病毒轉(zhuǎn)基因技術(shù)原理 概述(1)

1、課程背景,1980s, 轉(zhuǎn)基因技術(shù)隨分子克隆技術(shù)出現(xiàn) 2003年，我國SFDA批準(zhǔn)了全球第一種基因治療藥物“今又生”上市。（State Food and Drug Administration） 2005年，我國SFDA批準(zhǔn)了全球第二種基因治療藥物HB101上市。（國家食品藥品監(jiān)督管理局） 2009年12月18日出版的Science雜志將”return of gene therapy”作為年度重大的科學(xué)突破之一。 2012年12月歐盟批準(zhǔn)地全球第三種基因治療藥物上市。 迄今，多達(dá)1900種基因治療臨床試驗(yàn)方案并正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。轉(zhuǎn)基因技術(shù)正成為分子醫(yī)學(xué)的一種革命性的技術(shù)手段，并已成為治療許多遺

2、傳性和獲得性疾病的潛在希望所在。,問題,社會(huì)公眾對健康需求的增加 生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的推動(dòng) 對轉(zhuǎn)基因技術(shù)的安全和倫理關(guān)注持續(xù)增加。,課程內(nèi)容,分為理論課與實(shí)踐課 轉(zhuǎn)基因技術(shù)概述 病毒轉(zhuǎn)基因技術(shù)原理、純化制備技術(shù)和醫(yī)學(xué)應(yīng)用 生物安全 醫(yī)學(xué)倫理問題 表達(dá)外源基因的復(fù)制缺陷型重組腺病毒的構(gòu)建和鑒定,DNA病毒 RNA病毒 雜合病毒,第一章 轉(zhuǎn)基因技術(shù)概述,范雄林 86-27-83650639 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系,研究生高水平課程病毒轉(zhuǎn)基因技術(shù)原理,主要內(nèi)容,基因轉(zhuǎn)移方式 真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因技術(shù) 外源基因表達(dá)讀框的構(gòu)建原理,1. 定 義,基因轉(zhuǎn)移（gene transfer）: 自然發(fā)生

3、 轉(zhuǎn)基因技術(shù)(transgene technology): 人工利用,2. 常見的基因轉(zhuǎn)移方式,轉(zhuǎn)化(transformation) 轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction ) 轉(zhuǎn)染 (transfection),現(xiàn)象,定義,分類 用途,轉(zhuǎn)化 （transformation ） 現(xiàn)象: 肺炎鏈球菌的轉(zhuǎn)化試驗(yàn) 定義: 分類和應(yīng)用:自然轉(zhuǎn)化:感受態(tài),宿主菌種類 人工轉(zhuǎn)化: 低溫CaCl2、電穿孔,小鼠的肺炎鏈球菌的轉(zhuǎn)化試驗(yàn),轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction ) 現(xiàn)象:“U”型管實(shí)驗(yàn) 定義: 分類和應(yīng)用:普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo) 局限性轉(zhuǎn)導(dǎo),局限性轉(zhuǎn)導(dǎo),轉(zhuǎn)染 (transfection) 現(xiàn)象: 感染(infection)

4、、病毒感染 定義: 廣義和狹義 分類和應(yīng)用:物理化學(xué)方法 生物學(xué)方法(病毒載體),野生型病毒的自然感染、病毒載體轉(zhuǎn)染和質(zhì)粒經(jīng)化學(xué)法介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染,3. 基因轉(zhuǎn)移入真核細(xì)胞的方法,基因轉(zhuǎn)移入真核細(xì)胞的影響因素 外源基因轉(zhuǎn)移入真核細(xì)胞的類型和方法 構(gòu)建外源基因的基本要素,轉(zhuǎn)移入原核細(xì)胞的影響因素: 限制-修飾系統(tǒng) 質(zhì)粒宿主范圍和相容性 同源重組與非同源重組,基因轉(zhuǎn)移入真核細(xì)胞的影響因素,真核與原核細(xì)胞具有顯著區(qū)別; 外源基因要進(jìn)入真核細(xì)胞，要突破三大障礙; 理想的轉(zhuǎn)基因技術(shù)方法,質(zhì)粒型載體: 物理方法 化學(xué)方法,外源基因轉(zhuǎn)移入真核細(xì)胞的類型和方法,傳統(tǒng)的針頭注射 顯微注射 粒子轟擊 電穿孔 流體動(dòng)力學(xué) 包裹微球 超聲,磷酸鈣法 脂質(zhì)體法 DEAE-Dxtran法,常用的物理方法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移,外源基因轉(zhuǎn)移入真核細(xì)胞的類型和方法,病毒顆粒型載體(病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)) 假型病毒載體（復(fù)制缺陷性病毒載體）：具有感染性 重組型病毒載體：具有感染性,DNA病毒載體：AdV, AAV,HSV-1,etc. RNA病毒載體: HIV, etc. 雜合型病毒載體,不同類型轉(zhuǎn)基因技術(shù)方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較,構(gòu)建外源基因的基本要素,轉(zhuǎn)錄控制元件 翻譯控制元件 病毒復(fù)制包裝信號,復(fù)習(xí)思考題