基因工程載體

1、基因工程常用載體,END!,THANDS FOR YOUR COMING!,在大腸桿菌的各種菌株中找到了許多種不同類型的質(zhì)粒，其中已經(jīng)作了比較洋盡研究的主要有F成粒、R質(zhì)粒和C。l質(zhì)位由于這些成粒的存在，寄主細(xì)胞便獲得了各自不同的性狀特征，根據(jù)這些特征來鑒別這三種不同類型的質(zhì)粒； F質(zhì)粒 又叫 F因子或性質(zhì)粒（Sex plasmid)。它們能夠使寄主染色淬上的基因和F質(zhì)粒一道轉(zhuǎn)移到原先不存在該質(zhì)粒的受體細(xì)胞中去。 R質(zhì)粒 通稱抗藥性因子。它們編碼有一種或數(shù)種抗菌素抗性基因，并且通常能 夠?qū)⒋朔N抗性轉(zhuǎn)移到缺乏該質(zhì)粒的適宜的受體細(xì)胞，使后者也獲得同樣的抗菌索抗性能力。 Col質(zhì)粒 即所謂產(chǎn)生大腸桿

2、菌素因子。它們編碼有控制大腸桿菌素合成的基因。 大腸桿菌素是一類可以使不帶有Col質(zhì)粒的親緣關(guān)系密切的細(xì)菌菌株致死的蛋白質(zhì)。,大腸桿菌菌株中不同類型的質(zhì)粒,噬菌體載體的構(gòu)建,野生型噬菌體DNA全長約50kb，上有65種限制酶酶切點，除Apa、Nae、Nar、Nhe、Sna B、Xba和Xho等7種限制酶各有一個切點外，其余都多于2個。有些酶切點在增殖所必需的基因區(qū)域內(nèi)。因此，噬菌體必須經(jīng)過改造才能用作載體?，F(xiàn)在用的載體大都除去了某種限制酶的酶切點。因此，作為載體的噬菌體都短于野生型。,噬菌體載體有兩種類型,插入型。由于改建后的噬菌體DNA都短于野生型，所以可插入外源DNA。只要插入的位置不影響

3、噬菌體增殖。而且噬菌體DNA缺失越長，插入片段就可越大。置換型。噬菌體的基因組可分為三個區(qū)域，左側(cè)區(qū)包括使噬菌體DNA成為一個成熟的、有外殼的病毒顆粒所需的全部基因，全長約20kb。右側(cè)區(qū)內(nèi)包含所有的調(diào)控因子、與DNA復(fù)制及裂解宿主菌有關(guān)的基因，這個區(qū)域約長12kb。中間區(qū)域約長18kb，這一段DNA可以被外源置換而不會影響噬菌體裂解生長的能力。置換型噬菌體是使用最廣泛的載體。,噬菌體裂解生長的能力同包裝在頭蛋白中的DNA的大小有關(guān)。當(dāng)DNA的長度短于野生型的78%或超過105%時，噬菌體的活性就急劇下降。因此要求載體DNA和外源DNA長度之和在3953kb之間。,置換型載體DNA用選定的限制

4、酶完全酶切后，要設(shè)法除去中間片段，只留下左臂和右臂以便用外源DNA片段連接，包裝成重組噬噬體。這是因為左臂和右臂與中間片段間都有單鏈“粘性末端”，在連接酶作用下可以重新恢復(fù)原來的結(jié)構(gòu)，從而影響了同外源DNA的連接。區(qū)分重組噬菌體形成的噬菌斑和重新恢復(fù)的載體噬菌體形成的噬菌斑的方法是用Xgal藍(lán)色噬菌斑試驗。有些噬菌體載體的中間片段帶有編碼半乳糖苷酸的基因。當(dāng)這種噬菌體感染lac宿主細(xì)胞并在含有Xgal(5溴4氯3吲哚D半乳糖苷)的培養(yǎng)基上生長時，半乳糖苷酸與Xgal反應(yīng)的產(chǎn)物為不溶性的靛藍(lán)染料。因此，含有中間片段的重新恢復(fù)的噬菌體形成藍(lán)色噬菌斑；而同外源DNA連接的重組噬菌體形成的噬菌斑是無色

5、透明的。,單鏈?zhǔn)删w載體(M13),最常用的單鏈?zhǔn)删w載體是M13和它的改建噬菌體。M13是絲狀噬菌體，有長約6500個核苷酸的閉環(huán)DNA基因組。M13附著在大腸桿菌的F性菌毛上，所以它們只能感染雄性細(xì)菌，即F或Hfr細(xì)菌。當(dāng)噬菌體進入細(xì)菌細(xì)胞后，單鏈的噬菌體DNA轉(zhuǎn)變成雙鏈復(fù)制型(RF)。從細(xì)胞中分離的RF可用作克隆雙鏈DNA的載體。當(dāng)每個細(xì)菌細(xì)胞里積聚了200到300份RF型拷貝時，M13開始不對稱的合成，即只大量合成DNA雙鏈中的一條鏈。單鏈DNA摻入成熟的噬菌體顆粒，顆粒不斷地從感染細(xì)胞上芽生。M13感染雖不殺死細(xì)胞，但細(xì)胞的生長受到一定的抑制，所以形成混濁的噬菌斑。,M13的基因組中除有一段507個核苷酸，其余都含有與其復(fù)制有關(guān)的遺傳信息。因此，只有在這一段中可插入外源DNA而不致影響噬菌體的活性。用M13作為分子克隆載體的優(yōu)點是從細(xì)菌中釋放出來的噬菌體顆粒只含單鏈DNA，其中包含了克隆DNA片段的二條互補鏈中的一條，因此可用來作為對DNA測序的模板。另外，可用來產(chǎn)生單鏈的DNA探針以選擇和分離互補的RNA。M13的RF型是雙鏈DNA，便于限制酶的識別和切割，克隆