第09章酶免疫技術(shù)

1、第九章酶免疫技術(shù)第一節(jié)酶免疫技術(shù)的特點(diǎn)一、酶和酶作用底物二、酶標(biāo)記抗體或抗原三、固相載體思考題小結(jié)第二節(jié)酶免疫技術(shù)的分類一、均相酶免疫測定二、非均相酶免疫測定第三節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)一、基本原理二、方法類型及反應(yīng)原理三大經(jīng)典標(biāo)記技術(shù)發(fā)光免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)第一節(jié) 酶免疫技術(shù)的特點(diǎn)原理及特點(diǎn)抗原抗體反應(yīng)的特異性+酶高效催化反應(yīng)的專一性主要試劑:酶標(biāo)記的抗體或抗原酶標(biāo)物特點(diǎn)：免疫學(xué)活性酶對底物的催化活性原理及特點(diǎn)特點(diǎn)： 靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好 酶標(biāo)記試劑能夠較長時(shí)間保持穩(wěn)定 操作簡便、對環(huán)境沒有污染。 易與其它技術(shù)偶聯(lián) 衍生出適用范圍更廣的新方法。原理： 酶標(biāo)抗體（抗原）與抗原（抗體

2、）的特異性反應(yīng) 酶對底物的顯色反應(yīng) 對抗原或抗體進(jìn)行定位、定性或定量的測定分析一、酶和酶作用底物標(biāo)記酶的要求：活 性 高 性質(zhì)穩(wěn)定專一性強(qiáng)酶催化底物的顯色信號易于判斷和測量方法敏感，重復(fù)性好，簡單易行酶的底物易于配制保存，酶及底物價(jià)廉酶和酶作用底物 常用酶RZ值與酶活性無關(guān)， 酶活性單位比RZ值 更為重要糖蛋白（主酶）亞鐵血紅素（輔基） 主酶與酶活性無關(guān) 輔基是酶的活性中心辣根過氧化物酶（HRP）RZ值：403nm （輔基） 與275nm（主酶）OD值之比ELISA中應(yīng)用最為廣泛的標(biāo)記用酶酶和酶作用底物 常用酶菌源性AP 腸粘膜AP堿性磷酸酶（AP）用于均相酶免疫測定半乳糖苷酶（-Gal）酶和

3、酶作用底物 常用底物HRP的底物HRPDH +H O 222D+2H2OH2O2為受氫體，HRP對受氫體的專一性很高供氫體DH2習(xí)慣上被稱為底物，底物有多種酶和酶作用底物 常用底物四甲基聯(lián)苯胺 TMB鄰苯二胺 OPD5-氨基水楊酸5-ASAHRP的常見底物2,2-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽 ABTS酶和酶作用底物TMB反應(yīng)后顯藍(lán)色 ， 加酸終止反應(yīng)后變?yōu)辄S色,測定波長450nm ，穩(wěn)定，無致癌性，ELISA中 應(yīng)用最廣泛的底物。OPD反應(yīng)后顯橙黃色，加酸終止 反應(yīng)后呈棕黃色，測定波長492nm。不穩(wěn)定，致癌性。HRP的常見底物酶和酶作用底物 常用底物經(jīng)AP作用后的產(chǎn)物為黃色對

4、硝基酚，最大吸收峰波長為405 nm。對-硝基苯磷酸酯（ pNPP ）AP的底物酶作用后，生成高強(qiáng)度熒光物 ，用熒光計(jì) 測量。4-甲基傘酮基-D半-乳糖苷（ 4MUG ）-Gal 的底物二、酶標(biāo)記抗體或抗原酶免疫技術(shù)的核心組成部分酶結(jié)合物（conjugate）酶標(biāo)記物通過化學(xué)反應(yīng)或免疫學(xué)反應(yīng)，讓酶與抗體或抗原形成的結(jié)合物酶標(biāo)記抗體或抗原制備方法要求 抗原要求純度高，抗原性完整 抗體需要特異性好、效價(jià)高、親合力強(qiáng)以及比活性較高，能批量生產(chǎn)，易純化。酶標(biāo)記抗體或抗原技術(shù)方法簡單、產(chǎn)率高，重復(fù)性好制備方法要求標(biāo)記反應(yīng)不影響酶和抗原或抗體的活性酶標(biāo)記物穩(wěn)定 ，不形成聚合物酶標(biāo)記抗體或抗原過碘酸鈉法（直

5、接法）常用于HRP標(biāo)記抗體或抗原 制備方法戊二醛交聯(lián)法酶標(biāo)記抗體或抗原戊二醛交聯(lián)法戊二醛分子中有兩個(gè)相同的醛基，可分別與HRP和蛋白質(zhì)分子中的氨基結(jié)合。該法有一步法和二步法。二步法標(biāo)記效率比一步法高，酶標(biāo)記物質(zhì)量較均一。酶標(biāo)記抗體或抗原標(biāo)記完成后應(yīng)除去反應(yīng)液中的游離酶、游離抗體或抗原、酶聚合物以及抗體 或抗原聚合物，避免游離酶增加非特 異顯色，以及游離抗體或抗原起競爭作用而降低特異性染色強(qiáng)度純化及鑒定常用的純化方法：葡聚糖凝膠G-200/G-150過柱層析純化50%飽和硫酸銨沉淀提純?nèi)?、固相載體 固相抗體或抗原就是把抗體或抗原結(jié)合到固相載體的表面 固相抗體或抗原是非均相酶免技術(shù)中將游離和結(jié)合的

6、酶標(biāo)記物迅速分離的最常用方法固相載體要求種類 塑料制品 微顆粒 膜載體 結(jié)合抗體或抗原的容量大 抗體或抗原牢固地固定在其表面 不影響免疫反應(yīng)性 利于反應(yīng)充分進(jìn)行 固相方法簡便易行，快速經(jīng)濟(jì)包被與封閉包被coating將抗原或抗體結(jié)合于固相載體封閉blocking用1%5%的牛血清白蛋白或5%20%小牛血清消除固相載體表面未結(jié)合的位點(diǎn)，消除非特異性吸附第二節(jié)酶免疫技術(shù)分類酶免疫組化酶免疫技術(shù)組織切片或其它標(biāo)本中抗原的定位均 相酶免疫測定液體標(biāo)本中抗原或抗體的定性和定量固相酶免疫測定非均相液相酶免疫測定一、均相酶免疫測定 用于小分子激素和半抗原（如藥物）的測定原理酶標(biāo)記物與相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合后，

7、標(biāo)記酶的活性會發(fā)生改變，不用分離結(jié)合和游離酶標(biāo)記物，通過測定標(biāo)記酶的活性的改變，而確定抗原或抗體的含量。均相酶免疫測定酶放大免疫測定技術(shù)EMITenzyme-mutiplied immunoassay technique克隆酶供體免疫分析 CEDIAcloned enzyme donor immunoassay最具代表性的兩種技術(shù) EMIT示意圖 CEDIA示意圖二、非均相酶免疫測定與均相不同之處需分離游離與結(jié)合的酶標(biāo)記物 分類：液相酶免疫測定固相酶免疫測定以聚苯乙烯等材料作為固相載體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） 是目前最為常用的固相酶免疫測定第三節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)一、基本原理原理反應(yīng)加入

8、待測抗體或抗原和酶標(biāo)抗原或抗體2包被1洗滌使結(jié)合在固相上的抗原抗體復(fù)合物與未結(jié)合的分離34底物顯色定性或定量的分析二、方法類型及反應(yīng)原理三個(gè)必要試劑固相的抗原或抗體酶標(biāo)記物（酶結(jié)合物）酶反應(yīng)的底物ELISA檢測抗原的方法雙抗體夾心法 方法：用已知抗體包被，加入待檢血清，再加酶標(biāo)抗體，加底物顯色 應(yīng)用：二價(jià)或二價(jià)以上的較大分子抗原測定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等+- 雙抗體夾心法測抗原EELISA檢測抗原的方法。競爭法方法：用已知抗體包被，加入待測血清，再加酶標(biāo)抗原，酶標(biāo)抗原與待檢物競爭與包被物結(jié)合。加底物顯色應(yīng)用：用于只有一個(gè)抗原決定簇的小分子半抗原（藥物、激素等）1、已知抗體包被于載

9、體表面1、已知抗體包被于載體表面2、加待檢物抗原與酶標(biāo)抗原競爭與抗體結(jié)合2、加待測物和酶標(biāo)抗原， 酶標(biāo)抗原與抗體結(jié)合3、加酶作用的底物不顯色或顯色弱3、加酶作用的底物顯色+- 競爭法測抗原ELISA檢測抗體的方法間接法 方法用已知抗原包被，加入待測血清，再加酶標(biāo)的抗人IgG（抗抗體或二抗）加底物顯色。 優(yōu)點(diǎn)一種酶標(biāo)抗抗體檢測各種與抗原相應(yīng)的抗體 應(yīng)用常用于HCV抗體、HIV抗體和螺旋體抗體等的測定 間接法測抗體-+ELISA檢測抗體的方法雙抗原夾心法 原理：類似雙抗體夾心法 操作步驟：類似 應(yīng)用：乙型肝炎表面抗體ELISA檢測抗體的方法競爭法 原理：類似檢測抗原的競爭法 應(yīng)用：乙型肝炎病毒核心

10、抗體(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗體(HBeAb)的檢測ELISA檢測抗體的方法捕獲法應(yīng)用：病原體急染診斷中的IgM型抗體甲型肝炎HAV-IgM抗體乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗體原理：抗體加入特異性抗原和酶標(biāo)記特異性抗原的抗體底物顯色捕獲法1、固相化抗人IgM1、固相化抗人IgM2、加待測物特異性IgM與非特異性IgM和抗人IgM結(jié)合2、加待測物只有非特異性IgM和抗人IgM結(jié)合3、加特異性抗原，與特異性抗體結(jié)合3、加特異性抗原，不能與非特異性IgM結(jié)合4、加酶標(biāo)抗體與特異性抗原結(jié)合，加底物顯色4、加酶標(biāo)抗體無抗原結(jié)合，加底物不顯色+- 捕獲法原理第四節(jié) 酶免疫測定的應(yīng)用均相酶免疫測定主

11、要用于藥物和小分子物質(zhì)的檢測。非均相免疫測定中的ELISA 應(yīng)用更為廣泛， ELISA 廣泛用于傳染病的診斷，病毒如病毒性肝炎（甲肝抗體、“乙肝三對”、丙肝抗體、丁肝抗體、戊肝抗體）、風(fēng)疹病毒、皰疹病毒、輪狀病毒等；細(xì)菌如結(jié)核桿菌、幽門螺桿菌等。也用于一些蛋白質(zhì)檢測，如各種免疫球蛋白、補(bǔ)體、腫瘤標(biāo)志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特異性抗原等）。思考題1. 酶免疫技術(shù)的要點(diǎn)？2. 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的原理（ELISA）？3. 競爭法在酶聯(lián)免疫檢測應(yīng)用中的原理和應(yīng)用？4. 常用的底物有哪幾類？特點(diǎn)？5. 常用的酶有哪幾類？特點(diǎn)？6. 何謂包被與封閉？其作用？7. 常用固相載體的種類和特點(diǎn)？8. 舉例固相酶免疫測定應(yīng)用的原理及影響因素。9. ELISA的非特異性干擾有哪些，其機(jī)制？10. 對酶免疫技術(shù)的應(yīng)用評價(jià)如何？小 結(jié)酶免疫技術(shù)是標(biāo)記免疫技術(shù)的一種，它是以酶標(biāo)記的抗原或抗體作為主要試劑的免疫檢測方法，在抗原與抗體的特異性反應(yīng)完成后，通過酶對底物的作用進(jìn)一步提高敏感性。酶免疫技術(shù)可分為酶免疫