色譜定量方法

1、色譜定量方法一、歸一化法由于組分的量與其峰面積成正比，如果樣品中所有組分都能產(chǎn)生信號，得到相應(yīng)的色譜峰，那么可以用如下歸一化公式計算各組分的含量。(7.34)若樣品中各組分的校正因子相近，可將校正因子消去，直接用峰面積歸一化進(jìn)行計算。中國藥典用不加校正因子的面積歸一化法測定藥物中各雜質(zhì)及雜質(zhì)的總量限度。(7.35) 歸一化法的優(yōu)點是：簡便、準(zhǔn)確、定量結(jié)果與進(jìn)樣量重復(fù)性無關(guān)(在色譜柱不超載的范圍內(nèi))、操作條件略有變化時對結(jié)果影響較小。缺點是：必須所有組分在一個分析周期內(nèi)都流出色譜柱，而且檢測器對它們都產(chǎn)生信號。不適于微量雜質(zhì)的含量測定。二、外標(biāo)法用待測組分的純品作對照物質(zhì)，以對照物質(zhì)和樣品中待測

2、組分的響應(yīng)信號相比較進(jìn)行定量的方法稱為外標(biāo)法。此法可分為工作曲線法及外標(biāo)一點法等。工作曲線法是用對照物質(zhì)配制一系列濃度的對照品溶液確定工作曲線，求出斜率、截距。在完全相同的條件下，準(zhǔn)確進(jìn)樣與對照品溶液相同體積的樣品溶液，根據(jù)待測組分的信號，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度，或用回歸方程計算，工作曲線法也可以用外標(biāo)二點法代替。通常截距應(yīng)為零，若不等于零說明存在系統(tǒng)誤差。工作曲線的截距為零時，可用外標(biāo)一點法(直接比較法)定量。 外標(biāo)一點法是用一種濃度的對照品溶液對比測定樣品溶液中i組分的含量。將對照品溶液與樣品溶液在相同條件下多次進(jìn)樣，測得峰面積的平均值，用下式計算樣品中i組分的量：WA(W)(A)(7.3

3、6)式中W與A分別代表在樣品溶液進(jìn)樣體積中所含i組分的重量及相應(yīng)的峰面積。(W)及(A)分別代表在對照品溶液進(jìn)樣體積中含純品i組分的重量及相應(yīng)峰面積。外標(biāo)法方法簡便，不需用校正因子，不論樣品中其他組分是否出峰，均可對待測組分定量。但此法的準(zhǔn)確性受進(jìn)樣重復(fù)性和實驗條件穩(wěn)定性的影響。此外，為了降低外標(biāo)一點法的實驗誤差，應(yīng)盡量使配制的對照品溶液的濃度與樣品中組分的濃度相近。三、內(nèi)標(biāo)法選擇樣品中不含有的純物質(zhì)作為對照物質(zhì)加入待測樣品溶液中，以待測組分和對照物質(zhì)的響應(yīng)信號對比，測定待測組分含量的方法稱為內(nèi)標(biāo)法?！皟?nèi)標(biāo)”的由來是因為標(biāo)準(zhǔn)(對照)物質(zhì)加入到樣品中，有別于外標(biāo)法。該對照物質(zhì)稱為內(nèi)標(biāo)物。在一個分

4、析周期內(nèi)不是所有組分都能流出色譜柱(如有難氣化組分)，或檢測器不能對每個組分都產(chǎn)生信號，或只需測定混合物中某幾個組分的含量時，可采用內(nèi)標(biāo)法。準(zhǔn)確稱量W克樣品，再準(zhǔn)確稱量W克內(nèi)標(biāo)物，加入至樣品中，混勻，進(jìn)樣。測量待測組分i的峰面積A及內(nèi)標(biāo)物的峰面積A，則i組分在W克樣品中所含的重量W，與內(nèi)標(biāo)物的重量W，有下述關(guān)系：(7.37)待測組分i在樣品中的百分含量C為：(7.38)對內(nèi)標(biāo)物的要求；內(nèi)標(biāo)物是原樣品中不含有的組分，否則會使峰重疊而無法準(zhǔn)確測量內(nèi)標(biāo)物的峰面積；內(nèi)標(biāo)物的保留時間應(yīng)與待測組分相近，但彼此能完全分離(R1.5)；內(nèi)標(biāo)物必須是純度合乎要求的純物質(zhì)。內(nèi)標(biāo)法的優(yōu)點是：在進(jìn)樣量不超限(色譜柱不

5、超載)的范圍內(nèi)，定量結(jié)果與進(jìn)樣量的重復(fù)性無關(guān)。只要被測組分及內(nèi)標(biāo)物出峰，且分離度合乎要求，就可定量，與其他組分是否出峰無關(guān)。很適用于測定藥物中微量有效成分或雜質(zhì)的含量。由于雜質(zhì)(或微量組分)與主要成分含量相差懸殊，無法用歸一化法測定含量，用內(nèi)標(biāo)法則很方便。加一個與雜質(zhì)量相當(dāng)?shù)膬?nèi)標(biāo)物。加大進(jìn)樣量突出雜質(zhì)峰，測定雜質(zhì)峰與內(nèi)標(biāo)峰面積之比，即可求出雜質(zhì)含量。但樣品配制比較麻煩和內(nèi)標(biāo)物不易找尋是其缺點。一、內(nèi)標(biāo)法 什么叫內(nèi)標(biāo)法?怎樣選擇內(nèi)標(biāo)物? 內(nèi)標(biāo)法是一種間接或相對的校準(zhǔn)方法。在分析測定樣品中某組分含量時，加入一種內(nèi)標(biāo)物質(zhì)以校誰和消除出于操作條件的波動而對分析結(jié)果產(chǎn)生的影響，以提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確度。

6、內(nèi)標(biāo)法在氣相色譜定量分析中是一種重要的技術(shù)。使用內(nèi)標(biāo)法時，在樣品中加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，它可被色譜拄所分離，又不受試樣中其它組分峰的干擾，只要測定內(nèi)標(biāo)物和待測組分的峰面積與相對響應(yīng)值，即可求出待測組分在樣品中的百分含量。采用內(nèi)標(biāo)法定量時，內(nèi)標(biāo)物的選擇是一項十分重要的工作。理想地說，內(nèi)標(biāo)物應(yīng)當(dāng)是一個能得到純樣的己知化合物，這樣它能以準(zhǔn)確、已知的量加到樣品中去，它應(yīng)當(dāng)和被分析的樣品組分有基本相同或盡可能一致的物理化學(xué)性質(zhì)(如化學(xué)結(jié)構(gòu)、極性、揮發(fā)度及在溶劑中的溶解度等)、色譜行為和響應(yīng)特征，最好是被分析物質(zhì)的一個同系物。當(dāng)然，在色譜分析條什下，內(nèi)標(biāo)物必須能與樣品中各組分充分分離。需要指出的是，在少數(shù)

7、情況下，分析人員可能比較關(guān)心化臺物在一個復(fù)雜過程中所得到的回收率，此時，他可以使用一種在這種過程中很容易被完全回收的化臺物作內(nèi)標(biāo)，來測定感興趣化合物的百分回收率，而不必遵循以上所說的選擇原則。 在使用內(nèi)標(biāo)法定量時，有哪些因素會影響內(nèi)標(biāo)和被測組分的峰高或峰面積的比值? 影響內(nèi)標(biāo)和被測組分峰高或峰面積比值的因素主要有化學(xué)方面的、色譜方面的和儀器方面的三類。 由化學(xué)方面的原因產(chǎn)生的面積比的變化常常在分析重復(fù)樣品時出現(xiàn)。 化學(xué)方面的因素包括： 1、內(nèi)標(biāo)物在樣品里混合不好； 2、內(nèi)標(biāo)物和樣品組分之間發(fā)生反應(yīng)， 3、內(nèi)標(biāo)物純度可變等。 對于一個比較成熟的方法來說，色譜方面的問題發(fā)生的可能性更大一些，色譜上

8、常見的一些問題(如滲漏)對絕對面積的影響比較大，對面積比的影響則要小一些，但如果絕對面積的變化已大到足以使面積比發(fā)生顯著變化的程度，那么一定有某個重要的色譜問題存在，比如進(jìn)樣量改變太大，樣品組分濃度和內(nèi)標(biāo)濃度之間有很大的差別，檢測器非線性等。進(jìn)樣量應(yīng)足夠小并保持不變，這樣才不致于造成檢測器和積分裝置飽和。如果認(rèn)為方法比較可靠，而色譜固看來也是正常的話，應(yīng)著重檢查積分裝置和設(shè)置、斜率和峰寬定位。對積分裝置發(fā)生懷疑的最有力的證據(jù)是：面積比可變，而峰高比保持相對恒定， 在制作內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線時應(yīng)注意什么? 在用內(nèi)標(biāo)法做色話定量分析時，先配制一定重量比的被測組分和內(nèi)標(biāo)樣品的混合物做色譜分析，測量峰面積，做

9、重量比和面積比的關(guān)系曲線，此曲線即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。在實際樣品分析時所采用的色譜條件應(yīng)盡可能與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時所用的條件一致，因此，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時，不僅要注明色譜條件(如固定相、柱溫、載氣流速等)，還應(yīng)注明進(jìn)樣體積和內(nèi)標(biāo)物濃度。在制作內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線時，各點并不完全落在直線上，此時應(yīng)求出面積比和重量比的比值與其平均位的標(biāo)準(zhǔn)偏差，在使用過程中應(yīng)定期進(jìn)行單點校正，若所得值與平均值的偏差小于2，曲線仍可使用，若大于2，則應(yīng)重作曲線，如果曲線在鉸短時期內(nèi)即產(chǎn)生變動，則不宜使用內(nèi)標(biāo)法定量。 二、外標(biāo)法 用待測組分的純品作對照物質(zhì)，以對照物質(zhì)和樣品中待測組分的響應(yīng)信號相比較進(jìn)行定量的方法稱為外標(biāo)法。此法可分為工作曲

10、線法及外標(biāo)一點法等。工作曲線法是用對照物質(zhì)配制一系列濃度的對照品溶液確定工作曲線，求出斜率、截距。在完全相同的條件下，準(zhǔn)確進(jìn)樣與對照品溶液相同體積的樣品溶液，根據(jù)待測組分的信號，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度，或用回歸方程計算，工作曲線法也可以用外標(biāo)二點法代替。通常截距應(yīng)為零，若不等于零說明存在系統(tǒng)誤差。工作曲線的截距為零時，可用外標(biāo)一點法(直接比較法)定量。 外標(biāo)一點法是用一種濃度的對照品溶液對比測定樣品溶液中i組分的含量。將對照品溶液與樣品溶液在相同條件下多次進(jìn)樣，測得峰面積的平均值，用下式計算樣品中i組分的量： WA(W)(A) 式中W與A分別代表在樣品溶液進(jìn)樣體積中所含i組分的重量及相應(yīng)的峰面積。(W)及 (A)分別代表在對照品溶液進(jìn)樣體積中含純品i組分的重量及相應(yīng)峰面積。外標(biāo)法方法簡便，不需用校正因子，不論樣品中其他組分是否出峰，均可對待測組分定量。但此法的準(zhǔn)確性受進(jìn)樣重復(fù)性和實驗條件穩(wěn)定性的影響。此外，為了降低外標(biāo)一點法的實驗誤差，應(yīng)盡量使配制的對照品溶液的濃度與樣品中組分的濃度相近。 外標(biāo)法 e