實(shí)驗(yàn)四 小鼠精子畸形試驗(yàn)

1、院 系：生化環(huán)院 任課老師：吳雨龍 任課班級(jí)：09食品、行09食品,食品專業(yè),食品毒理學(xué)實(shí)驗(yàn),精子畸形試驗(yàn)是檢測(cè)受試化學(xué)毒物能否破壞哺乳動(dòng)物精子正常形態(tài)的實(shí)驗(yàn)方法。通過實(shí)驗(yàn)，學(xué)習(xí)和掌握小鼠精子畸形試驗(yàn)的原理和步驟。,實(shí)驗(yàn)四 小鼠精子畸形試驗(yàn),實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1.,1.,精子畸形是指精子的形狀異常和異常精子數(shù)量的增多。生殖系統(tǒng)對(duì)化學(xué)毒物的作用十分敏感，在其他系統(tǒng)還未出現(xiàn)毒性反應(yīng)前，生殖系統(tǒng)可能已出現(xiàn)了損害作用。正常情況下，哺乳動(dòng)物的精液中也存在少量的畸形精子，但在某些化學(xué)毒物的作用下，特別是在可引起生殖細(xì)胞遺傳性損傷的化學(xué)毒物作用下，哺乳動(dòng)物睪丸產(chǎn)生的畸形精子數(shù)量可大量增加。因此，可以用,檢查雄性動(dòng)物

2、接觸化學(xué)毒物后精子畸形率的高低，來反映該化學(xué)毒物的生殖毒性和對(duì)生殖細(xì)胞潛在的致突變性。 化學(xué)毒物引起精子畸形的機(jī)制尚未完全清楚。正常情況下，精子的成熟和正常形態(tài)發(fā)生過程受多種基因調(diào)控，一旦這些基因中的一個(gè)或多個(gè)在化學(xué)毒物的作用下發(fā)生突變，就會(huì)導(dǎo)致畸形精子數(shù)量的大量增加。一般認(rèn)為，常染色體上的基因控制,精子畸形，Y-性連鎖基因控制畸形精子的表現(xiàn)。某些特異的染色體重排，如性、常染色體易位，是化學(xué)毒物誘發(fā)哺乳動(dòng)物畸形率增高的主要機(jī)制。 由于精子畸形有可能影響生殖。因此，當(dāng)受檢物引起精子畸形率增高，即使不一定是化合物誘發(fā)生殖細(xì)胞突變的結(jié)果，但也表明受試物直接或間接損害精子，從而可能影響生殖。,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3、：,實(shí)驗(yàn)材料,3.,體重18-22g小鼠。,實(shí)驗(yàn)器材：,灌胃針、注射器5套、眼科剪、眼科鑷、顯微鏡、飼養(yǎng)籠等。,實(shí)驗(yàn)試劑：,磷酸鹽緩沖液、生理鹽水、無水乙醇、2%伊紅水溶液、甲基磺酸甲酯或甲基磺酸乙酸或環(huán)磷酰胺。,1.動(dòng)物選擇成熟的大鼠、小鼠均可使用。由于小鼠較為經(jīng)濟(jì)，且有大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)小鼠在該試驗(yàn)系統(tǒng)中對(duì)化學(xué)毒物最為敏感，故一般采用雄性小鼠，年齡宜在68周。,2.劑量與分組試驗(yàn)至少應(yīng)設(shè)3個(gè)以上劑量組，并同時(shí)設(shè)立陽性對(duì)照組和陰性對(duì)照組。接觸化學(xué)毒物后每組至少應(yīng)存活5只動(dòng)物。最高劑量組5d總劑量應(yīng)能使部分動(dòng)物死亡。 一般可采用LD50的24倍劑量，或預(yù)先給予化學(xué)毒物的LD50，以求得最高總劑量，然

4、后以它的1/2（或1/5、1/10）作為下一劑量組的接觸劑量，依此類推。,陽性對(duì)照可用環(huán)磷酰胺20mg/kg或甲基磺酸甲酯75mg/kg或甲基磺酸乙酯60mg/kg，進(jìn)行腹腔注射，每天一次，連續(xù)5d。陰性對(duì)照選用給予相同體積的溶劑。,3.染毒與采樣可采用一次或每天一次連續(xù)5d的方法進(jìn)行染毒。染毒途徑多用腹腔注射，也可采用與人體實(shí)際接觸化學(xué)毒物相同的途徑，如經(jīng)口、吸入和皮膚接觸等。 一般認(rèn)為精原細(xì)胞后期或初級(jí)精母細(xì)胞早期對(duì)化學(xué)誘變劑較為敏感，在接觸化學(xué)毒物后45周精子畸形率最高，故選擇在第一次染毒后第35d進(jìn)行采樣。也可在染毒后第1、第4和第10周,分三次采樣，或者在染毒后每周采樣一次，連續(xù)進(jìn)行

5、動(dòng)態(tài)觀察，直至精子形態(tài)恢復(fù)正常。,4.制片用頸椎脫臼法處死小鼠，剪開腹腔，分離并摘取雙側(cè)附睪，將附睪放入盛有約3ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的小平皿中，以眼科剪將附睪尾剪成小塊，用吸管將懸浮液輕輕吹打56次，靜置35min，用四層擦鏡紙濾除組織碎片，吸取此精子懸液滴于清潔載玻片上，均勻推片，待玻片晾干后用甲醇固定5min，干燥后即可鏡檢觀察精子形態(tài)。也可用2%的伊紅水溶液染色12h后再作鏡檢。,5.閱片在高倍鏡下檢查精子形態(tài)，可加上藍(lán)色或綠色濾光片。每只小鼠檢查完整的精子200500個(gè)，每個(gè)劑量組至少檢查1000個(gè)精子。精子畸形主要表現(xiàn)在精子的頭部，可分為：無鉤、香蕉形、無定形、雙頭、雙尾、尾折

6、疊及胖頭等形態(tài)。 頭部重疊或全部重疊的精子、無尾精子不進(jìn)行計(jì)數(shù)。,分別計(jì)算各劑量組的精子畸形發(fā)生率。各劑量組的精子畸形率與陰性對(duì)照組之間的差異分析采用秩和檢驗(yàn)。 由于不同品系小鼠的精子畸形率本底值差異較大，且影響的因素也較多，故在結(jié)果分析時(shí)，應(yīng)首先觀察陽性和陰性對(duì)照組的試驗(yàn)結(jié)果。陽性對(duì)照組精子畸形率的增高應(yīng)在本實(shí)驗(yàn)室的歷史記錄范圍之內(nèi)，并與陰性對(duì)照組有顯著性差異（P0.01），陰性對(duì)照組的畸形精子率也應(yīng)與自己實(shí)驗(yàn)室的歷史記錄接近，否則所得結(jié)果不可靠，試驗(yàn)應(yīng)重做。,出現(xiàn)可重復(fù)的劑量反應(yīng)關(guān)系時(shí)，可判斷試驗(yàn)結(jié)果為陽性。但要判定某一化學(xué)毒物為精子畸形誘變劑，至少應(yīng)該有兩個(gè)相鄰劑量組的精子畸形率比陰性對(duì)照組顯著增高（P0.01）；或達(dá)到陰性對(duì)照組的2倍或2倍以上，并且試驗(yàn)結(jié)果能夠重復(fù)。如果試驗(yàn)組的染毒劑量已使動(dòng)物發(fā)生死亡，而精子畸形仍未見增加，則可判定試驗(yàn)結(jié)果為陰性。在受試化學(xué)毒物的毒性作用較低而不至于引起動(dòng)物死亡時(shí)，應(yīng)當(dāng)記錄最大的染毒劑量。,精子畸形試驗(yàn)還可進(jìn)行畸變類型分析，不同部位的畸形對(duì)精子的活動(dòng)能力和使卵子受孕的能力有不同的影響?？梢越Y(jié)合精子計(jì)數(shù)、精子運(yùn)動(dòng)能力試驗(yàn)等對(duì)化學(xué)毒物對(duì)雄性生殖系統(tǒng)的毒性作用做進(jìn)一步的檢測(cè)。,1在該試驗(yàn)過程中，雖然將精子懸液采用離心等方法除去組織殘?jiān)笤僦破Ч麜?huì)更佳，但這使制片過程變得復(fù)雜化且更易造成人為誤差。 2在鏡檢時(shí)要注意鑒別制片過程中人為造成的精子