江西省血液中心核酸檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)介紹.ppt

1、江西省血液中心核酸檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)介紹,錢 榕,主要內(nèi)容,中心簡(jiǎn)介 核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置及工作流程 核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室管理和檢測(cè)關(guān)鍵控制點(diǎn) 開(kāi)站核酸檢測(cè)情況,江西省血液中心概況,江西省血液中心于1984年成立，隸屬省衛(wèi)生廳管理的公共衛(wèi)生事業(yè)單位。占地面積63.4畝，總建筑面積21788,現(xiàn)有職工171人，供應(yīng)省直13家醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床用血，2011年總供血量為23.8噸，并承擔(dān)全省采供血機(jī)構(gòu)質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)、業(yè)務(wù)技術(shù)指導(dǎo)、人才培訓(xùn)及血液相關(guān)的科研等任務(wù)。自2006年起，臨床用血已實(shí)現(xiàn)100%來(lái)自于自愿無(wú)償獻(xiàn)血。成分輸血達(dá)到99.8%。,中心重視科研工作，致力從臨床輸血治療和開(kāi)展新技術(shù)治療的需求出發(fā)，開(kāi)展了血液去

2、除白細(xì)胞、血漿病毒滅活等新技術(shù)。2010年4月份，中心與北京、上海、廣州等12個(gè)省市15所采供血機(jī)構(gòu)一道，被衛(wèi)生部列為我國(guó)內(nèi)地首批核酸檢測(cè)試點(diǎn)單位。此外，中心先后開(kāi)展了骨髓移植配血、器官移植配型(基因法)、產(chǎn)前血型血清學(xué)檢測(cè)、新生兒溶血病檢測(cè)、親子鑒定(基因法)等研究工作。,中心核心價(jià)值觀,忠誠(chéng)履行輸血使命精益服務(wù)健康人生,中心環(huán)境,標(biāo)本交接離心區(qū)：用于核酸標(biāo)本的接收、離心處理； 設(shè)備：大容量低溫離心機(jī)2臺(tái) 混樣區(qū)：用于血液標(biāo)本開(kāi)蓋、混樣、以及質(zhì)控品的加樣； 設(shè)備：全自動(dòng)混樣儀HAMILTON STARIVD 2臺(tái)、生物安全柜1臺(tái)、 移動(dòng)紫外車3臺(tái)； 提取擴(kuò)增檢測(cè)區(qū)：用于核酸的提取、PCR擴(kuò)增

3、和檢測(cè)。 設(shè)備：3套 COBAS AmpliPrep+COBAS TaqMan 、服務(wù)器1臺(tái)、試劑暫存冰箱1臺(tái)、移動(dòng)紫外車3臺(tái),核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置,核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置,實(shí)驗(yàn)室平面圖,檢測(cè)系統(tǒng)： cobas s 201核酸血液篩查系統(tǒng) 設(shè)備配置： 2 STAR+ 3CAP+ 3docking+ 3CTM 試劑組成： cobas TaqScreen MPX Test（96人份，一代） cobas TaqScreen MPX Control Kit（一代：6*6） cobas TaqScreen Wash Reagent,全血標(biāo)本 標(biāo)本采集后4小時(shí)內(nèi)進(jìn)行離心處理。樣本離心后先進(jìn)行常規(guī)酶免檢測(cè)，然

4、后將酶免試劑陰性結(jié)果標(biāo)本進(jìn)行六混樣核酸檢測(cè)。如混樣檢測(cè)有反應(yīng)性，再進(jìn)行拆分檢測(cè)。 機(jī)采標(biāo)本 標(biāo)本采集后4小時(shí)內(nèi)進(jìn)行離心處理； 加樣模式：六混樣（1機(jī)采標(biāo)本+5全血標(biāo)本）,核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室工作流程,核酸檢測(cè)（酶免第一批陰性）,23.00,08.00,09.00,10.00,11.00,12.00,13.00,14.00,15.00,16.00,17.00,18.00,19.00,20.00,21.00,22.00,核酸檢測(cè)（酶免第二批陰性）,核酸檢測(cè)（酶免第三批陰性）,酶免檢測(cè)第一批,2 staffs,Start NAT,酶免檢測(cè)第二批,酶免檢測(cè)第三批,核酸檢測(cè)如有陽(yáng)性結(jié)果，當(dāng)天進(jìn)行拆分實(shí)驗(yàn),核酸

5、檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室工作流程,核酸檢測(cè)陽(yáng)性樣本拆分實(shí)驗(yàn),03.00,04.00,06.00,19.00,20.00,21.00,22.00,23.00,24.00,01.00,02.00,1 staff,05.00,07.00,全部樣本在48小時(shí)內(nèi)出報(bào)告，符合衛(wèi)生部核酸檢測(cè)要求,核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室工作流程,核酸檢測(cè)的關(guān)鍵控制點(diǎn)標(biāo)本,采血管的選擇 留樣方式及注意事項(xiàng) 運(yùn)輸過(guò)程中標(biāo)本質(zhì)量保證 標(biāo)本處理方式及細(xì)節(jié)解讀 標(biāo)本檢測(cè),核酸檢測(cè)采血管的要求,抗凝劑：首選EDTA和枸櫞酸鹽，避免使用肝素抗凝。 無(wú)菌 無(wú)DNA酶、無(wú)RNA酶： 含分離膠的真空采血管；,標(biāo)本留取細(xì)節(jié)解讀,防污染 留取人員的個(gè)人防護(hù)，留取前的清潔

6、消毒，留取過(guò)程中保持密閉，防止其他可能污染物。 充分混勻 注意樣品采集后的充分混勻，一般上下顛倒次以上，如操作不規(guī)范，則容易出現(xiàn)凝塊，給后續(xù)檢測(cè)帶來(lái)弊端：核酸檢測(cè)出現(xiàn)凝塊報(bào)錯(cuò)，引起人力、試劑等不必要的浪費(fèi)，增加標(biāo)本污染風(fēng)險(xiǎn)。 標(biāo)本量 標(biāo)本留取應(yīng)檢查是否足量，如量少，應(yīng)更換采血管重新留取，杜絕開(kāi)蓋留取。,NAT標(biāo)本溶血及影響,溶血：原因多為標(biāo)本留取中機(jī)械作用致紅細(xì)胞破裂引起，如標(biāo)本留取不暢、留取速度過(guò)快等；另外，劇烈震蕩也可引起溶血，如運(yùn)輸顛簸等 溶血對(duì)NAT檢測(cè)的影響： 血紅蛋白是核酸檢測(cè)的主要抑制物之一，可抑制核酸檢測(cè)；另外可核酸酶的釋放加速核酸降解。 如何避免溶血現(xiàn)象出現(xiàn)？ 標(biāo)本留取時(shí)將血

7、液順管壁緩慢注入真空管中；另外避免震蕩，以防血細(xì)胞破裂而溶血。,NAT標(biāo)本脂血及影響,脂血是指血液標(biāo)本采集后，經(jīng)過(guò)離心處理，分離出來(lái)的血清中含有脂類物質(zhì)。從外觀上看，血漿呈渾濁的乳白色。 脂血對(duì)NAT檢測(cè)的影響：脂血易引起加樣環(huán)節(jié)液面感應(yīng)異常報(bào)錯(cuò)；高脂血標(biāo)本可通過(guò)對(duì)熒光的屏蔽和吸收作用而干擾檢測(cè)。 如何避免留取脂血標(biāo)本？ 應(yīng)注意飲食情況等的征詢，可一定程度消除留取脂血標(biāo)本。,NAT標(biāo)本中的其它影響因素,內(nèi)源性：免疫球蛋白、蛋白酶、離子等； 外源性：肝素抗凝劑、手套滑石粉、標(biāo)本容器或采樣器材中含有的抑制物等。,標(biāo)本的運(yùn)輸,冷鏈控制 專用標(biāo)本運(yùn)輸箱的使用； 確保標(biāo)本在采集后4小時(shí)內(nèi)離心。,核酸標(biāo)本

8、離心細(xì)節(jié)解讀,離心機(jī)的選擇：低溫離心機(jī)； 離心條件：3000g,20min，應(yīng)根據(jù)實(shí)際進(jìn)行調(diào)整以確保離心充分； 另外，為更好的消除凝塊，可在離心前再次顛倒混勻；也可在檢測(cè)前進(jìn)行二次離心。,檢測(cè)前準(zhǔn)備,檢測(cè)前核對(duì)：狀態(tài)、標(biāo)識(shí)、離心時(shí)間、保存條件等； 室溫平衡：如標(biāo)本在4中保存，檢測(cè)前應(yīng)室溫平衡30分鐘以上（非常重要，否則易產(chǎn)生clot）； 開(kāi)蓋： 加樣前開(kāi)蓋； 在生物安全柜中進(jìn)行；,加樣過(guò)程中凝塊報(bào)錯(cuò)原因分析,采血后混勻不充分：局部抗凝效果不佳致凝塊析出； 離心條件不充分：離心力或離心時(shí)間不足所致，如血漿中存在的微量血細(xì)胞、分離膠、纖維蛋白等為引發(fā)凝塊的原始因素。 加樣前室溫平衡時(shí)間不足。 加樣

9、設(shè)備問(wèn)題：為假凝塊，多為設(shè)備感應(yīng)異常、設(shè)備硬件與軟件的兼容性欠缺等原因引起，可通過(guò)調(diào)整參數(shù)、軟件兼容性等方法解決；,核酸標(biāo)本的采集、運(yùn)送、處理和保存的關(guān)鍵點(diǎn),采血管：抗凝劑、一次性密閉、無(wú)菌、無(wú)核酸酶及其他擴(kuò)增抑制物 采集：人員、防污染、采集方式 標(biāo)本的運(yùn)送：冷鏈控制？盡可能快？ 標(biāo)本的處理：離心時(shí)間、離心強(qiáng)度，4小時(shí)內(nèi)離心 合格標(biāo)本:外觀質(zhì)量符合要求、容器完整、量夠、,核酸檢測(cè)的關(guān)鍵控制點(diǎn)防污染措施,核酸檢測(cè)的最大特點(diǎn)是具有強(qiáng)大的擴(kuò)增能力與極高的靈敏度，這也意味著極其微量的污染即可造成假陽(yáng)性結(jié)果。,易引發(fā)NAT檢測(cè)污染的幾個(gè)環(huán)節(jié),標(biāo)本的開(kāi)蓋 NAT檢測(cè)試劑、外部質(zhì)控品的準(zhǔn)備 擴(kuò)增產(chǎn)物的處理

10、用品的專用與清潔（如手套、紗布等），,基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室管理辦法規(guī)定： 在核酸純化過(guò)程中可能會(huì)發(fā)生氣溶膠所致的污染為避免樣本間的交叉污染，加入待測(cè)核酸后，必須蓋好含反應(yīng)混合液的反應(yīng)管。,Roche cobas s 201系統(tǒng)防污染設(shè)計(jì),全球唯一的三重防污染設(shè)計(jì) 儀器：全自動(dòng)封閉系統(tǒng) 反應(yīng)管：全程封閉狀態(tài)，杜絕交叉污染 試劑：專利的UNG酶消除擴(kuò)增產(chǎn)物帶來(lái)的污染,移動(dòng)紫外燈照射； 70%乙醇； 日常儀器和架子的維護(hù)清潔 新鮮配置的0.5%次氯酸鈉溶液； 實(shí)驗(yàn)室工作臺(tái)面和樣本外濺時(shí)使用 實(shí)驗(yàn)室通風(fēng),其他實(shí)驗(yàn)室防污染措施,溫度在15-30度之間，超出這個(gè)范圍儀器報(bào)警； 注意除濕，濕度不宜超過(guò)60%，超過(guò)

11、這個(gè)濕度儀器故障率高。,核酸檢測(cè)的關(guān)鍵控制點(diǎn)溫度與濕度,核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)管理,嚴(yán)格單向工作流向制度 進(jìn)入各工作區(qū)域必須嚴(yán)格按照單一方向進(jìn)行，即：試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)標(biāo)本制備PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析； 各區(qū)在物理空間上完全互相獨(dú)立，使用功能上互相分割； 各區(qū)之間不能有空氣直接相通。 嚴(yán)格物品專用制度 各區(qū)使用的儀器設(shè)備、移液器、Tip、試管架、筆記本、記號(hào)筆、手套等包括清潔用物品都必需執(zhí)行專區(qū)專用原則。 各工作區(qū)域用品必須有明確的標(biāo)記，避免不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品混用。,分區(qū)內(nèi)操作流程的合理化 了解實(shí)驗(yàn)室污染的來(lái)源，可能產(chǎn)生污染的實(shí)驗(yàn)操作（如陽(yáng)性樣本、實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每一次的開(kāi)蓋過(guò)程等） 操作順序應(yīng)盡量從相

12、對(duì)清潔到相對(duì)污染（如混樣區(qū)相對(duì)清潔度：檢測(cè)耗材標(biāo)本陽(yáng)性質(zhì)控品),操作順序顛倒時(shí)應(yīng)及時(shí)更換手套或進(jìn)行相應(yīng)的處理； 養(yǎng)成良好的實(shí)驗(yàn)室操作習(xí)慣，規(guī)范行為。 避免攜帶污染 操作人員應(yīng)注意防止通過(guò)頭發(fā)、眼鏡等非專用物品將污染物攜帶到清潔區(qū)； 警惕手套可能接觸污染物或污染其它物品等。,2010年8月9日-2013年7月31日共完成177916份血液標(biāo)本的核酸檢測(cè)。其中拆分檢測(cè)586次；拆分出390例酶免陰性而NAT陽(yáng)性的標(biāo)本，陽(yáng)性率為0.22%。 鑒別陽(yáng)性標(biāo)本190例，其中188例為HBV陽(yáng)性，另有1例HBV、HCV合并感染,1例HCV陽(yáng)性。,血站開(kāi)展核酸檢測(cè)情況,檢測(cè)常見(jiàn)現(xiàn)象分析,問(wèn)題1：初混陽(yáng)性，拆分陰性標(biāo)本如何解釋？ 因根據(jù)檢測(cè)CT值、擴(kuò)增曲線等綜合判斷，一般CT值在37以上可考慮為初混時(shí)產(chǎn)生了假陽(yáng)性反