《基因組學(xué)》PPT課件.ppt

1、第十三章基因組學(xué),第十三章基因工程和基因組學(xué),第一節(jié) 基因組學(xué) 概述,基因組學(xué)(genomics) ：遺傳學(xué)研究進入分子水平后發(fā)展起來的一個分支，主要研究生物體內(nèi)基因組的分子特征。* 研究對象：以整個基因組為研究單位，而不以單個基因為單位作為研究對象。* 研究目標(biāo)：認(rèn)識基因組的結(jié)構(gòu)、功能和進化；闡明整個基因組所包含的遺傳信息和相互關(guān)系；充分利用有效資源，預(yù)防和治療人類疾病。,基因組(Genome)：又稱染色體組，是指一個物種單倍體的染色體數(shù)目，是生物體全部遺傳物質(zhì)的總和。 基因組學(xué)(Genomics)：對生物體所有基因進行基因組作圖(包括遺傳圖譜、物理圖譜、轉(zhuǎn)錄圖譜)、核苷酸序列分析、基因定位

2、和基因功能分析的一門科學(xué)。 最終目標(biāo)：獲得生物體全部基因組序列，注解基因組所含的全部基因，鑒定所有基因的功能及基因間相互作用關(guān)系，并闡明基因組的復(fù)制及進化規(guī)律。,一、基因組學(xué)的概念,不同生物基因組大小,1. 人類基因組計劃 與曼哈頓原子 計劃、阿波羅登月計劃并稱的人類科學(xué)史上的重大工程。于1990年首先在美國啟 動，后有德、日、英、法、中等國的科學(xué)家先后正式加入。,（一） 人類基因組, 1990年，美國國會批準(zhǔn)美國的“人類基因組計劃”在10月1日正式啟動。其總體規(guī) 劃是準(zhǔn)備在15年內(nèi)（19902005）至少投入30億美元，分析人類的基因組30 億個堿基對。 2003年，6國科學(xué)家宣布人類基因組

3、序列圖繪制成功，HGP的所有目標(biāo)全部實現(xiàn)。覆蓋人類基因組所含基因區(qū)域的99%，精確率達到99.99%，比原計劃提前兩年多，耗資27億美元。,人類基因組計劃,人類基因組 核基因組DNA的總長約3109bp，含有24條線性DNA分子，最長的有250 Mb，最短的55 Mb。 30億個堿基對。 線粒體基因組是長度為16569 bp的環(huán)狀DNA分子，每個細(xì)胞平均含有800個線粒體，每個線粒體含10個基因組拷貝。 以每10cm 書寫60個字母計算，30億個堿基對連接的長度可達5 000 km，相當(dāng)于北京到香港來回的距離。,為人類的基因組研究提供重要的依據(jù)。 1996年，酵母菌基因組測序。 1998年12

4、月，線蟲完整基因組序列的 2000年3月，果蠅的基因組測序 2001年12月14日，擬南芥基因組的完整圖譜。,（二） 其他生物基因組,我國超級雜交稻（秈稻）基因組計劃 2001年7月啟動 2002年4月5日Science。 材料：秈稻“9311”。 完成單位：華大基因研究中心、中科院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所等12個單位。 水平：水稻基因組的總基因數(shù)約為4602255615個，工作框架圖序列已覆蓋水稻整個基因組92以上的基因。 方法：“鳥槍射擊法”，利用國產(chǎn)曙光2000、曙光3000超級計算機(1000億次/秒)對隨機DNA碎片進行排序和組裝。,水稻基因組計劃,國際水稻（粳稻）基因組計劃始于199

5、8年，日本、美國、中國、法國等國家和地區(qū)參加。中國負(fù)責(zé)第4號染色體：36 Mb (占910%)。,國際水稻基因組測序計劃,2002年12月21日Nature，中國第四號染色體。 材料：粳稻“日本晴”。 完成單位：中科院國家基因研究中心等4家單位。 水平：第四號染色體中的總堿基數(shù)目為0.35億堿基對，覆蓋全長序列98的區(qū)域，只剩下7個小空洞，堿基序列的精確度達到99.99%。完整測定的著絲粒序列在高等生物中屬于首次。,國際水稻基因組測序計劃,水稻是第一個完成基因組全序列測定的農(nóng)作物，核基因組含有12條染色體，總長約389Mb，1號染色體最大為43.2Mb，10號染色體最小22.6Mb。全基因組預(yù)

6、測約含有4萬個基因。 水稻雙鏈閉環(huán)線粒體基因組大小為491kb，葉綠體基因組134.5kb,C值：是指一個單倍體基因組中DNA的總量。 值悖理 （C value paradox）：物種的C值和它的進化復(fù)雜性之間無嚴(yán)格對應(yīng)關(guān)系的現(xiàn)象稱為C 值悖理，是復(fù)雜生物基因組的一個普遍特征,（三） C值悖理和N值悖理,（三） C值悖理和N值悖理,N值：是指生物體所含有的基因數(shù)目。 N值悖理（N value paradox）：復(fù)雜性不同的生物種屬所具有的基因數(shù)目與其生物結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性不成比例的現(xiàn)象。 如結(jié)構(gòu)比較簡單的線蟲含有的基因數(shù)為1.9萬個, 比線蟲更復(fù)雜的果蠅基因數(shù)為1.8萬個, 水稻的基因數(shù)約4萬個,

7、最復(fù)雜的人類其基因總數(shù)約3萬個。,四、基因組學(xué)研究內(nèi)容,（一）結(jié)構(gòu)基因組學(xué)(structural genomics) 通過基因作圖、核苷酸序列分析確定基因組成、進行基因定位的科學(xué)。 遺傳信息在染色體上,但染色體不能直接用來測序,必須將基因組這一巨大的研究對象進行分解,使之成為較易操作的小的結(jié)構(gòu)區(qū)域,這個過程就是基因作圖。完成基因組圖譜構(gòu)建之后，就可以利用圖譜進行基因組序列測定和組裝。,四、基因組學(xué)研究內(nèi)容,（二）功能基因組學(xué)(functional genomics) 利用結(jié)構(gòu)基因組所提供的信息和產(chǎn)物，研究基因組功能表達的一門分支學(xué)科。 主要研究內(nèi)容: 基因的識別、鑒定和克隆。包括新策略、新技術(shù)

8、、新方法的創(chuàng)立和各種基因組數(shù)據(jù)的建立； 基因結(jié)構(gòu)與功能及其相互關(guān)系的研究。包括基因變異體的系統(tǒng)鑒定和目錄的繪制；基因表達譜的編制、基因結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的鑒定、基因相互作用網(wǎng)絡(luò)圖的編制； 基因表達調(diào)控的研究,四、基因組學(xué)研究內(nèi)容,（三）蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics) 研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組成及其活動規(guī)律。旨在闡明生物體全部蛋白質(zhì)的表達模式及功能模式,內(nèi)容包括鑒定蛋白質(zhì)表達、存在方式、結(jié)構(gòu)、功能和相互作用方式等。 基因是遺傳信息的攜帶者,而全部生物功能的執(zhí)行者卻是蛋白質(zhì), 僅僅從基因的角度來研究是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。,第 2節(jié) 基因組圖譜構(gòu)建,基因組計劃的目的是獲得全基因組序列，并對其進行解讀。DNA測序每

9、次反應(yīng)僅能讀取1000bp的長度，因此，基因組測序的基礎(chǔ)是基因組圖譜的構(gòu)建。,鳥槍射擊法(shotgun) 基因組序列測定,第 2節(jié) 基因組圖譜構(gòu)建,基因組測序策略 重疊群法 相互存在重疊序列的一組克隆。根據(jù)重疊群的相對位置講各個克隆首尾相連，長度可達百萬級bp。對單個重疊群，采用鳥槍法測序，然后進行組裝。這是由上而下（up to down）的測序策略。 直接鳥槍法 首先進行全基因組鳥槍法測序，再用分子標(biāo)記為起點強鳥槍DNA片段組裝。這是由下而上（bottom to up）的測序策略。這種方法依賴于高密度分子標(biāo)記基因組圖譜。 基因組圖譜分為遺傳圖譜和物理圖譜。,（一）遺傳標(biāo)記,遺傳標(biāo)記就是遺傳

10、物質(zhì)的特殊的易于識別的多態(tài)性表現(xiàn)形式，它包括形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記和分子標(biāo)記。 形態(tài)標(biāo)記：主要指可以觀察到的一些性狀,如種皮顏色、眼色、株高等。 細(xì)胞學(xué)標(biāo)記：細(xì)胞學(xué)標(biāo)記是指能明確顯示遺傳多態(tài)性的細(xì)胞學(xué)特征。 生化標(biāo)記：主要是同工酶及種子貯藏蛋白，有時又稱蛋白質(zhì)標(biāo)記。 分子標(biāo)記：主要指DNA水平上的標(biāo)記。,DNA標(biāo)記,以DNA為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記主要包括 基于雜交的分子標(biāo)記，如RFLP。 基于PCR的分子標(biāo)記，如RAPD、AFLP、SSR (又稱microsatellite )、AFLP 等。 基于DNA序列和芯片的分子標(biāo)記，如SNP（single nucleotide polymorphi

11、sm）。,RAPD由Williams 等（1990）和Welsh等（1990）分別發(fā)展起來的分子標(biāo)記技術(shù)。這一技術(shù)是以基因組DNA為模板，采用隨機設(shè)計的單個寡核甘酸序列（一般為10bp）為引物，通過PCR擴增，產(chǎn)生不連續(xù)的DNA產(chǎn)物，用于檢測DNA序列的多態(tài)性。,RAPD （Random amplified polymorphic DNA）,重復(fù)序列 串聯(lián)重復(fù)序列（tandem repeated sequence），其重復(fù)單位首尾相連，成串排列（Flavell 1986）。 散布重復(fù)序列（interspersed repeated sequence），其重復(fù)單位與其它無關(guān)序列或單拷貝序列相間排

12、列。,SSR （simple sequence repeats） 或微衛(wèi)星（microsatellite ),微衛(wèi)星DNA序列或SSR又稱短串聯(lián)重復(fù)序列（short sequence repeat，STR），它是由幾個核甘酸（一般16個）為重復(fù)單位簇集而成的串聯(lián)重復(fù)序列，可隨機的分布在整個基因組的不同位置上。微衛(wèi)星長度具有高度變異性，并且這種多態(tài)性常常表現(xiàn)復(fù)等位性，兩端的序列多是相對保守的單拷貝序列，因而可以根據(jù)兩端的序列設(shè)計一對特異引物，擴增每個位點的微衛(wèi)星序列，從而揭示其長度的多態(tài)性（simple sequence length polymorphism，SSLP）。,SSR,ISSR是一

13、種新型的分子標(biāo)記。與SSR相反，直接用同位素標(biāo)記SSR序列，擴增2個SSR間的單拷貝序列。為了增加擴增的特異性，在引物的5和3端分別加入12個選擇性堿基，引物長度1618bp。,ISSR（inter-ssr）, AFLP結(jié)合了RFLP和RAPD技術(shù)的優(yōu)點。AFLP的基本原理是基于PCR的擴增基因組DNA限制性片段多態(tài)性?；蚪MDNA先用限制性內(nèi)切酶切割，然后將雙鏈接頭（adapter）連接到DNA片段的末端，通過選擇在3端分別添加13個選擇性堿基的不同引物，選擇性地識別具有特異配對順序的酶切片段并與之結(jié)合，從而實現(xiàn)特異擴增。,AFLP ( Amplicon fragment length po

14、lymorphism),AFLP反應(yīng)過程示意圖,遺傳信息由DNA mRNA 蛋白質(zhì)。 一個典型的真核生物mRNA分子：5- U TR ( 5端轉(zhuǎn)錄非翻譯區(qū)) , ORF (開放閱讀框架) ,3- U TR ( 3端轉(zhuǎn)錄非翻譯區(qū)) ，polyA,任何一個基因，cDNA 的5端或3端的有限序列即可特異性地代表生物體某種組織某個時期的一個表達基因。EST 的數(shù)目可以顯示所代表的基因的拷貝數(shù),EST （expressed sequence tags）,從組織細(xì)胞中提取總mRNA ，構(gòu)建成標(biāo)準(zhǔn)cDNA 文庫，然后從中挑取大量克隆，利用載體通用引物測出插入載體的cDNA 片段5端或3端300 - 500

15、堿基的序列。 將測序所得的EST 與dbEST 等數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行比較分析,根據(jù)核酸或蛋白質(zhì)序列的同源性比較，可以鑒定出哪些EST 代表已知基因，哪些EST 代表未知基因。,EST,序列標(biāo)簽位點（sequence tagged site） 是一小段DNA序列。每個基因組僅1個拷貝，很容易分辨。STS要滿足2個條件： 是一段已知的序列，可據(jù)此涉及PCR引物來檢測不同DNA片斷中是否存在 這一序列。 STS在染色體上必須是獨一無二的。如果在基因組中有多個位點出現(xiàn)，作圖數(shù)據(jù)將含混不清。 常見的尋找STS的方法： EST、 SSLP、 隨機基因組序列,STS,單核苷酸多態(tài)性是指基因組序列中由于單個核

16、苷酸(,)的替換而引起的多態(tài)性。通常SNPs不包括堿基的插入、缺失以及重復(fù)序列拷貝數(shù)的變化。這種標(biāo)記只有兩種等位基因。 人類基因組的編碼基因中有20萬個SNPs, 在非編碼區(qū)的數(shù)目可能還要多10倍以上。 單倍型：當(dāng)前常用術(shù)語“happlotype”(單倍型)代替術(shù)語“allele”(等位基因)。在給定的一條染色體的緊密連鎖的位點上多個等位基因的集合,通常34個相鄰等位基因彼此靠近而構(gòu)成的單倍型可作為一個整體而遺傳(稱為單倍型塊(haploblock),SNP ( single nucleotide polymorphism ),（二） 遺傳圖譜的構(gòu)建,1 人類基因組遺傳圖譜的構(gòu)建 人類的遺傳圖

17、譜是利用家系分析法，在對8個家系的134個成員的分析中(186個減數(shù)分裂)，主要根據(jù)5264個STR標(biāo)記繪制而成的。 利用這些家系的資料繪制第1至22號染色體圖譜。對于X染色體圖譜，還利用了來自另外12個家系，170個成員(105個減數(shù)分裂)的資料繪制而成。 最后，將5264個標(biāo)記定位在2335個位點（其中有些標(biāo)記相距很近而作為一個位點）。,2 植物基因組遺傳圖譜的構(gòu)建,作圖群體 常用的遺傳作圖群體有F2群體、回交群體、加倍單倍體（double haploid，DH）群體、重組近交系（recombinant inbred lines，RIL）群體、近等基因系（nearisogenic line

18、s，NIL）群體等（徐云碧，1994）。 遺傳標(biāo)記的染色體定位,標(biāo)記間的連鎖分析 LINKAGE、Mapmaker、JoinMap,二、 物理圖譜繪制,（一 ）限制性作圖 （二）基于克隆的基因組作圖 （三） 原位雜交 （四）序列標(biāo)簽位點（STS）作圖 （五） 人類基因組圖譜,重疊群（contigous DNA clones, contigs） 從1個感興趣的位置開始，利用第1個元件的末端部分來辯別第2個元件，沿染色體“行走”（walk）。通過鑒別目標(biāo)位點兩測的2個DNA標(biāo)記，從1個標(biāo)記向另1個標(biāo)記的行走。 沿染色體鑒別一系列重疊群是大規(guī)模研究的基礎(chǔ)。在特定區(qū)域的染色體行走可以提供分離通過遺傳圖

19、譜定位在該區(qū)域基因的方法。集中全部染色體的重疊群，可以為以后研究提供有效克隆來源。 染色體行走考慮的根本是每“步”的大小，較大的步加快積聚相鄰克隆的進程。,（二） 基于克隆的基因組作圖,區(qū)域作圖 Regional mapping,區(qū)域作圖 Regional mapping,Minimal tiling path selected for sequencing.,區(qū)域作圖 Regional mapping,（三） 原位雜交,熒光原位雜交（fluorescent in situ hybridization, FISH） 基因組原位雜交（genome in situ hybridization, G

20、ISH ）,（四）序列標(biāo)簽位點（STS）作圖,輻射雜交系 是含有另一種生物染色體片斷的嚙齒類細(xì)胞。帶有人類染色體片段的輻射雜交系 DNA庫 YAC/BAC 克隆作圖 獲得大分子DNA克隆文庫以后，用PCR的方法檢測STS，根據(jù)重疊的STS標(biāo)記繪制克隆連鎖圖。,（四）序列標(biāo)簽位點（STS）作圖,當(dāng)兩個片段含有同一STS順序時，則這兩個片段彼此重疊。如果它們彼此鄰接，這兩個STS總會同時出現(xiàn)在相同片段上。如果它們相距甚遠(yuǎn)，有時會在同一片段，有時則在不同片段。 要將一組STS作圖定位，必需收集來自同一染色體或整個基因組隨機斷裂的DNA片段。不同DNA片段之間有各種可能的重疊，可以覆蓋整個作圖區(qū)段。依

21、次采用單個STS挑出它們所在的DNA片段，根據(jù)它們彼此的重疊關(guān)系可以逐段繪DNA物理圖。,生物信息學(xué)是現(xiàn)代生物技術(shù)與計算機科學(xué)的結(jié)合，收集、加工和分析生物資料和信息的學(xué)科。 應(yīng)用生物信息學(xué)可以將來自不同的基因組理論和應(yīng)用綜合并標(biāo)準(zhǔn)化，利用大量的生物信息資料了解遺傳網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)、信號傳遞及相互關(guān)系，計算機還可進行一些生物模擬研究。 利用生物信息學(xué)能夠分析從微生物、動物、植物以及人類基因組序列測定產(chǎn)生的大量資料，闡明遺傳信息。 研究內(nèi)容兩大類：DNA 數(shù)據(jù)分析； 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)分析。,第三節(jié)生物信息學(xué)(bioinformatics),基因芯片,基因芯片(gene chip),又稱DNA微陣列(microarray),是由大量DNA或寡核苷酸探針密集排列所形成的探針陣列,其基本原理是通過雜交檢測信息。利用基因芯片,可以實現(xiàn)基因信息的大規(guī)模檢測。,生物信息學(xué)的應(yīng)用,（一）發(fā)現(xiàn)新基因和新的單核苷酸多態(tài)性 在研究生物的基因時,不斷的發(fā)現(xiàn)新的基因。一般說