 Sepharose或Bio-Gel A 聚丙烯酰胺Bio-Gel P,葡聚糖凝膠過濾,（3）離子交換層析,離子交換層析是在以離子交換劑為固定相，液體為流動相的系統(tǒng)中進行的。此法

34、廣泛應(yīng)用于很多生化物質(zhì)(例如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、糖類、核苷和有機酸等)的分析、制備、純化，以及溶液的中和、脫色等方面。 基本原理 ： 離子交換劑是由基質(zhì)、電荷基團(或功能基團)和反離子構(gòu)成的，基質(zhì)與電荷基因以共價鍵連接，電荷基因與反離子以離子鍵結(jié)合。 如：纖維素-O-CH2-COO-Na+ 離子交換劑與水溶液中離子或離子化合物的反應(yīng)主要以離子交換方式進行，假設(shè)以RA+代表陽離子交換劑，其中A+為反離子，A+能夠與溶液中的陽離子B+發(fā)生可逆的交換反應(yīng)，反應(yīng)式為：RA+B+ RB+A+ 。,生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸等多價電解質(zhì)有不同的分子大小及電荷排列方式。離子交換劑是通過化學鍵合的方法向惰性支

35、持物上連接可解離的化學基團后的產(chǎn)物?？扇藶檫x擇性地使其帶有正電荷或負電荷。當在一定pH下凈電荷為負的蛋白質(zhì)分子可通過靜電鍵結(jié)合到帶正電荷的離子交換劑(稱為陰離子交換劑)上；反之，稱為陽離子交換劑。 大分子依其與離子交換劑親和力的不同，而在以不同牢度被吸附于離子交換劑，通過改變離子強度或(和)pH使大分子再從離子交換劑上先后被洗脫下來。,離子交換層析分離蛋白質(zhì),離子交換層析,兩性離子如蛋白質(zhì)、酶類、多肽和核苷酸等物質(zhì)與離子交換劑的結(jié)合力，主要取決于它們的物理化學性質(zhì)和在特定pH條件下呈現(xiàn)的離子狀態(tài)。,當pH低于pI時，它們帶正電荷能與陽離子交換劑結(jié)合；反之，它們帶負電荷能與陰離子交換劑結(jié)合 。p

36、H與pI的差值越大，帶電量越大，與交換劑的結(jié)合力越強。 離子交換層析之所以能成功地把各種無機離子、有機離子或生物大分子物質(zhì)分開，主要依據(jù)是離子交換劑對各種離子或離子化合物有不同的結(jié)合力。,親和層析,2020/8/4,106,親和層析是利用生物分子間所具有的專一而又可逆的親和力而使生物分子分離純化的層析技術(shù)。 基本原理： 具有專一而又可逆的親和力的生物分子是成對互配的。主要有：酶和底物、酶與競爭性抑制劑、酶和輔酶、抗原與抗體、DNA和RNA、激素和其受體、DNA與結(jié)合蛋白等。 在成對互配的生物分子中，可把任何一方作為固定相，而對樣品溶液中的另一方分子進行親和層析，達到分離純化目的。例如，酶與其輔

37、酶是成對互配的，既可把輔酶作為固定相，使樣品中的酶分離純化，也可把酶作為固定相，使樣品中的輔酶分離純化。,2020/8/4,110,親和層析 原理示意圖,2020/8/4,111,親和層析的特點 純化效率極高：親和層析由于配體與待分離物質(zhì)進行特異性結(jié)合，所以分離提純的效率極高，提純度可達幾千倍 。 優(yōu)點：設(shè)備要求不高，操作簡便，適用范圍廣，特異性強，分離速度快，效果好，條件溫和。 缺點：通用性較差，洗脫條件要求苛刻。 親和層析的應(yīng)用 酶和抑制劑的純化 抗體、抗原的純化 結(jié)合蛋白的純化,激素受體的純化 分離病毒細胞 核酸蛋白互作研究,HisTag序列（6、8或10個連續(xù)的組氨酸殘基）與固定在基于

38、NTA(氮川三乙酸鎳) -和IDA- 的HisBind樹脂上的二價陽離子Ni2+結(jié)合。 洗去未結(jié)合蛋白后， 用咪唑或稍低的pH洗脫并回收目標蛋白。 該通用系統(tǒng)使得可在溫和、非變性條件，或存在6M胍或尿素條件下純化蛋白。,融合標簽蛋白純化His-Tag融合蛋白純化,不同純化方法效果,3.離心分離,離心分離是借助離心機旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，根據(jù)物質(zhì)顆粒的沉降系數(shù)、質(zhì)量、密度及浮力等因子的不同，而使物質(zhì)分離的技術(shù)。 離心分離可分為以下三種形式： （1）離心沉降，利用固液兩相的相對密度差，在離心機無孔轉(zhuǎn)子或管子中進行懸浮液的分離操作； （2）離心過濾，利用離心力并通過過濾介質(zhì)，在有孔轉(zhuǎn)子離心機中分離懸浮

39、液的操作； （3）離心分離和超離心，利用不同溶質(zhì)顆粒在液體中各部分分布的差異，分離不同相對密度液體的操作。 在離心分離時，要根據(jù)被分離物質(zhì)以及雜質(zhì)的大小、密度和特性的不同，選擇適當?shù)碾x心機、離心方法和離心條件。,離心機的種類 離心機的種類多種多樣。按用途分：分析用、制備用及分析-制備兩用；按結(jié)構(gòu)特點則有管式、吊籃式、轉(zhuǎn)鼓式和蝶式等多種；按離心機轉(zhuǎn)速的不同，可分為常速（低速）、高速和超速3種,離心機的種類和適用范圍,沉降系數(shù) Sedimentation coefficient (S),當轉(zhuǎn)子內(nèi)樣品繞著旋轉(zhuǎn)軸離心時，樣品沉降率是由樣品顆粒的大小、形狀、密度和溶劑的粘度、密度以及離心加速度決定的，在

40、一般情況下，樣品的沉降特征可以用沉降系數(shù)S來表示，它指單位離心場中粒子移動的速度。 S的物理意義是顆粒在離心力作用下從靜止狀態(tài)到達等速運動所經(jīng)過的時間。S在實際應(yīng)用時常在1013秒左右，故把沉降系數(shù)1013秒稱為一個Svedberg單位，簡寫S，單位為秒 對一定的樣品，在一定的介質(zhì)中，樣品沉降系數(shù)S也常保持不變。文獻中常用沉降系數(shù)以描述某些生物大分子或亞細胞器大小,離心分離方法,差速離心 （differential centrifugation） 采用不同的離心速度和離心時間，使沉降速度不同的顆粒分批分離的方法。 特點：用于分離大小和密度差異較大的顆粒。 優(yōu)點：操作簡單 。 缺點：1）分離效果

41、較差， 不能一次得到純顆粒。 2）壁效應(yīng)嚴重。 3）沉降的顆粒受到擠壓。,密度梯度離心（density gradient centrifugation） 密度梯度離心是樣品在密度梯度介質(zhì)中進行離心，使沉降系數(shù)比較接近的物質(zhì)分離的一種區(qū)帶分離方法。 為了使沉降系數(shù)比較接近的顆粒得以分離，必須配制好適宜的密度梯度系統(tǒng)。密度梯度系統(tǒng)是在溶劑中加入一定的溶質(zhì)制成的。這種溶質(zhì)稱為梯度介質(zhì)。 常用的梯度介質(zhì)有蔗糖、甘油等。使用最多的是蔗糖密度梯度系統(tǒng)，其適用范圍是：蔗糖濃度560%，密度范圍1.021.30 g/cm2。,密度梯度一般采用密度梯度混合器進行制備。 不同大小不同形狀、具有一定沉降系數(shù)差異的顆

42、粒離心后在密度梯度溶液中形成若干條界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶 特點： 區(qū)帶內(nèi)的液相介質(zhì)密度小于樣品物質(zhì)顆粒的密度。 適宜分離密度相近而大小不同的固相 物質(zhì)。,等密度梯度離心 當欲分離的不同顆粒的密度范圍處于離心介質(zhì)的密度范圍內(nèi)時，在離心力的作用下，不同浮力密度的顆粒或向下沉降，或向上飄浮，只要時間足夠長，就可以一直移動到與它們各自的浮力密度恰好相等的位置（等密度點），形成區(qū)帶。這種方法稱為等密梯度離心，或稱為平衡等密度離心。 根據(jù)顆粒的密度不同而進行分離。常用氯化銫（CsCl）作為梯度介質(zhì)。 特點： 介質(zhì)的密度梯度范圍包括所有待分離物質(zhì)的密度。 適于分離沉降系數(shù)相近，但密度不同的物質(zhì)。,等密度梯度離

43、心示意圖 （a）離心前； （b）離心后,總結(jié)： 等密度梯度離心是一種測定顆粒浮力密度的靜力學方法，關(guān)鍵在于選擇氯化銫濃度，使之包括待分離物的密度范圍。 差速離心是一種動力學方法，關(guān)鍵在于選擇適合于各分離物的離心力。 密度梯度離心兼有以上兩種方法的特點，關(guān)鍵在于制備優(yōu)質(zhì)的密度梯度溶液。,離心分離的條件 1. 離心力 2. 離心時間 3溫度和pH值 離心溫度一般控制在4左右，對于某些熱穩(wěn)定性較好的蛋白質(zhì)等，也可在室溫下進行離心。但在超速或高速離心時，轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)會發(fā)熱，從而引起溫度升高。故必須采用冷凍系統(tǒng)，使溫度保持在一定范圍內(nèi)。 離心介質(zhì)溶液的pH值應(yīng)該處于蛋白質(zhì)穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)，必要時可采用緩

44、沖液。另外，過酸或過堿還可能引起轉(zhuǎn)子和離心機的其他部件的腐蝕，應(yīng)該盡量避免。,離心力： 低速離心一般可以用離心速度，即轉(zhuǎn)子每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)表示。如5000r/min等。 在高速離心，特別是超速離心時，往往以相對離心力（RCF）表示。如60000g等。 相對離心力是指顆粒所受到的離心力與地心引力之比值。,離心時間,對于常速離心、高速離心和差速離心來說，離心時間是指顆粒從離心管中樣品液的液面完全沉降到離心管底的時間，稱為沉降時間或澄清時間。沉降時間決定于顆粒的沉降速度和沉降距離。 對于密度梯度離心而言，離心時間是指形成界限分明的區(qū)帶的時間，稱為區(qū)帶形成時間； 等密梯度離心所需的離心時間是指顆粒完全達到

45、等密度點的平衡時間，稱為平衡時間。,二、蛋白質(zhì)的分子大小與分子量的測定,蛋白質(zhì)的分子量的范圍：61031106 Da。,測定蛋白質(zhì)相對分子量的原理和方法,也可以利用蛋白質(zhì)中含量特少的aa，用同樣的原理計算蛋白質(zhì)的最低分子量。,（二）沉降分析測定Mr,在強大的離心場中，如果蛋白質(zhì)溶液的密度大于溶液密度，溶液中的蛋白質(zhì)會發(fā)生沉降。 沉降速度決定于蛋白質(zhì)的分子量、分子密度、分子形狀和溶劑的密度、粘度。 沉降系數(shù)（20,w）：單位離心場強度時的沉降速度。定義110-13秒（斯維得貝格單位）,（三）凝膠過濾法測定Mr,凝膠過濾（層析）可按照蛋白質(zhì)分子量大小進行分離的技術(shù)，同時可以測定蛋白質(zhì)分子量。,蛋白質(zhì)通過凝膠柱的速度即洗脫體積與其分子量有關(guān):,先測得幾種標準蛋白質(zhì)的 Ve （Ve為洗脫體積） ，并 以其分子量對數(shù)對Ve作圖得 一直線，再測出待測樣品的 Ve，查標準曲線即可確定分 子量，并以其分子量對數(shù)對 Ve作圖得一直線，再測出待 測樣品的Ve，