細胞培養(yǎng)的設備和操作技術(shù).ppt

1、細胞培養(yǎng)的設備和操作技術(shù),第二章,主講內(nèi)容,實驗室的設計和基本操作技術(shù) 培養(yǎng)基及其配制,第一部分 實驗室的設計,細胞工程實驗室它必須滿足三個基本的需要，即： 實驗準備（培養(yǎng)基配制，洗滌與滅菌）； 無菌操作； 控制培養(yǎng)。,從總體上來分，實驗室主要分為兩類： 基本實驗室： 輔助實驗室：,實驗室設計,1、基本實驗室： 準備室 接種室 培養(yǎng)室, 作用 植物細胞和組織培養(yǎng)所需器具的洗滌、干燥和保存；培養(yǎng)基的配制、分裝和滅菌；化學試劑的配制；重蒸餾水的生產(chǎn)等。 設計要求 面積20m2左右。通風透光，地面防滑，墻面防潮。,準備室, 實驗臺架 大、小水槽 烘箱 冰箱 天平系列 pH計 高壓消毒鍋 各種玻璃器皿

2、 藥品柜 （磁力）攪拌器 電爐 蒸餾水器, 設 備,其中：玻璃器皿包括三角瓶、試管、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、燒杯、量筒、移液管等 移液槍（根據(jù)條件需要）由槍和槍頭組成 其他：鍋、微波爐等,磁力攪拌器,電子天平,萬分之一,百分之一,pH計,微量移液器,蒸餾水器,接種室 也叫無菌操作室 無菌操作室并非無菌，但應該保持清潔 作用 供外植體的接種，培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)移和原生質(zhì)體的游離培養(yǎng)操作之用。, 設計要求 墻壁光滑平整，地面平坦無縫，除出入口和通氣口外，應當密閉，空氣不能對流，或者空氣經(jīng)凈化后進入室內(nèi)。 無菌室旁邊應設有緩沖間，緩沖間內(nèi)應有紫外燈，隨時可進行滅菌。,無菌室內(nèi)的日常滅菌：定期用甲醛和高錳酸鉀混合后熏

3、蒸，產(chǎn)生大量蒸汽，殺滅微生物。 使用前處理：用新潔爾滅（1：50）擦凈，然后用紫外燈照射滅菌至少20分鐘，操作前用70%酒精噴霧。,思考：紫外燈如何殺菌？操作中要注意什么？, 設 備, 紫外光燈 空調(diào) 放物架（或醫(yī)用小平車：推送、放置培養(yǎng)基用；） 無菌操作用的器具：酒精燈、70%酒精消毒棉、解剖刀、弓背鑷子、解剖針、剪刀等。, 超凈工作臺： 內(nèi)設紫外燈、吹風裝置、過濾裝置等 每次實驗前要用紫外燈滅菌20分鐘以上，然后噴酒精滅菌，工作過程中注意一直開著吹風機，并且一定要關(guān)掉紫外燈，過濾網(wǎng)應經(jīng)常清洗。,其它部件： 離心機：分離原生質(zhì)體用； 點融合儀：細胞融合用。,離體組織和試管苗生長發(fā)育的場所，

4、應為培養(yǎng)物創(chuàng)造適宜的溫、光、氣等條件。 設計要求 培養(yǎng)室內(nèi)要求內(nèi)壁保溫、光滑、室頂高2.6m左右，易于控制溫、濕度，窗上要求裝雙層密封玻璃窗，室內(nèi)有足夠電源。, 作用, 設 備, 空調(diào)機：冷暖型 加熱器 定時裝置：控制光照時間 培養(yǎng)架：放置培養(yǎng)瓶 搖床和轉(zhuǎn)床：懸浮培養(yǎng) 各種光質(zhì)燈管：光照培養(yǎng) 溫度計：控制溫度 遮光簾：供暗培養(yǎng)之用,2、輔助實驗室： 細胞學實驗室 攝影室及暗室 生化分析室,細胞學實驗室, 主要設備 各種顯微鏡，顯微照相設備，切片、制片儀器設備，染色用具，暗房設備等。, 作 用,植物組織和細胞培養(yǎng)過程中，需隨時觀察記錄其細胞學和形態(tài)解剖學的變化，故要設置細胞顯微觀察室。,細胞工程

5、實驗室基本設備配制小結(jié),基本設備：冰箱、天平、酸度計 滅菌設備：蒸汽壓力滅菌鍋、干熱消毒柜、過濾滅菌裝置、噴霧消毒器、紫外燈。 無菌操作設備：凈化工作臺、接種箱, 光溫控制設備：時間程序控制器、空調(diào)及溫度感應器。 細胞培養(yǎng)設備：培養(yǎng)設備根據(jù)需要而定，包括培養(yǎng)架、培養(yǎng)箱、搖床、生物反應器等。 細胞學鑒定設備：光學研究顯微鏡、實體顯微鏡、倒置顯微鏡,第二部分基本操作技術(shù),基本操作技術(shù)主要是圍繞無菌操作技術(shù)展開的一系列操作技能，內(nèi)容主要包括： 一洗滌技術(shù) 二滅菌、消毒技術(shù) 三、接種技術(shù),一、 洗滌技術(shù),、洗滌目的：去除雜物，降低帶菌量 、根據(jù)洗滌對象的不同，主要分為：,器皿洗滌（包括玻璃、塑料、搪瓷

6、、 不銹鋼器皿）,培養(yǎng)材料洗滌,（一）器皿洗滌,根據(jù)洗滌對象的具體情況可分為以下三種：,特殊洗滌,微生物大量污染的洗滌,常規(guī)洗滌, 常規(guī)洗滌, 自來水洗去油漬、霉菌等臟物； 溫肥皂水中浸泡一定時間后用刷子刷凈； 自來水沖洗干凈，至瓶壁不掛水珠為止； 蒸餾水淋洗內(nèi)外壁 將玻璃器皿倒置：晾干或烘干（5075） 放入除塵柜中備用, 微生物大量污染的洗滌 微生物污染器皿加壓滅菌后再洗滌,特殊洗滌（如沾有蛋白質(zhì)類物質(zhì)或其它有機物時) 經(jīng)過常規(guī)洗滌未過蒸餾水的器具，浸泡入洗液（鉻酸洗滌液是用重鉻酸鉀(K2Cr2O7)與硫酸(H2SO4)配制而成）中數(shù)分至數(shù)小時； 回收洗液，器具先用自來水洗凈，蒸餾水淋洗，

7、烘干（75）,（二）、試驗材料的清洗 清洗目的：來自自然界的試驗材料，包括來自土壤中的幼莖、磷莖，滋生著各種微生物，尤其是細菌的芽孢和真菌的孢子，一旦與培養(yǎng)基接觸，就會很快的繁殖起來，造成培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料的污染。 清洗方法：先用自來水沖洗5分鐘，然后用中性洗滌劑清洗，注意勿損傷試驗材料。再用自來水流水沖洗半小時，用于下一步的藥劑滅菌。,二、滅菌、消毒技術(shù),（一）關(guān)于有菌和無菌的概念 有菌的范疇：,凡是暴露在空氣中的物體，至少其表面都是有菌的，如植物的表面、超凈工作臺的臺面，未處理的工具和手等。,高壓高溫處理（工具、器皿、培養(yǎng)基等） 物理或化學處理； 火烤后的物體； 健康的動植物不與內(nèi)外部表面接

8、觸的組織 內(nèi)部可能是無菌的（有時也有內(nèi)生菌，但 不會影響培養(yǎng)，也不會污染）,無菌的范疇：,（二）滅菌、消毒技術(shù)作用和意義 植物組培中，凡用于培養(yǎng)和無菌操作的房間、器具、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)基，培養(yǎng)材料和操作者的衣物和手都應隨時進行滅菌，以確保不受雜菌污染，否則，由于雜菌的生長繁殖速度一般都比培養(yǎng)的組織快得多，最終將把組織全部殺死，這些污染微生物還可能排泄對植物組織有毒的代謝廢物，因此在培養(yǎng)容器內(nèi)部保持一個完全無菌的環(huán)境是絕對必須的。,（三）滅菌、消毒種類,物理方法： 物理滅菌：高溫高壓滅菌（干熱/濕熱）、烘烤或灼燒滅菌、射線處理、超聲波等 物理除菌：過濾（0.1微米、0.22微米、0.45微米、0.8

9、微米等） 、離心沉淀等； 化學方法：使用滅菌劑，如薰蒸滅菌、消毒液滅菌（酒精、升汞、苯酚、漂白精、新潔爾滅、次氯酸鈉、過氧化氫）, 消毒、滅菌的對象： 接種室 材料（外植體）： 完全殺死材料表面的微生物過程： 洗潔精酒精氯化汞等 器皿用具消毒（滅菌） 培養(yǎng)基,（三）、培養(yǎng)基、器具的滅菌 用滅菌鍋滅菌：一般121，滅菌20分鐘。自動鍋：加足水后，調(diào)好時間、溫度、即可自動運轉(zhuǎn)。 手動鍋:加足水后，關(guān)好，通電。待壓力升到0.5kgc時，打開排氣閥排除鍋內(nèi)的冷空氣。然后關(guān)閉排氣閥，升至1.1kg c(121 左右)時計時，用通電、斷電來保持20分鐘。待降至壓力為0時取出。 器具的滅菌：也可用烘箱160

10、 ，90120分鐘,（四）、過濾除菌 培養(yǎng)基的滅菌一般用高壓高溫處理，但如果培養(yǎng)基中某些成分遇到高溫分解（如某些激素GA3、玉米素等），就需要過濾滅菌或者兩者結(jié)合。另外酶等也需要過濾滅菌； 滅菌方法：將激素或酶配成一定濃度，用注射器過慮，0.20.25微米。配制培養(yǎng)基時，先將培養(yǎng)基高壓滅菌，待溫度降至50左右時，加入適量的已過慮除菌的激素等，然后分裝。,（五）、外植體的選擇與消毒：,1、外植體的選擇 選擇優(yōu)良的基因型：蔬菜等作物、花卉等觀賞植 物等的脫毒快繁選優(yōu)良種。 取材：從生長旺盛、健壯、無病蟲害的植株上取 材。母株代謝旺盛期取的外植體再生能力強， 試驗容易成功。 外植體大小選擇：如利用莖

11、尖培養(yǎng)，脫毒快繁， 莖尖大小對脫毒效果非常明顯。再如幼胚培養(yǎng)， 胚齡也非常重要。 選擇外植體的時期,2、外植體的消毒：,取材 將老的組織去掉 自來水沖洗 洗衣粉水洗（簡單殺菌） 自來水沖洗 70酒精處理 消毒劑處理 滅菌蒸餾水沖洗35遍。,消毒時間，因材料老嫩程度不同有所不同。一般，較老的材料相對殺菌時間較長，反之，較短。一般殺菌，酒精10秒，升汞512分鐘。,外植體在接種之前，須經(jīng)嚴格的滅菌，同時又要注意不損傷外植體。不同滅菌藥劑殺菌力不同，故在使用不同的藥劑時，需要考慮使用濃度和處理時間，對不同植物種類的不同外植體，處理也有不同。 另外，外植體在進入消毒劑之前，應認真取材及清洗，盡可能地減

12、少其帶菌量。,外植體除菌注意事項：,消毒劑 使用濃度() 消毒時間(分) 效果 殘液去除難易 次氯酸鈣 10 530 好 易 次氯酸鈉 25 530 好 易 新潔爾滅 1020 530 好 易 氯化汞 0.11 210 最好 最難 過氧化氫 1012 515 較好 最易 抗菌素 450mg/L 3060 較好 較難,幾種常用消毒劑的效果比較,附：常用消毒劑的性質(zhì),7075酒精： 具有較強的穿透力和殺菌力，常作為表面滅菌的第一步，它具有浸潤和滅菌的雙重作用，但不能徹底滅菌，必須結(jié)合其他藥劑滅菌。一般處理時間為530s。為了提高乙醇的殺菌效果，可在乙醇溶液中加入0.1的酸或堿，因為H+和OH-可改

13、變細胞膜帶電荷的性質(zhì)而使透性增加，提高殺菌的效果,升汞（HgCl2）： 劇毒的重金屬鹽殺菌劑，其殺菌原理是Hg2與帶負電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合，使菌體酶蛋白變性失活。使用濃度0.10.2，一般浸泡處理612min就可有效地殺死附著在外植體表面的細菌及真菌，滅菌效果極好。但用升汞滅菌的外植體材料須用無菌水反復多次沖洗，才能洗去殘留的汞，否則會對外植體產(chǎn)生毒害作用。通常用無菌水沖洗不得少于5次。由于升汞的毒性劇烈，使用中務必注意安全。,升汞廢物的處理,升汞為劇毒藥品，一則使用時注意別濺到皮膚上；二則使用后要進行處理，不能直接倒入下水道。,升汞處理方法：,升汞Na2S,絮狀沉淀（至絮狀沉淀不再產(chǎn)生為止）,F

14、eSO4（中和過多的Na2S ）,次氯酸鈉（NaClO）： 用市售的“安替福民”配制210的NaClO，滅菌時間530min，無菌水沖洗45次。由于它分解出具殺菌作用的氯氣，滅菌處理后易于除去，無殘留，既有較強的殺菌力，又對植物無害，是常用的殺菌劑。,過氧化氫（雙氧水）： 常用612的溶液處理外植體材料，滅菌效果較好，由于該藥劑在外植體表面容易除去，又不會損傷外植體，通常用于葉片材料的滅菌。,新潔爾滅： 一種廣譜的表面活性滅菌劑，它對絕大多數(shù)植物外植體傷害很小，滅菌效果很好。通常使用1：200稀釋液，處理30min或更長。,在用上述藥劑進行材料的滅菌處理時，為了使殺菌劑濕潤整個組織，有時還需在

15、藥液中加入潤濕劑。如加入數(shù)滴或0.1的吐溫（Tween）80或吐溫20，或者用磁力攪拌、超聲振動等方法使殺菌劑充分接觸外植體，以利于徹底滅菌。,三、接種技術(shù),1所有的消毒、接種等無菌操作技術(shù)均需在無菌室的超凈工作臺上進行。 1、超凈工作臺： 內(nèi)設紫外燈、吹風裝置、過濾裝置等，每次實驗前要用紫外燈滅菌20分鐘以上，然后噴酒精滅菌，工作過程中注意一直開著吹風機，并且一定要關(guān)掉紫外燈，過濾網(wǎng)應經(jīng)常清洗。 2、無菌操作用的器具：刀、鑷子、剪刀、酒精燈等事先已滅菌，使用中避免交叉污染； 3、操作人員在操作之前洗手、換工作服、雙手消毒再操作。,培養(yǎng)條件 光照:光照強度、光質(zhì)、光照時間 溫度 濕度 pH值：

16、5.56.5 滲透壓 通氣條件,根據(jù)離體培養(yǎng)的營養(yǎng)需求，培養(yǎng)基至少包括： 無機鹽； 有機化合物； 生長調(diào)節(jié)劑,三、 培養(yǎng)基及其配制,培養(yǎng)基的基本成分,Fe、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、B,1 無機營養(yǎng)物質(zhì),、大量元素：,C、H、O,N、P、K、Ca、Mg、S、(Na),、微量元素：,無機鹽的作用：, 一是組成各種化合物，參與機體的建造，成為結(jié)構(gòu)物質(zhì)； 二是構(gòu)成一些特殊的生理活性物質(zhì)，如植物激素、酶以及酶的活化劑，參與植物的代謝活動； 三是這些元素之間相互協(xié)調(diào)，以維持離子濃度平衡、膠體穩(wěn)定、電荷平衡等生物電化學方面的作用； 四是在發(fā)育過程中，影響組織器官的建成。,濃度：2%-3%,2 有機物質(zhì)

17、,糖：,作用：,維持培養(yǎng)基合適的滲透壓 為細胞提供合成新物質(zhì)的碳骨架 為細胞的呼吸代謝提供底物和能量,種類：蔗糖、葡萄糖 麥芽糖、果糖等 多糖：可溶性淀粉,維生素： 硫胺素(VB1)、煙酸（VB3又稱VBPP ） 、泛酸(VB5)、吡哆醇(VB6)、酸銨、鈷胺素(VB12)、葉酸(VM又稱VB11)、抗壞血酸(VC)等等.,作用：利于細胞代謝和器官分化。 B1是植物組培必須加入的維生素，其用量在0.1-30 mg/L之間，當組培中細胞分裂素特別少時，B1更為需要；煙酸和B6可促進細胞生長,氨基酸：甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、 天冬酰胺、丙氨酸等等。因培養(yǎng)基的種類不同，其添加種類

18、和 濃度不同。 肌醇：又稱環(huán)己六醇，促進糖類的相互轉(zhuǎn)化，維生素、 激素的利用作用，使培養(yǎng)物快速生長 。 腺嘌呤、硫酸鹽等激素：加入培養(yǎng)基時，可促進芽、根的形成和生長。根 據(jù)培養(yǎng)基的植物不同，決定是否添加。,瓊脂:是從海藻中提取的一種高分子碳 水化合物，其主要作用是使培養(yǎng)基在常溫下凝固，但不參與代謝。 活性炭:主要目的是利用其吸附能力，減少一些有害物質(zhì)的影響，如可以防止酚類物質(zhì)污染而引起組織褐化死亡。,3、附加物,這類物質(zhì)為非植物細胞生長所必須，但對細胞 生長有利,主要包括瓊脂和活性炭。, 作用：提供一些必要的微量營養(yǎng)成分、 生理活性物質(zhì)和生長激素等。 這類物質(zhì)常指天然提取物 ： 麥芽提取物、

19、椰乳、 鮮果汁、 酵母提取物,4、 其它有益有機添加物或未知復合成分,5、pH值： 即酸堿度，培養(yǎng)的植物材料大多數(shù)要求弱酸性的環(huán)境，一般將培養(yǎng)基調(diào)整至pH5.65.8。常用0.1mol/l氫氧化鈉或鹽酸來調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH。 注意： 第一、經(jīng)高溫高壓滅菌后，培養(yǎng)基的pH會下降0.2-0.8,故調(diào)整后的pH應該高于目標pH 0.5個單位； 第二、 pH的大小會直接影響到瓊脂的凝固能力，一般pH 大于6.0時，培養(yǎng)基就會變硬，低于5.0時瓊脂就不能很好地凝固。,6、激素,在培養(yǎng)基中，其各種成分對培養(yǎng)物影響最大的最顯著的就是激素。激素的種類、濃度、以及配比都會顯著的影響愈傷組織的形成、不定根、不定芽的

20、分化，胚狀體的形成等； 組織培養(yǎng)中使用的激素有的是天然的，如脫落酸（ABA）等，有的是合成的，如二氯苯氧乙酸（2，4D）。,（一）、激素的種類,1、生長素,2、細胞分裂素,3、赤霉素,4、脫落酸,1、生長素類, 生長素是指能引起完整組織中的細胞擴展的化合物。 在自然界中，即內(nèi)生生長素影響莖和莖節(jié)的伸長、向性、頂端優(yōu)勢、葉片脫落和生根等現(xiàn)象 在組織培養(yǎng)中的主要作用是：誘導愈傷組織的產(chǎn)生，促進細胞脫分化，促進細胞的伸長，促進生根。, 組織培養(yǎng)中常用的生長素有： 二氯苯氧乙酸（2，4D） ； 萘乙酸（NAA） 吲哚乙酸（ IAA ） ； 吲哚3丁酸（IBA） 萘氧乙酸（NOA） ； 對氯苯氧乙酸（P

21、-CPA） 三氯苯氧乙酸（2，4，5 T）； 生根粉（ABT） NAA 、IAA、 IBA易引起生根， 2，4D 、2，4，5 T有利于愈傷組織的誘導和生長。,主要作用：是誘導愈傷組織的形成、胚狀體的產(chǎn)生以及試管苗的生根，更重要的是配合一定比例的細胞分裂素誘導腋芽及不定芽的產(chǎn)生； 作用的強弱順序為： 2，4-DNAAIBAIAA,溶解方法： 0.1M NaOH或95酒精，以前者為好 保存： 配成一定濃度后，冰箱冷藏保存,2、細胞分裂素 自然界中，細胞分裂素影響細胞分裂，頂端優(yōu)勢的變化和莖的分化等； 組織培養(yǎng)中，細胞分類素主要促進細胞分裂和愈傷組織上或器官上分化不定芽，葉片擴大和莖長高，抑制根的

22、生長。細胞分裂素常常與生長素相互配合，用以調(diào)節(jié)細胞分裂，細胞伸長，細胞分化和器官形成。,常用的細胞分裂素有：, 6芐基嘌呤（BAP） ； 6芐基腺嘌呤（6BA）； 激動素（呋喃氨基嘌呤、Kinetin、KT）； 玉米素（ZT）； 異戊烯氨基嘌呤（2IP） 噻二唑苯基脲（ thidiazuron、 TDZ ）； 溶解方法：0.1MHCL 保存：配成一定濃度后，冰箱冷藏保存,主要作用：促進細胞的分裂和器官的分化、延緩組織的衰老、增強蛋白質(zhì)的合成、抑制頂端優(yōu)勢、促進側(cè)芽的生長及顯著改變其他的激素作用； 作用的強弱順序為：ZT2-iP6-BAKT。,3、赤霉素,赤霉素能夠打破休眠、促進果實成長等效果；

23、 赤霉素有20多種，其中在組織培養(yǎng)中最常用的是GA3； 已經(jīng)用于頂端分生組織的培養(yǎng)和維管分化的研究；能刺激不定胚發(fā)育成正常小植株；在培養(yǎng)基中很少添加，因為它的作用往往是負面的。,溶解方法：95酒精 保存：配成一定濃度后，冰箱冷藏保存； 赤霉素易溶于水，但溶于水后不穩(wěn)定，容易分解； 滅菌：高溫分解，過濾滅菌。,4、脫落酸,脫落酸能阻礙發(fā)育、促進老化、形成休眠芽等作用； 加上脫落酸能抑制生長，使繼代培養(yǎng)時間延長； 溶解方法：95酒精； 保存：配成一定濃度后，冰箱冷藏保存。,（二）、常見培養(yǎng)基中植物激素配方類型,（三）、常見生長調(diào)節(jié)劑及主要性能一覽表,（四）、常見生長調(diào)節(jié)劑的微摩爾/升濃度與毫克/升

24、的轉(zhuǎn)換,三、常用培養(yǎng)基的種類、配方及其特點 （一）、培養(yǎng)基的種類 1、培養(yǎng)基，根據(jù)其態(tài)相不同分為固體培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基是指加凝固劑的培養(yǎng)基；液體培養(yǎng)基是指不加凝固劑的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基加入一定量的凝固劑，加熱溶解后，分別裝入常用的培養(yǎng)基中冷卻后即得到固體培養(yǎng)基。 2、根據(jù)培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程，培養(yǎng)基分為初代培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基。初代培養(yǎng)基是指用來第一次接種外植體的培養(yǎng)基。繼代培養(yǎng)基是指用來接種繼初代培養(yǎng)基之后的培養(yǎng)物的培養(yǎng)物。,3、根據(jù)其作用不同，培養(yǎng)基分為誘導培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基。 4、根據(jù)其營養(yǎng)水平不同，培養(yǎng)基可分為基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基。基本培養(yǎng)基（就是通常稱呼的培養(yǎng)基）主要有MS、White、 N6、B5 、改良MS、Heller、Nitsh、SH、 Miller等。完全培養(yǎng)基就是基本培養(yǎng)基的基礎上，根據(jù)試驗的不同需要，附加一些物質(zhì)，如生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和其他復雜有機物質(zhì)等。,（二）幾種常見培養(yǎng)基： MS、N