過(guò)程分子生物學(xué)(1 ）

1、華東理工大學(xué)碩士研究生學(xué)位課程,過(guò)程分子生物學(xué),張 惠 展,分子生物學(xué)是生命科學(xué)的主導(dǎo)性學(xué)科,基因的表達(dá)與調(diào)控是分子生物學(xué)的主題思想,過(guò)程分子生物學(xué)是分子生物學(xué)理論發(fā)展的高級(jí)階段,1953-1983 基礎(chǔ)分子生物學(xué)階段,20世紀(jì)50年代 DNA雙螺旋模型的建立,20世紀(jì)60年代 遺傳密碼的破譯,20世紀(jì)70年代 DNA重組技術(shù)的誕生,1983-？ 過(guò)程分子生物學(xué)階段,20世紀(jì)80年代 動(dòng)植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的問(wèn)世,20世紀(jì)90年代 人類(lèi)基因組計(jì)劃的實(shí)施,21世紀(jì)00年代 RNA干擾現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn),過(guò)程分子生物學(xué),5,2,3,4,1,6,基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制,細(xì)胞通訊的分子機(jī)制,免疫多樣性的分子識(shí)別,胚胎發(fā)

2、育的基因表達(dá)譜,腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制,基因組學(xué)與系統(tǒng)生物學(xué),基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制,B,C,D,A,E,F,原核生物基因表達(dá)的啟動(dòng)開(kāi)關(guān),真核生物多轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同作用,原核生物的RNA結(jié)構(gòu)調(diào)控,真核生物的RNA剪切調(diào)控,原核生物反義RNA的調(diào)控,真核生物sRNA介導(dǎo)的RNA干擾,G,真核生物應(yīng)答元件的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,1A 原核生物基因表達(dá)的啟動(dòng)開(kāi)關(guān),通過(guò)對(duì)100多個(gè)大腸桿菌啟動(dòng)子的序列分析，結(jié)果表明：大多數(shù)具有普通生理生化功能的基因所屬的啟動(dòng)子，具有統(tǒng)一的特征序列。,a 大腸桿菌啟動(dòng)子的多樣性,TTGACA,AACTGT,TATAAT,ATATTA,16 - 10 bp,5 - 9 bp,結(jié)構(gòu)基因,轉(zhuǎn)錄起始

3、位點(diǎn),-35區(qū) T82T84G78A65C54A45,-10區(qū) T80A95T45A60A50T96,啟動(dòng)子,一個(gè)典型的大腸桿菌啟動(dòng)子通常包括下列四個(gè)結(jié)構(gòu)要素：,1A 原核生物基因表達(dá)的啟動(dòng)開(kāi)關(guān),絕大多數(shù)原核生物的RNA聚合酶均由五個(gè)亞基組成：a2bbs（全酶），其中a2bb稱為（核心酶）。各種原核細(xì)菌的a、b、b亞基呈高度的同源性，唯獨(dú)s因子差別較大。RNA聚合酶核心酶對(duì)DNA鏈具有非特異性的親和力（堿性蛋白與酸性DNA之間的靜電引力），但s因子增強(qiáng)了RNA聚合酶與啟動(dòng)子區(qū)域的特異性結(jié)合。s因子幫助RNA,a 大腸桿菌啟動(dòng)子的多樣性,聚合酶識(shí)別啟動(dòng)子，同時(shí)啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。,大腸桿菌啟動(dòng)子與s因子的

4、對(duì)應(yīng)關(guān)系 （Lewins GENES X 2010）,氨基酸,-35區(qū)序列,識(shí)別數(shù),間隔區(qū),-10區(qū)序列,因子/基因,TTGACA,TATAAT,1000,16-18 bp,613,s 70（rpoD）,CTGGNA,TTGCA,5,6 bp,477,s 54（rpoN）,CCCTTGAA,CCCGATNT,30,13-15 bp,284,s 32（rpoH）,TTGACA,TATAAT,100,16-18 bp,330,s S（rpoS）,CTAAA,GCCGATAA,40,15 bp,239,s F（rpoF）,GAA,YCTGA,20,16 bp,202,s E（rpoE）,2,173,

5、s FecI（fecI）,TGNCTG,CGTCTT,15 bp,1A 原核生物基因表達(dá)的啟動(dòng)開(kāi)關(guān),枯草桿菌中存在著大約二十類(lèi)不同的啟動(dòng)子，其中有些隸屬于正常的生理代謝基因，有些則隸屬于噬菌體感染、孢子生成、次級(jí)代謝過(guò)程中的相關(guān)基因。,b 枯草桿菌啟動(dòng)子的多樣性,在SPO1噬菌體感染過(guò)程中的RNA聚合酶及其s因子,SPO1噬菌體感染枯草桿菌后，早期基因表達(dá)；4-5分鐘后，中期基因表達(dá)，早期基因關(guān)閉；8-12分鐘后，晚期基因表達(dá)，中期基因關(guān)閉。早期基因的啟動(dòng)子由s43（即sA）識(shí)別啟動(dòng)，這是枯草桿菌細(xì)胞內(nèi)具有廣泛生理生化功能的s因子，與大腸桿菌中的s70同源，組成a2bbs43型RNA聚合酶，轉(zhuǎn)

6、錄中期基因表達(dá)所需的s因子編碼基因gp28。中期基因的啟動(dòng)子由sgp28識(shí)別啟動(dòng)，它與枯草桿菌的核心酶構(gòu)成a2bbsgp28型RNA聚合酶全酶，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄晚期基因表達(dá)所需的s因子編碼基因gp33和gp34。晚期基因的啟動(dòng)子由sgp33和sgp34識(shí)別啟動(dòng)，,分別構(gòu)成RNA聚合酶全酶a2bbsgp33和a2bbsgp34。,SPO1噬菌體基因表 達(dá)的級(jí)聯(lián)調(diào)控模式,通過(guò)更換不同的s因子，,識(shí)別并作用于不同基因,的啟動(dòng)子，最終導(dǎo)致這,些基因有次序地級(jí)聯(lián)表,達(dá)。前一基因編碼后一,基因表達(dá)所需的s因子。,s43,s28,s28,s33 / 34,早期基因,中期基因,晚期基因,（Lewins GENES X

7、 2010）,枯草桿菌的孢子生成過(guò)程,枯草桿菌在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段結(jié)束后，培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡，這時(shí)便啟動(dòng)孢子生成過(guò)程：先是DNA復(fù)制，隔膜形成，孢衣合成，母體裂解，孢子釋放。最后在細(xì)胞內(nèi)約40%的mRNA是孢子生,專(zhuān)一性的。,對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌,基因組復(fù)制,隔膜形成,DNA轉(zhuǎn)位至前孢,孢衣形成,母細(xì)胞裂解，孢子釋放,（Lewins GENES X 2010）,枯草桿菌孢子形成過(guò)程中的RNA聚合酶及其s因子,當(dāng)環(huán)境壓力（例如營(yíng)養(yǎng)成份枯竭）時(shí)，枯草桿菌細(xì)胞內(nèi)發(fā)生一連串的磷酸基團(tuán)傳遞反應(yīng)，最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Spo0A的磷酸化。磷酸化了的Spo0A同時(shí)啟動(dòng)兩種不同操縱子的轉(zhuǎn)錄，分別表達(dá)出sproE和sF。s

8、F一方面啟動(dòng)sG的表達(dá)，另一方面又表達(dá)SpoIIR，后者再激活隔膜結(jié)合型蛋白SpoIIGA，活化了的SpoIIGA將母體細(xì)胞中表達(dá)的sproE裂解為有活性的sE；而在前孢區(qū)域內(nèi)產(chǎn)生的sE均被前孢特有的蛋白酶摧毀殆盡。母體細(xì)胞中sE的活性是激活前孢區(qū)域sG所必需的（通過(guò)SpoIIA和一種未知蛋白因子）；而sG的活性又能產(chǎn)生一種信號(hào)，跨隔,膜激活母體細(xì)胞中的sK。即：sF sE sG sK 。,枯草桿菌孢子,子交叉激活,形成過(guò)程中兩,條途徑的 s因,sF,sE,sG,sK,激活,表達(dá),前孢區(qū),母細(xì)胞,Spo0A,Spo0A,s43,s43,sF,sproE,sE,sG,sproK,隔膜,SpoII

9、R,SpoIIGA,SpoIIA,sK,5 h,5 h,打開(kāi)262個(gè)基因,打開(kāi)75個(gè)基因,打開(kāi)48個(gè)基因,打開(kāi)81 個(gè)基因,SpoIVB,枯草桿菌各類(lèi)s因子識(shí)別啟動(dòng)子的序列偏好性 Science 335 2012,1A 原核生物基因表達(dá)的啟動(dòng)開(kāi)關(guān),鏈霉菌啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)具有很大的離散性，通過(guò)對(duì)100多個(gè)啟動(dòng)子序列的比較，可將鏈霉菌啟動(dòng)子分成三大類(lèi)：,c 鏈霉菌啟動(dòng)子的多樣性,具有典型原核生物啟動(dòng)子-10區(qū)和-35區(qū)特征的啟動(dòng)子，僅占21%,具有典型原核生物啟動(dòng)子-10區(qū)而無(wú)保守的-35區(qū)的啟動(dòng)子,既無(wú)典型原核生物啟動(dòng)子-10區(qū)又無(wú)保守的-35區(qū)的啟動(dòng)子,1A 原核生物基因表達(dá)的啟動(dòng)開(kāi)關(guān),天藍(lán)色鏈霉

10、菌（Streptomyces coelicolor）的全基因組中存在多達(dá)65種不同的s因,c 鏈霉菌啟動(dòng)子的多樣性,s66（hrdB）,鏈霉菌最重要的s因子，hrdB-突變是致死性的。hrdB基因全程,表達(dá)，稱為看家基因。,sWhiG（whiG）,鏈霉菌次級(jí)代謝基因轉(zhuǎn)錄所需的s因子。,sF,鏈霉菌孢子生成基因轉(zhuǎn)錄所需的s因子。,sBldN（bldN）,鏈霉菌氣生菌絲發(fā)育基因轉(zhuǎn)錄所需的s因子。,sR（sigR）,鏈霉菌響應(yīng)氧化壓力基因轉(zhuǎn)錄所需的s因子。,sE（sigE）,鏈霉菌感應(yīng)細(xì)胞膜完整性功能所需的s因子。,子，其中已被鑒定的有：,1B 真核生物多轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同作用,真核生物尤其是高等真核生

11、物（哺乳動(dòng)物）由于其細(xì)胞的高度分化，決定了基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜性。 與原核生物不同，哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)共有三大類(lèi)RNA聚合酶系統(tǒng)，它們均由多轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)成，識(shí)別三大類(lèi)真核生物的啟動(dòng)子，分別承擔(dān)rRNA、mRNA、tRNA的轉(zhuǎn)錄。所有三種RNA聚合酶均由8-14個(gè)亞基組成，500kD，但它們并不能單獨(dú)啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄。,1B 真核生物多轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同作用,啟動(dòng)子由兩部分元件構(gòu)成。,a RNA聚合酶 I 啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的程序,RNA聚合酶 I 定位于核仁，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄rRNA編碼基因。RNA聚合酶 I 只作用于一種類(lèi)型的啟動(dòng)子，這類(lèi),高等真核生物 I 型啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)基因,I 型啟動(dòng)子,轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),上游啟動(dòng)

12、子元件（UPE）,核心啟動(dòng)子,GC豐富區(qū),GC豐富區(qū),增強(qiáng)啟動(dòng)效果,啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄,CTCCGAGTCGNNNNNNNTGGGCCGCCGG 人類(lèi)的這兩個(gè)重復(fù)序列具有85%的同原性,I 型啟動(dòng)子介導(dǎo)rRNA,基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)過(guò)程,RNA聚合酶 I 在 I 型啟動(dòng)子,處的定位需要兩種轉(zhuǎn)錄因子,并經(jīng)歷三個(gè)階段：,UBF1（UPE結(jié)合因子）,裝配因子,SL1（四聚體核心結(jié)合因子）,定位因子,其中之一為 TBP,UBF1,SL1,起始位點(diǎn),核心啟動(dòng)子,上游啟動(dòng)子元件（UPE）,Pol I,UBF1結(jié)合在啟動(dòng)子的UPE處,SL1結(jié)合在核心啟動(dòng)子處,Pol I 加入,TBP,1B 真核生物多轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同作用

13、,RNA聚合酶 II 定位于核內(nèi)，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄mRNA的前體分子hnRNA。 RNA聚合酶 II 及其作用的 II 型啟動(dòng)子是 真核生物細(xì)胞中最廣泛最典型最重要的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)元件。,b RNA聚合酶 II 啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的程序,高等真核生物 II 型啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)基因,II 型啟動(dòng)子,轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),啟動(dòng)子附加區(qū),TATA BOX,轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)效率,轉(zhuǎn)錄因子和RNA pol II 識(shí)別位點(diǎn),轉(zhuǎn)錄的時(shí)空特異性,啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄,轉(zhuǎn)錄起始子 Inr,核心啟動(dòng)子,高等真核生物 II 型啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)基因,II 型啟動(dòng)子,轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),啟動(dòng)子附加區(qū),TATA BOX,Inr,上述附加區(qū)元件并不一定同時(shí)存在，而且在間

14、隔、排列順序、拷貝,數(shù)上均有很大的可變性。,高等真核生物 II 型啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)基因,II 型啟動(dòng)子,轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),啟動(dòng)子附加區(qū),TATA BOX,Inr,TATA BOX 位于 -25區(qū)，普遍存在于所有的真核生物細(xì)胞中，由,八對(duì)堿基組成，兩側(cè)為GC堿基對(duì)。少數(shù)不含TATA BOX 特征結(jié)構(gòu)的,啟動(dòng)子成為 TATA-less 啟動(dòng)子。,RNA聚合酶 II 與轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物,裝配因子,TF II A B E F H J,RNA聚合酶 II 本身由10-12個(gè)亞基組成 ，這些亞基具有類(lèi)似,于原核細(xì)菌RNA聚合酶中a、b、b亞基的功能，但同樣不能識(shí)別啟,動(dòng)子。對(duì)啟動(dòng)子的專(zhuān)一性識(shí)別由若干的一般轉(zhuǎn)錄

15、因子負(fù)責(zé)。這些一,般轉(zhuǎn)錄因子分為兩大類(lèi)：裝配因子和定位因子。,定位因子,聚合酶 II,TBP TAF,a2bb,s 因子,真核生物：,原核生物：,II 型啟動(dòng)子介導(dǎo)的基因,轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)過(guò)程,各種一般轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶 II 嚴(yán)格按照既定的順序依次結(jié)合在DNA及其蛋白復(fù)合物上，每種一般轉(zhuǎn)錄因子的加入均使DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物的空間構(gòu)象發(fā)生一次改變，而這種構(gòu)象變化又是下一輪的轉(zhuǎn)錄因,TATA,Startpoint,TFII D,TAFs,TBP,TFII A,TFII B,TFII F,Pol II,TFII J,TFII H,TFII E,子加入所必需的。,啟動(dòng)子校對(duì),轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)流產(chǎn),轉(zhuǎn)錄加固,II

16、 型啟動(dòng)子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)過(guò)程,TFIIH是唯一一種具有多重獨(dú)立酶活性的一般轉(zhuǎn)錄因子，其酶活性包括ATP酶、雙向解旋酶以及使RNA聚合酶II尾部CTD結(jié)構(gòu)域磷酸化的磷酸激酶。RNA聚合酶II一旦被磷酸化，所有的一般轉(zhuǎn)錄因子便從轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物上剝落下來(lái)，轉(zhuǎn)錄由起始階,TFII J,TFII H,P,P,P,P,段轉(zhuǎn)換到延伸階段。,TFII F / Pol II,RNA聚合酶 II 在近啟動(dòng)子處暫停介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄延伸調(diào)控機(jī)制,以RNA聚合酶 II 為核心的轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物在 II 型啟動(dòng)子處裝配完畢后，轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)。但隨后的轉(zhuǎn)錄進(jìn)程并非像人們想象的那么一帆風(fēng)順。事實(shí)上在很多果蠅和哺乳動(dòng)物的基因中，剛剛啟動(dòng)

17、轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶 II 會(huì)在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游25-50個(gè)堿基處停頓下,來(lái)。一些蛋白因子促進(jìn)RNA聚合酶 II 快速進(jìn)入停頓位點(diǎn)，而NELF（負(fù),延伸因子）和DSIF因子則起到穩(wěn)定處于停頓狀態(tài)的聚合酶 II 的作用。,快速進(jìn)入停頓位點(diǎn),慢速逃離停頓位點(diǎn),RNA聚合酶 II 在近啟動(dòng)子處暫停介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄延伸調(diào)控機(jī)制,RNA聚合酶 II 從停頓位點(diǎn)逃離的先決條件是一些能促進(jìn)其逃離的蛋白因子的出現(xiàn)。這些因子將正轉(zhuǎn)錄延伸因子b（P-TEFb）招募至RNA聚合酶 II 處，并使NELF磷酸化。被磷酸化的NELF從RNA聚合酶II上解離，后者得以逃離，,新近的果蠅全基因掃描研究表明，三分之一以上的基因在轉(zhuǎn)錄

18、起始后能產(chǎn)生短小的RNA序列，表明這種啟動(dòng)子鄰近區(qū)的RNA聚合酶II停頓是控制轉(zhuǎn)錄輸出的普遍戰(zhàn)略。（Science 327，2010）,轉(zhuǎn)錄加速；反之轉(zhuǎn)錄將緩慢進(jìn)行。,1B 真核生物多轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同作用,RNA聚合酶 III 定位于核內(nèi)，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄tRNA和小分子 核內(nèi)RNA（snRNA）。相應(yīng)的 III 型啟動(dòng)子有兩種類(lèi)型： tRNA編碼基因所屬的啟動(dòng)子稱為內(nèi)源型啟動(dòng)子； snRNA編碼基因所屬的啟動(dòng)子稱為外源型啟動(dòng)子；,c RNA聚合酶 III 轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的程序,高等真核生物 III 型啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)基因,III 型內(nèi)源型啟動(dòng)子,轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),BOX A,BOX C,BOX A,BOX B

19、,PSE,OCT,Pol III 結(jié)合區(qū),III 型外源型啟動(dòng)子,轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),結(jié)構(gòu)基因,III 型啟動(dòng)子介導(dǎo)的,tRNA/snRNA基因,轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)過(guò)程,TFIIIB由TBP和另外兩,種蛋白因子組成，其功,能相當(dāng)于定位因子；,TFIIIA和TFIIIC屬于裝,配因子。,boxA,boxC,boxA,boxB,（1型） 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),TFIIIA,TFIIIC,TFIIIA,TFIIIC,TFIIIC,TFIIIA,TFIIIC,TFIIIC,TFIIIB,TFIIIB,RNA Pol III,RNA Pol III,TFIIIB,TFIIIB,（2型） 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),1B 真核生物多轉(zhuǎn)錄因子的

20、協(xié)同作用,由此可見(jiàn)，TBP是所有三種類(lèi)型的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)所必需的。在含有TATA BOX的啟動(dòng)子中，TBP特異性地結(jié)合在DNA的相應(yīng)區(qū)域；在TATA less 型啟動(dòng)子中，TBP與其它蛋白因子協(xié)同作用，結(jié)合在DNA的特定區(qū)域內(nèi)。,1C 原核生物的RNA結(jié)構(gòu)調(diào)控,RNA的結(jié)構(gòu)調(diào)控是一種轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)后的基因表達(dá)調(diào)控方式，其主要形式表現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄的終止與抗終止作用。,a RNA轉(zhuǎn)錄的終止作用,原核細(xì)菌擁有兩種機(jī)制終止RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄，它們分別稱為順式終止和反式終止。,介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄順式終止的內(nèi)源性終止子,內(nèi)源性終止子結(jié)構(gòu)的組成為富含GC堿基的發(fā)夾結(jié)構(gòu)以及下游的寡聚U鏈（通常是6個(gè)U）。它們由DNA上的終止

21、子序列編碼，出現(xiàn)在轉(zhuǎn),5 A U C G C,A U,A U,U A,C G,C G,C G,G C,A U,A U,A U,C G,A G,G C,U A,U A,C U,C G,G C,G C,G,A,G,U,A,G U,RNA聚合酶,U U U U U U 3,錄中的RNA結(jié)構(gòu)中。,真核生物的轉(zhuǎn)錄終止機(jī),制也與順式終止相似。,A,G,U,A,U,介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄反式終止的Rho因子依賴性終止子,基因轉(zhuǎn)錄的反式終止多見(jiàn)于噬菌體中。終止位點(diǎn)為CUU中的某個(gè)堿基，其上游 50-90 bp 的序列中無(wú)莖環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，但堿基組成特殊：C 41%，G 14%，A 25%，U 20%。在這種Rho（r）因子專(zhuān)一

22、性識(shí)別的終止子結(jié)構(gòu)內(nèi)，若缺失若干個(gè)C，甚至一個(gè)C，便會(huì)導(dǎo)致不能終止的,RNA聚合酶,Rho因子識(shí)別結(jié)合區(qū),5 AUCGCUACCUCAUAUCCGCACCUCCUCAAACGCUACCUCGACCAGAAAGGCGUCUCUU 3,現(xiàn)象發(fā)生。,反式終止的機(jī)制,Rho因子呈六聚體，具有ATPase,活性。當(dāng)RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄出富含C的,Rho因子識(shí)別位點(diǎn)時(shí)，Rho因子便與轉(zhuǎn),錄出的RNA鏈結(jié)合；,Rho因子沿RNA鏈向RNA聚合酶,方向移動(dòng)，由于其移動(dòng)速度快于RNA,聚合酶，因此當(dāng)RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄出終,止位點(diǎn)CUU時(shí)，Rho因子正好趕上；,Rho因子水解ATP釋放能量，拆,開(kāi)DNA-RNA雜合鏈，

23、轉(zhuǎn)錄遂終止。但,若在Rho因子與RNA聚合酶之間存在,著核糖體，則Rho因子不能終止轉(zhuǎn)錄,CUU,Rho因子,1C 原核生物的RNA結(jié)構(gòu)調(diào)控,b RNA轉(zhuǎn)錄的抗終止作用,在某些特殊條件下，由RNA聚合酶引導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄并不能在終止子處順利終止，這種現(xiàn)象稱為“轉(zhuǎn)錄過(guò)頭”，其發(fā)生,RNA的結(jié)構(gòu)調(diào)控是一種轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)后的基因表達(dá)調(diào)控方式，其主要形式表現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄的終止與抗終止作用。,機(jī)制是細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄抗終止作用。,細(xì)菌衰減子依賴性的轉(zhuǎn)錄抗終止作用,U,G,G,U,G,G,C,G,C,A,C,U,U,C,C,U,G,A,A,C,C,5 ,A,C,U,A,U,G,U,G,A,C,G,G,G,U,C,A,A,U,G,C

24、,G,U,A,A,A,G,C,A,A,U,C,A,G,A,U,A,C,C,C,A,G,C,C,C,G,C,C,U,C,G,G,G,C,G,G,A,U,U,A,A,U,U,U,U,U,U,U, 3,另一個(gè)則位于正常的基因編碼區(qū)下游。細(xì)胞內(nèi)條件的變化，可使基因的轉(zhuǎn)錄在兩個(gè)順式終止子結(jié)構(gòu)的某一個(gè)處終止。這種結(jié)構(gòu)稱,某些細(xì)菌的結(jié)構(gòu)基因含有兩個(gè)順式終止子，其中一個(gè)位于基因上游的編碼區(qū)內(nèi)，,為衰減子。,相互轉(zhuǎn)換,細(xì)菌衰減子的轉(zhuǎn)錄抗終止機(jī)制,大腸桿菌的色氨酸操縱子中含有,一個(gè)衰減子結(jié)構(gòu)。在基因的5端,編碼區(qū)有兩個(gè)連續(xù)排列的色氨酸,密碼子。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)色氨酸匱乏時(shí),核糖體在色氨酸密碼子處暫停翻,譯，衰減子的2鏈和

25、3鏈形成雙鏈,結(jié)構(gòu)，第一個(gè)終止子結(jié)構(gòu)不能形,成，轉(zhuǎn)錄繼續(xù)進(jìn)行；當(dāng)細(xì)胞內(nèi)色,氨酸充足時(shí)，翻譯不在色氨酸密,碼子處停止，結(jié)果產(chǎn)生終止子結(jié),構(gòu)，轉(zhuǎn)錄遂終止。,噬菌體抗終止因子依賴性的轉(zhuǎn)錄抗終止作用,大腸桿菌 l 噬菌體早早期基因和早期基因的表達(dá)產(chǎn)物往往是晚期,基因表達(dá)的調(diào)控因子。早早期基因表達(dá)產(chǎn)物的調(diào)控機(jī)制有兩種：,一是作為 s 因子識(shí)別早期基因和晚期基因啟動(dòng)子，啟動(dòng)表達(dá)這兩,組基因；二是作為轉(zhuǎn)錄抗終止因子，使宿主細(xì)胞的RNA聚合酶轉(zhuǎn),錄過(guò)頭，導(dǎo)致早期基因和晚期基因的表達(dá)。這兩種方式均為正調(diào),控作用。,噬菌體抗終止因子的作用,大腸桿菌l噬菌體感染大,腸桿菌后，在PL啟動(dòng)子的介,導(dǎo)下表達(dá)出抗終止因子N

26、蛋,白，它以一種獨(dú)特的方式使,阻止Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止作,用，使早早期基因轉(zhuǎn)錄過(guò)頭,并轉(zhuǎn)錄出早期基因的mRNA,N蛋白的半衰期只有五,分鐘，它決定了早期基因表,達(dá)周期的長(zhǎng)短。,tL1,tR1,PL,PR,N,cro,左向轉(zhuǎn)錄單位,右向轉(zhuǎn)錄單位,抗終止因子 N,tL1,tR1,抗終止因子的工作原理,大腸桿菌 l 噬菌體的抗,終止因子N特異性識(shí)別早早,期基因內(nèi)部的nut位點(diǎn)，并且,在RNA聚合酶到達(dá)這里時(shí)與,之結(jié)合，形成復(fù)合物。這種,復(fù)合物能有效抑制Rho因子,的結(jié)合作用，從而干擾Rho,因子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄終止效應(yīng)，,導(dǎo)致早早期基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)頭,Q因子以類(lèi)似的機(jī)制使,得早期基因轉(zhuǎn)錄過(guò)頭。,啟動(dòng)子,終止子

27、,RNA聚合酶,nut 位點(diǎn),r 因子,NusB / NusE,NusA NusG,N,CGCTCTTANNNNNNNNNAGCCCTGAAPuAAGGGCA,GCGAGAATNNNNNNNNNTCGGGACTTPyTTCCCGT,1D 真核生物的RNA剪切調(diào)控,真核生物大多數(shù)的分裂基因（即含有內(nèi)含子的基因）在轉(zhuǎn)錄后必須切除內(nèi)含子序列。正常剪切時(shí)，外顯子的序列和個(gè)數(shù)是恒定不變的；但有些基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物會(huì)出現(xiàn)剪切多樣性（另類(lèi)剪切模式），即一種基因轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生多種不同的mRNA，其中包括外顯子的缺失或內(nèi)含子的保留。甚至在某些細(xì)胞內(nèi)，這些由于剪切多樣性而產(chǎn)生的不同蛋白質(zhì)會(huì)同時(shí)出現(xiàn)，并且均為細(xì)胞正常生物功

28、能所必需。據(jù)統(tǒng)計(jì)，哺乳動(dòng),物體內(nèi)表達(dá)的基因90%以上是被另類(lèi)剪切的。,1D 真核生物的RNA剪切調(diào)控,a RNA前體的正常剪切與另類(lèi)剪切,內(nèi)含子保留,5另類(lèi)剪切,3另類(lèi)剪切,外顯子跳越,外顯子相互排除,外顯子組合選擇,啟動(dòng)子另類(lèi)剪切,多聚尾另類(lèi)剪切,pA,pA,1D 真核生物的RNA剪切調(diào)控,b RNA前體的另類(lèi)剪切導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能的多樣化,CaMKIId 基因,E13,E14,E15,E16,E17,dA 蛋白,dB 蛋白,dC 蛋白,1D 真核生物的RNA剪切調(diào)控,c 黑腹果蠅性別決定與剪切多樣性的關(guān)系,黑腹果蠅的性別決定過(guò)程由三個(gè)性別特異性的RNA剪切程序支配，涉及到三個(gè)與性別決定有關(guān)的基

29、因：,Sxl tra dsx,果蠅胚胎性別決定的最初機(jī)制 （PRINCIPLES OF GENETICS，2010）,Sxl-RNA,XX型胚胎,XY型胚胎,Sex-lethal gene Sxl X-linked,拮抗作用,Sxl 基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的另類(lèi)剪切導(dǎo)致雌性細(xì)胞產(chǎn)生SXL蛋白,XX型胚胎,XY型胚胎,Sxl gene,PM,PE,E2,E3,E4 - E8,PM,PE,E2,E3,E4 - E8,含終止密碼子,含終止密碼子,Pre-mRNA,Sxl-mRNA,SXL protein,Pre-mRNA,Sxl-mRNA,SXL protein,No function,由最初機(jī)制控制另類(lèi)剪切

30、,隨后由自身控制另類(lèi)剪切,tra 基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的另類(lèi)剪切導(dǎo)致雌性細(xì)胞產(chǎn)生Tra蛋白,tra 基因,雄性細(xì)胞 正常剪切,雌性細(xì)胞 另類(lèi)剪切,TRA 200 aa,SXL蛋白在XX型胚胎（即未來(lái)的雌性個(gè)體）中的特異性產(chǎn)生，鞏固了果蠅胚胎發(fā)育性別決定的基礎(chǔ)。最新的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果（2011）也證實(shí)：SXL過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致原始生殖細(xì)胞分化為卵細(xì)胞；而SXL表達(dá)抑制則使原始生殖細(xì)胞分化為精細(xì)胞。Sxl蛋白含有高比例的Arg和Ser殘基，類(lèi)似于其它的RNA結(jié)合蛋白，是tra基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物另類(lèi)剪切的調(diào)控因子：,No function,SXL,終止密碼子,dsx 基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的多樣性剪切導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生Dsx兩性蛋白,與t

31、ra不同，另一個(gè)tra基因（tra2）的轉(zhuǎn)錄物只有一種剪切模式，因而在XX和XY兩種類(lèi)型的胚胎中，TRA2蛋白均存在。TRA和TRA2蛋白均含有剪切所必需的Arg-Ser型RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，它們共同調(diào)控位于常色體,上的兩性基因dsx（doublesex）轉(zhuǎn)錄物的剪切模式：,dsx 基因,雌性特異性蛋白,雄性特異性蛋白,E1,E5,E4,E2,E3,E6,TRA2,TRA + TRA2,終止密碼子,dsx 基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的多樣性剪切導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生Dsx兩性蛋白,Sxl,tra,tra2,dsx,Sxl RNA,tra RNA,tra2 RNA,dsx RNA,Sxl mRNA,tra mRNA,tr

32、a2 mRNA,dsx mRNA,轉(zhuǎn)錄,剪切,翻譯,XX,XY,雌性 蛋白,雄性 蛋白,雌性蛋白阻遏雄性發(fā)育基因表達(dá)；雄性蛋白阻遏雌性發(fā)育基因表達(dá),1E 原核生物反義RNA的調(diào)控,反義RNA是指能與mRNA、DNA片段、RNA引物互補(bǔ)的RNA分子。通過(guò)與RNA引物、基因DNA片段、mRNA鏈的互補(bǔ)配對(duì)，分別抑制基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯過(guò)程。原核生物的反義RNA由反義基因編碼，其本身的轉(zhuǎn)錄可為蛋白因子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄而正調(diào)控；,亦可由蛋白因子降解反義RNA而負(fù)調(diào)控。,反義RNA在原核生物中廣泛存在，是一種較為普遍的基因表達(dá)調(diào)控方式。目前，根據(jù)反義RNA原理設(shè)計(jì)的各類(lèi)反義核酸，在實(shí)驗(yàn)生物學(xué)領(lǐng)域已被廣泛用于基

33、因表達(dá)的特異性阻遏劑；在醫(yī)學(xué),藥學(xué)領(lǐng)域也被用來(lái)治療惡性腫瘤及病毒感染等疾病，即反義技術(shù)。,1E 原核生物反義RNA的調(diào)控,a 反義RNA抑制DNA復(fù)制,直接抑制機(jī)理：反義RNA直接與DNA的復(fù)制起始位點(diǎn)結(jié)合，阻,間接抑制機(jī)理：反義RNA與RNA引物結(jié)合，使之不能與DNA復(fù)制模板互補(bǔ)，從而間接影響DNA的復(fù)制。如大腸桿菌ColE1質(zhì)粒的復(fù),礙復(fù)制起始蛋白的識(shí)別與結(jié)合，導(dǎo)致DNA復(fù)制不能啟動(dòng)。,制、金黃色葡萄球pT181質(zhì)粒的復(fù)制均采用這種機(jī)制。,控制復(fù)制引物與模板的結(jié)合,ori,E.coli ColE1 plasmid,復(fù)制方向,rop,（+）,Rop,RNA II,RNA I,3,5,5,3,

34、反義RNA間接抑制ColEI質(zhì)粒的復(fù)制啟動(dòng),引物型RNA,調(diào)控型RNA,1E 原核生物反義RNA的調(diào)控,b 反義RNA抑制基因轉(zhuǎn)錄,P 1,P 2,反義RNA能以兩種不同的方式改變編碼在相反鏈上的基因的轉(zhuǎn)錄；即轉(zhuǎn)錄干擾和轉(zhuǎn)錄衰減轉(zhuǎn)錄干擾發(fā)生在從一個(gè)啟動(dòng)子,反義RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄干擾效應(yīng),處起始的轉(zhuǎn)錄阻遏第二個(gè)啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。例如，丙酮丁醇梭菌從S-box反義RNA的啟動(dòng)子處轉(zhuǎn)錄出的反義RNA能阻斷相反DNA鏈上編碼的,操縱子ubiG-mccBA的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)。,轉(zhuǎn)錄干擾,1E 原核生物反義RNA的調(diào)控,b 反義RNA抑制基因轉(zhuǎn)錄,P 1,P 2,反義RNA也可與靶mRNA的5-端序列互補(bǔ)從而阻止靶m

35、RNA的繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，使之產(chǎn)生非成熟性的轉(zhuǎn)錄物（即轉(zhuǎn)錄衰減效,反義RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄衰減效應(yīng),應(yīng)）。例如：大腸桿菌中的tic-RNA（轉(zhuǎn)錄抑制互補(bǔ)性RNA）可與cAMP受體蛋白的5端mRNA區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合，形成特殊的空間結(jié)構(gòu)迫使其轉(zhuǎn)錄,停止。,轉(zhuǎn)錄衰減,1E 原核生物反義RNA的調(diào)控,c 反義RNA抑制mRNA翻譯,反義RNA主要的調(diào)控功能表現(xiàn)在翻譯水平上。原核生物的研究已經(jīng)確定，反義RNA抑制翻譯有下列三種作用方式：,與mRNA的5端非編碼區(qū)（5-UTR）結(jié)合，阻礙其在核糖體上的準(zhǔn)確定位；,與mRNA的5端編碼區(qū)（主要是起始密碼子AUG）結(jié)合，抑制翻譯的起始；,與mRNA全編碼區(qū)結(jié)合，抑制其翻譯模板

36、的功能。,大腸桿菌利用反義基,大腸桿菌的ompC和ompF基因編碼外膜蛋白，OmpC使胞內(nèi)滲透壓提高；OmpF使胞內(nèi)滲透壓降低。當(dāng)環(huán)境滲透壓增加時(shí)，膜蛋白EnvE激活胞內(nèi)的OmpR蛋白，后者誘導(dǎo)ompC和micF兩個(gè)基因轉(zhuǎn)錄。micF轉(zhuǎn)錄物是ompF-mRNA的反義RNA，它能滅活ompF-mRNA，從而降低胞內(nèi)OmpF的濃度。,因調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓,UUUUUU CUUUAUCCC-CAUUUGUCUGUAAGUCUUUACUUACUGCAUUAUUUAUUACU,GACGGGCAGUGG-CAGGUG-UCAUAAA AUGAGGUAAUAAAUAAUGA,U,U,GACAGAACUUA,A

37、,C,A,C,A,A,A,U,U,A,A,G,C,G,C,C,G,U,G,U,A,A,U,C,G,G,C,G,C,U,U,U,U,C,A,GAGG：SD序列,A,AUG：起始密碼子,EnvE,OmpR,micF,ompF,ompF mRNA,micF RNA,大腸桿菌利用反義基,大腸桿菌的R1質(zhì)粒上含有hok和sok基因。hok編碼由52個(gè)氨基酸組成的穩(wěn)定的毒素蛋白，能使細(xì)胞膜去極化而殺死細(xì)胞。Sok編碼hok的反義RNA。當(dāng)細(xì)胞分裂時(shí)，如果子細(xì)胞沒(méi)有分配到R1質(zhì)粒，HoK蛋白就會(huì)殺死子細(xì),因維持質(zhì)粒的穩(wěn)定性,細(xì)胞，因?yàn)橛H本細(xì)胞中Sok轉(zhuǎn)錄出來(lái)的反義RNA不穩(wěn)定而被降解；如果子細(xì)胞分配到R1質(zhì)

38、粒，則Sok基因就能源源不斷地為子細(xì)胞提供反義RNA，以阻斷半衰期較長(zhǎng)的hok mRNA翻譯出HoK毒素蛋白，細(xì)胞得以存活。該hok/sok系統(tǒng)保證了細(xì)菌品系的穩(wěn)定性,1E 原核生物反義RNA的調(diào)控,d 反義技術(shù)在實(shí)驗(yàn)生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用策略,受反義RNA特異性阻斷基因表達(dá)的原理啟發(fā)，人們利用生物合成甚至化學(xué)合成的方法，制備了一系列針對(duì)特定病變基因（如癌基因）或病原體基因的反義試劑或反義藥物，一方面期望通過(guò)這些特異性的基因表達(dá)阻斷試劑，體內(nèi)探查特定基因的功能（即所謂的loss-of-function戰(zhàn)略）；另一方面也希望能利用這些反義藥物對(duì)付日趨嚴(yán)重的基因分子疾病和病毒感染疾病。,由靶基因的反

39、向表達(dá)體內(nèi)生成相應(yīng)的反義RNA,將靶基因的編碼序列反向接在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的下游，轉(zhuǎn)錄出來(lái)的RNA即為靶基因,5,3,5,3,5,3,5,3,啟動(dòng)子,終止子,target GENE,target GENE,mRNA,antisense RNA,會(huì)降解RNA。,這種戰(zhàn)略缺點(diǎn)在于：反義RNA分子量大，容易引起體內(nèi)免疫攻擊另外，核酸酶也,的反義RNA。,人工設(shè)計(jì)合成修飾型的小分子反義RNA,鎖核酸 LNA,肽核酸 PNA,核糖核酸 RNA,人工設(shè)計(jì)合成修飾型的小分子反義RNA,RNA,SNA,反義嗎啉寡聚核苷酸 anti-MO oligo,RNA靶分子,人工設(shè)計(jì)合成修飾型的小分子反義RNA,1F 真核生

40、物sRNA介導(dǎo)的RNA干擾,RNA分子在遺傳信息從DNA到蛋白質(zhì)的傳遞過(guò)程中扮演著重要的角色，但幾十年來(lái)有關(guān)RNA的消息只能聽(tīng)到微弱的聲音。近十幾年來(lái)接連不斷的發(fā)現(xiàn)表明，一類(lèi)被稱為小RNA（small RNAs）的物質(zhì)操縱著很多生命過(guò)程。它們能改變基因的表達(dá)水平甚至關(guān)閉基因、編輯基因組、哄騙細(xì)胞形成特定的組織。因此該領(lǐng)域的研究成果被Science雜志連續(xù)兩年（2001-2002）評(píng)為年度十大科,成就之一。,1F 真核生物sRNA介導(dǎo)的RNA干擾,a RNA干擾作用的發(fā)現(xiàn),1993年，康奈爾大學(xué)的Su Guo在用人工合成的反義RNA阻斷線蟲(chóng)基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)中偶然發(fā)現(xiàn)，反義RNA和正義RNA都能阻斷

41、靶基因的表達(dá)，他對(duì)這個(gè)結(jié)果百思不得其解。直到1998年，美國(guó)卡內(nèi)基研究所的Andrew Fire用確鑿的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，在正義RNA阻斷基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)中，真正起作用的是小分子的雙鏈RNA，它們是體外轉(zhuǎn)錄正義RNA時(shí)生成的。上述雙鏈RNA對(duì)基因表達(dá)的阻斷作用稱為RNA干擾（RNAi）。隨后大量的研究發(fā)現(xiàn)，RNAi 現(xiàn)象廣泛存在于線蟲(chóng)、果蠅、斑馬魚(yú)、真菌、植物、哺乳動(dòng)物乃至人體內(nèi)，它們借助于RNAi 抵御病毒的感染，,阻斷轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座作用，以維持其基因組的相對(duì)穩(wěn)定性。,1F 真核生物sRNA介導(dǎo)的RNA干擾,a RNA干擾作用的發(fā)現(xiàn),RNA干擾與先前所說(shuō)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默、轉(zhuǎn)基因沉默等術(shù)語(yǔ)都是一回事，

42、但常與基因表達(dá)的反義抑制相混淆。反義抑制過(guò)程并不涉及mRNA的催化降解，只是單鏈反義RNA物理上與mRNA結(jié)合并阻斷其翻譯。Andrew Fire 和 Craig Mello因他們關(guān)于線蟲(chóng)RNA干擾的研究（1998）而分享2006年的諾,貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。,b RNA干擾的作用機(jī)理,外源性的雙鏈RNA，不管來(lái)自病毒RNA基因組的感染還是人工的導(dǎo)入，均在細(xì)胞質(zhì)中被Dicer酶裁剪成22-24bp的短小雙鏈片段，即 small interfering RNA（siRNA），其3端含有兩個(gè)凸出的堿基，負(fù)責(zé)siRNA的遷移和對(duì)靶序列的識(shí)別。在RISC復(fù)合物的協(xié)助下，雙鏈siRNA拆成單鏈，然后再與具

43、有互補(bǔ)序列的靶mRNA分子結(jié)合，形成局部雙鏈。后者或遭RNase的降,解，或直接阻斷靶mRNA的翻譯。,AGO 復(fù)合物,AGO 復(fù)合物,1F 真核生物sRNA介導(dǎo)的RNA干擾,c 細(xì)胞內(nèi)固有的miRNA,前已述及，siRNA是由體外來(lái)源的雙鏈RNA經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的Dicer酶加工,的sRNA被命名為：microRNA（miRNA）。,進(jìn)一步的探索發(fā)現(xiàn)：在動(dòng)物、植物、真菌的細(xì)胞核內(nèi)，從結(jié)構(gòu)致密的異染色質(zhì)中心粒區(qū)域的DNA重復(fù)序列上會(huì)轉(zhuǎn)錄出一些特殊的RNA前體大分子，它們同樣在類(lèi)似蛋白因子的作用下，形成長(zhǎng)度為21-23個(gè)堿基的單鏈sRNA分子，并發(fā)揮特殊的生物學(xué)功能。這種細(xì)胞內(nèi)編碼的固有,而成的。那么細(xì)

44、胞內(nèi)是否也存在著固有的RNA類(lèi)似物呢？,miRNA的形成,首先從異染色質(zhì)中心粒區(qū)域的DNA重復(fù)序列上轉(zhuǎn)錄出大分子的非編碼型RNA前體（pri-miRNA），后者在核內(nèi)被微加工器復(fù)合物（由RNaseIII組成）先切成大約70個(gè)核苷酸的莖環(huán)結(jié)構(gòu)（pre-miRNA），然后再被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中由Dicer進(jìn)一步裁剪，形成成熟的miRNA分子，最后再由幾種因子裝配而成。,Science 319, 1787, 2008,miRNA的生物功能,異染色質(zhì)裝配,外成性修飾,轉(zhuǎn)錄調(diào)控,轉(zhuǎn)錄物剪切調(diào)控,轉(zhuǎn)錄物穩(wěn)定調(diào)控,翻譯抑制,結(jié)構(gòu)域構(gòu)成,（Lewins GENES X 2010）,miRNA介導(dǎo)的翻譯抑制模式,A

45、AAAA,AAAAA,AAAAA,AGO,RISC：AGO + GW182,核糖體,抑制翻譯延伸,AAAAA,AA,AGO,AA,降解翻譯產(chǎn)物,競(jìng)爭(zhēng)帽子結(jié)構(gòu),Cap,抑制核糖體裝配,抑制mRNA環(huán)化,AGO,GW182,mRNA,觸發(fā)剪尾脫帽,DCP2,miRNA,1F 真核生物sRNA介導(dǎo)的RNA干擾,d RNA干擾原理的應(yīng)用,如果將外源的雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞中，則雙鏈RNA分子一方面在Dicer的作用下裂解成siRNA；另一方面在以RNA為模板的RNA聚合酶RdRP的作用下自身擴(kuò)增，其擴(kuò)增產(chǎn)物再被Dicer裂解成siRNA。后者解鏈并與RISC復(fù)合物一起作用于靶mRNA上，一方面使其降解，另

46、一方面又以siRNA作為引物，mRNA為模板，在RdRP催化下合成出mRNA的互補(bǔ)鏈，結(jié)果mRNA也變成了雙鏈RNA。它在Dicer的作用下也同樣被裂解成siRNA。通過(guò)這種體內(nèi)的RNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，細(xì)胞內(nèi)的siRNA大大增加，顯著增加了對(duì)基因表達(dá)的抑制。相關(guān)研究結(jié)果表明，從21-23個(gè)堿基的siRNA到幾百堿基對(duì)的雙鏈RNA都能誘發(fā)RNA干擾作用，但長(zhǎng)的雙鏈RNA阻斷基因表達(dá)的效果明顯優(yōu)于短的雙,鏈RNA。需要指出的是，人類(lèi)和果蠅體內(nèi)不存在RdRP，故無(wú)法進(jìn)行上述siRNA擴(kuò)增。,1F 真核生物sRNA介導(dǎo)的RNA干擾,d RNA干預(yù)原理的應(yīng)用,上述RNA干擾原理在分子生物學(xué)研究領(lǐng)域中的用途包括：,通過(guò)基因表達(dá)的特異性阻斷作用，確定基因的功能,通過(guò)基因表達(dá)的特異性阻斷作用，實(shí)施基因治療,然而，如何將特定的雙鏈RNA分子高效導(dǎo)入活細(xì)胞、活組織、活生物個(gè)體中，并維持其穩(wěn)定性，目前還是一個(gè)技術(shù)難題。,1F 真核生物sRNA介導(dǎo)的RNA干擾,e 生物體內(nèi)的RNA世界,RNA,蛋白質(zhì)編碼型RNA,非蛋白質(zhì)編碼型RNA,rRNA,tRNA,anti