實驗二固藍鹽比色法測定還原型抗壞血酸.ppt

1、固藍鹽比色法測定還原型抗壞血酸,（）目的要求 學習固藍鹽比色法測定食品中還原型抗壞血酸含量測定的原理及其檢測方法。 （二）實驗原理 VC是一種己糖醛基酸，有抗壞血病的作用，所以又稱作抗壞血酸。維生素C屬于水溶性維生素VC廣泛存在于植物組織中，新鮮的水果、蔬菜，特別是棗、辣椒、苦瓜、柿子葉、獼猴桃、柑桔等食品中含量尤豐富。本身的水溶性質(zhì)，除滿足人體生理、生化作用外，任何多余量都會排出體外。,維生素C具有較強的還原性，對光敏感，氧化后的產(chǎn)物稱為脫氫抗壞血酸，仍然具有生理活性。進一步水解則生成2，3 -二酮古樂糖酸，失去生理作用。 水溶性維生素都易溶于水，而不溶于苯、乙醚、氯仿等大多數(shù)有機溶劑。在酸

2、性介質(zhì)中很穩(wěn)定，既使加熱也不破壞；但在堿性介質(zhì)中不穩(wěn)定，易于分解，特別在堿性條件下加熱，可大部或全部破壞。它們易受空氣、光、熱、酶、金屬離子等的影響；維生素C對氧、銅離子敏感，易被氧化。,根據(jù)它具有的還原性質(zhì)可以測定維生素C的含量。常用的測定方法有： （1）2，6-二氯靛酚法 （還原型VC） （2）固藍鹽比色法測定還原型抗壞血酸 （3）2，4-二硝基苯肼法 （總VC） （4）碘酸法 （5）碘量法 （6）熒光分光光度法,根據(jù)上述性質(zhì)，測定水溶性維生素時，一般都在酸性溶液中進行前處理。VC通常采用草酸、草酸醋酸、偏磷酸醋酸溶液直接提取。在一定濃度的酸性介質(zhì)中，可以消除某些還原性雜質(zhì)對維生素C的破壞

3、作用。草酸價廉，使用方便，對維生素C有很好。 在乙酸溶液中，抗壞血酸與固藍鹽B反應(yīng)生成黃色的草酰肼-2-羥基丁酰內(nèi)酯衍生物。 可在其最大吸收波長（420nm）處測定吸光度，與標準系列比較定量。,（三）儀器與試劑 1試劑 （1） 2 molL乙酸溶液 吸取 11.6 mL冰醋酸，加水稀釋至 100 mL。 （2） 0.5molL乙酸溶液吸取29mL冰醋酸，加水稀釋至100 mL。 （3） 0.25molL乙二胺四乙酸二鈉溶液稱取 9. 3g乙二胺四乙酸二鈉（C10H14 N2O8 Na22H2O）加水并加熱使之溶解，冷卻并稀釋至100 mL。 （4）蛋白質(zhì)沉淀劑 乙酸鋅溶液稱取 22.0 g乙酸

4、鋅Zn（CH3COO）22H2O，加 3mL冰醋酸溶于水并稀釋至100 mL。 亞鐵氰化鉀溶液稱取 10.6 g亞鐵氰化鉀K4Fe（CN）6 3H2O，加水溶解至 100 mL。 （5）顯色劑固藍鹽 B（Fast Blue Salt B）溶液準確稱取 0.2 g固藍鹽 B，加水于100mL棕色容量瓶中定容。該溶液在室溫下貯存可穩(wěn)定3d以上。 （6）抗壞血酸標準儲備溶液精密稱取02000 g抗壞血酸，加 20mL 2 molL乙酸溶液，溶解后移入 100 mL棕色容量瓶中，用水定容并混勻。此溶液相當于 2.0 mgmL抗壞血 酸（10下冰箱內(nèi)貯存可穩(wěn)定2d）。 （7）抗壞血酸標準使用溶液用移液管

5、精密吸取 5.0 mL抗壞血酸標準儲備溶液于100 mL棕色容量瓶內(nèi)。加 5 mL 2molL乙酸溶液并用水定容。此溶液相當于 100 gmL抗壞血酸（臨用時配制）。,2儀器 可見光分光光度計；搗碎機；離心機。 （四）實驗步驟 1樣品溶液的制備 （1）非蛋白性食品 液體試樣抗壞血酸含量在 0.2gL以下的試樣，混勻后可直接取樣測定；抗壞血酸含量 0.2 gL以上的試樣，用水適當稀釋后測定。 水溶性固體試樣準確稱取 1.05.0 g，精確至 0.001 g，加 5 mL 2 molL乙酸溶液研磨溶解后，移入100mL棕色容量瓶內(nèi)，加水定容。 蔬菜、水果樣品稱取鮮樣可食部分20.0050.00 g

6、，加等量的2molL乙酸溶液用搗碎機搗成勻漿。稱取 10.020.0 g勻漿于 100mL棕色容量瓶內(nèi)，加 5 mL 2 molL乙酸溶液，用水定容，過濾備用。不易過濾的樣液可用離心機離心分離，上清液供測定用。,（2）蛋白性食品固體試樣混勻后精密稱取5.010.0g，精確至0 001g；液體試樣用移液管精密吸取5.010.0 mL于 100mL棕色容量瓶內(nèi)。加 10 mL 2molL乙酸溶液，乙酸鋅溶液和亞鐵氰化鉀溶液各75mL，加水定容。將全部溶液移入離心管內(nèi)，以3000 rmin離心10 min，上清液供測定用。同時取與處理試樣相同量的乙酸溶液、乙酸鋅溶液和亞鐵氰化鉀溶液，按同一方法做試劑

7、空白對照。,2標準曲線繪制 取一套10 mL比色管，編號，按表312加入各試劑。 表312 試劑配加表,各管加水稀釋至10 mL，混勻并在室溫下放置20 min后，用1cm比色皿，以零號管為參比，于420 nm處測定吸光值。 以抗壞血酸含量為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線。,繪制標準曲線方法： 1）繪制標準曲線 2）計算回歸方程后，再繪制標準曲線 計算回歸方程方法: 按照回歸方程進行計算; 應(yīng)用excel進行計算; 電腦連接的分光光度計直接出數(shù)據(jù)。,3樣品測定 （1）非蛋白試樣的測定 于二個比色管內(nèi)精密吸取按非蛋白性食品方法處理的樣液0.55.0 mL（約相當于抗壞血酸200 g以下）和等

8、量蒸餾水，以下按標準曲線測定方法依次加入其他試劑。加水稀釋至10 mL，混勻并在室溫下放置20 min后，以未加樣品管為參比，測定樣品吸光值，從標準曲線上查出抗壞血酸含量。 （2）蛋白性試樣的測定 于兩個 10mL比色管內(nèi)精密吸取按蛋白性食品方法制備的樣液（約相當于抗壞血酸 200 g以下）和等體積試劑空白溶液。各加入 1.5 mL乙二胺四乙酸二鈉溶液、0.5 molL乙醇溶液1.0 mL、1.25mL固藍鹽B溶液，加水定容。室溫下放置3min后，移入1 cm比色皿，以試劑空白管為參比，于420 nm處測定吸光值。從標準曲線上查出抗壞血酸含量。,（五）結(jié)果計算 按式（314）計算樣品中抗壞血酸含量，計算結(jié)果保留小數(shù)點后二位。,式中 X每百克（或百毫升）樣品中抗壞血酸含量，mg； C試樣測定液中抗壞血酸含量，g； m試樣質(zhì)量或體積，g或mL； V2試樣處理液總體積，mL； V1測定時所取溶液體積，mL。,（六）注意事項及說明 1蛋白性食品常指奶粉、豆粉、乳飲料、強化食品等。 2蛋白性試樣比