玻璃實(shí)驗(yàn)器皿清洗方法

1、1 清洗在組織細(xì)胞培養(yǎng)中，體外細(xì)胞對任何有害物質(zhì)都非常敏感,均能影響培養(yǎng)細(xì)胞的生長微生物產(chǎn)品附帶雜物上次細(xì)胞殘留物非營養(yǎng)成分的化學(xué)物質(zhì)需要清洗的培養(yǎng)用品玻璃器皿的清洗膠塞的清洗塑料制品的清洗玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和沖洗四個步驟清洗后的玻璃器皿干凈透明無油跡不能殘留任何物質(zhì)浸泡：初次使用和培養(yǎng)使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附著物軟化或被溶掉新的初次使用的玻璃器皿，在生產(chǎn)及運(yùn)輸過程中，玻璃表面帶有大量的干固的灰塵，且玻璃表面常呈堿性及帶有一些對細(xì)胞有害的物質(zhì)等先用自來水簡單刷洗，然后用5稀鹽酸液浸泡過夜，以中和其中的堿性物質(zhì)再次使用的玻璃器皿則常附有大量剛使用過的蛋白質(zhì)，干固后

2、不易洗掉用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有氣泡或浮在液面上刷洗：用毛刷沾洗滌劑刷洗，以除去器皿表面附著較牢的雜質(zhì)刷洗要適度，過度會損害器皿表面光澤度浸酸：玻璃器皿浸泡到清潔液中清潔液對玻璃器皿無腐蝕作用，而其強(qiáng)氧化作用可除掉刷洗不掉的微量雜質(zhì)浸泡時(shí)器皿要充滿清潔液，勿留氣泡或器皿露出清潔液面浸泡時(shí)間：一般為過夜，不應(yīng)少于6 小時(shí)清潔液 常用三種：重鉻酸鉀（g）濃硫酸（ml）蒸餾水（ml） 強(qiáng)清潔液 631000200 次強(qiáng)清洗液 120 2001000 弱清潔液 100 1001000配制時(shí)應(yīng)注意安全，須穿戴耐酸手套和圍裙，并要保護(hù)好面部及身體裸露部分配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后

3、慢慢加濃硫酸。并不停的用玻璃棒攪拌，使產(chǎn)生的熱量揮發(fā)，配制溶液應(yīng)選擇塑料制品。配成后清潔液一般為棕紅色 沖洗在使用后，刷洗及浸泡后都必須用水充分沖洗。使之盡量不留污染或清潔液的殘跡最好用洗滌裝置如用手工操作需流水沖洗十次以上，每次水須灌滿及倒干凈，最好用蒸餾水清洗3-5 次，晾干備用膠塞的清洗新購置的瓶塞帶有大量滑石粉及雜質(zhì)，應(yīng)先用自來水沖洗，再做常規(guī)處理常規(guī)清洗方法每次用后立即置入水中浸泡，用2% NaOH 或洗衣粉煮沸10-20 分鐘（以除掉培養(yǎng)中的蛋白質(zhì)），自來水沖洗，蒸餾水沖洗2-3次，晾干備用塑料制品的清洗塑料制品現(xiàn)多是采用無毒并已經(jīng)特殊處理的包裝，打開包裝即可用，多為一次性物品必要

4、時(shí)用2% NaOH 浸泡過夜，用自來水充分沖洗，再用5%鹽酸溶液浸泡30 分鐘，最后用自來水和蒸餾水沖洗干凈，晾干備用消毒細(xì)胞培養(yǎng)的最大危險(xiǎn)是發(fā)生培養(yǎng)物的細(xì)菌、真菌和病毒等微生物的污染常見原因：操作間或周圍空間的不潔培養(yǎng)器皿和培養(yǎng)液消毒不合格或不徹底由于有關(guān)培養(yǎng)的每個環(huán)節(jié)的失誤均能導(dǎo)致培養(yǎng)失敗，故細(xì)胞培養(yǎng)的每個環(huán)節(jié)都應(yīng)嚴(yán)格遵守操作常規(guī)，防止發(fā)生污染消毒滅菌方法物理消毒滅菌法紫外線：用于空氣，操作臺表面和不能使用其它法進(jìn)行消毒的培養(yǎng)器皿，30min濕熱（高壓蒸氣滅菌法）：121，20min干烤：160, 2 小時(shí)過濾：0.22m化學(xué)消毒滅菌法70%酒精主要用于操作者的皮膚，操作臺表面及無菌室內(nèi)的

5、壁面處理1新潔爾滅主要用于器械的浸泡及皮膚和操作室壁面的擦試消毒抗生素主要用于培養(yǎng)用液滅菌或預(yù)防培養(yǎng)物污染2 細(xì)胞培養(yǎng)常用物品水水的制備：  細(xì)胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質(zhì)。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈細(xì)胞培養(yǎng)基市場上可提供干粉培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基干粉培養(yǎng)基需使用者自己配制并滅菌，其優(yōu)點(diǎn)是價(jià)格便宜。缺點(diǎn)是配制過程繁瑣，質(zhì)量不易控制液體培養(yǎng)基是由專業(yè)廠家按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)?；a(chǎn)，不僅質(zhì)量得到保證，而且使用十分方便常用的培養(yǎng)基種類RPMI-1640（標(biāo)準(zhǔn)型）、DMEM-高糖（標(biāo)準(zhǔn)型）、DMEM-低糖（標(biāo)準(zhǔn)型）、McCoys 5A、M199、F10等細(xì)胞培養(yǎng)基應(yīng)用選擇選擇培養(yǎng)基

6、沒有一定的標(biāo)準(zhǔn)，有幾點(diǎn)建議可供參考： (1 ）建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)該是培養(yǎng)這種細(xì)胞首選的培養(yǎng)基?？梢圆殚唴⒖嘉墨I(xiàn)，或在購買細(xì)胞株時(shí)咨詢。 (2) 其它實(shí)驗(yàn)室慣用的培養(yǎng)基不妨一試，許多培養(yǎng)基可以適合多種細(xì)胞。 (3) 根據(jù)細(xì)胞株的特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)的需要來選擇培養(yǎng)基。如小鼠細(xì)胞株多選 RPMI1640 。 (4) 用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細(xì)胞，觀察其生長狀態(tài)，可以用生長曲線、集落形成率等指標(biāo)判斷，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基，這是最客觀的方法，但比較繁瑣。制備1000mlRPMI 1640培養(yǎng)基RPMI 1640 干粉培養(yǎng)基10.4g（1包） 蒸餾水 400ml 磁力攪拌

7、至完全溶解  加三蒸餾水定容至1000ml 在超凈臺內(nèi)無菌條件下，用滅菌后的并置有0.22m孔徑濾膜的過濾器除菌，并分裝成200ml/瓶，-20保存?zhèn)溆谩?用前取一瓶溶解，每200ml培養(yǎng)液加滅活的小牛血清至終濃度為10%，即加22ml。再加青霉素和鏈霉素至終濃度各為100U/ml。 - 細(xì)胞培養(yǎng)液血清熱滅活：56, 30 分鐘加熱已完全解凍的血清熱滅活目的：滅活血清中的補(bǔ)體成分。如果不做細(xì)胞因子和免疫相關(guān)的實(shí)驗(yàn)，建議血清不要滅活。  因?yàn)闊崽幚頃斐裳宄恋砦镲@著增多，還會影響血清的質(zhì)量。滅活后嚴(yán)重影響細(xì)胞生長速度，且細(xì)胞貼壁率降低。血清中的沉淀物絮狀物：血清中的脂蛋白變

8、性及解凍后血清中纖維蛋白造成，這些絮狀物不會影響血清本身的質(zhì)量?？捎秒x心3000rpm, 5 分鐘去除，也可不用處理顯微鏡下“小黑點(diǎn)”：經(jīng)過熱處理過的血清，沉淀物的形成會顯著增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察象“小黑點(diǎn)”，常誤認(rèn)為血清受污染。一般情況下，此小黑點(diǎn)不會影響細(xì)胞生長，但如果懷疑血清質(zhì)量，則應(yīng)立即停止使用，更換另一批號的血清平衡鹽液體組織細(xì)胞培養(yǎng)中常用的基本液體，可以維持滲透壓、調(diào)節(jié)pH值、供給細(xì)胞生存所需的能量和無機(jī)離子成分用于洗滌組織、細(xì)胞等PBS（Phosphate-Buffered Sallines）KCl 0.20g KH2PO4 0.20g NaCl 8.00g Na2HPO

9、47H2O 2.16gDPBS（Dulbeccos Phosphate-Buffered Sallines）標(biāo)準(zhǔn)型 CaCl2(anhyd.)(無水氯化鈣) 0.10g KCl 0.20g KH2PO4 0.20g MgCl26H2O 0.10g NaCl 8.00g Na2HPO47H2O 2.16gD-Hanks 平衡鹽溶液(D-Hanks Balanced Salt Solutions, D-HBSS) KCl 0.40g KH2PO4 0.06g NaCl 8.00g NaCO3 0.35g Na2HPO4 0.048g D-Glucose 1.00g Phenol Red 0.01g

10、 消化液分離組織和分散細(xì)胞常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二鈉(EDTA)兩種溶液單獨(dú)或混合使用胰蛋白酶溶液主要作用：使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，使細(xì)胞相互離散消化細(xì)胞時(shí)，加入一些血清或含血清的培養(yǎng)液，能終止消化作用胰蛋白酶溶液配制稱取胰蛋白酶粉末置燒杯中，用少許D-Hanks 平衡鹽溶液調(diào)成糊狀，再補(bǔ)足D-Hanks 平衡鹽溶液，攪拌混勻，置室溫4 小時(shí)或冰箱過夜，不斷攪拌振蕩次日，先用濾紙粗濾，再進(jìn)行過濾除菌，分裝入瓶中， -20保存?zhèn)溆茫ㄒ悦夥纸馐В?，常用濃度?.25% （0.1%-0.5%）胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可用碳酸氫鈉溶液調(diào)pH 至7.2 左右EDTA4Na 溶液一種化學(xué)螯合劑，對

11、細(xì)胞有一定的離散作用，而且毒性小，價(jià)格低廉，使用方便常用工作液濃度為0.02%。 注意：使用EDTA 處理細(xì)胞后，要用平衡鹽液沖洗干凈，因殘留的EDTA 會影響細(xì)胞生長EDTA 溶液配制：用D-Hanks 平衡鹽溶液溶解后，高壓蒸汽滅菌，分裝成小瓶，4冰箱保存pH 調(diào)整液NaHCO3 溶液常用濃度為7.5%。配制時(shí)用三蒸水溶解后，過濾除菌或高壓滅菌，分裝，4保存HEPES（分子量238.31）溶液一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，對細(xì)胞無毒性主要作用:防止培養(yǎng)基pH迅速變動。在開放式培養(yǎng)條件下，觀察細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)基脫離了5%CO2的環(huán)境，CO2氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此

12、時(shí)可以維持pH7.0左右。一般在進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時(shí)要添加HEPES使用終濃度一般為10-50mmol/L常配成1M 儲存液：用20ml 雙蒸水溶解4.76克HEPES，過濾除菌或高壓滅菌，分裝小瓶，4保存。使用時(shí)可向100ml培養(yǎng)液中加入2ml HEPES濃縮液，終濃度為20mmol/L 谷氨酰胺補(bǔ)充液谷氨酰胺在細(xì)胞代謝過程中起重要作用，合成培養(yǎng)基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定容易降解，4下放置7天即可分解約50%，所以都是在使用前添加配制好的培養(yǎng)液（含谷氨酰胺）在4放置2周以上時(shí)，要重新加入原來量的谷氨酰胺，故需單獨(dú)配制谷氨酰胺，以便臨時(shí)加入培養(yǎng)液內(nèi)使用終濃度為1-4mmol/L一般

13、配制為100倍濃縮液，即濃度為200mmol/L（29.22g/L），配制方法為 ：谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂螅☉?yīng)加溫30），過濾除菌，分裝小瓶，-20保存，使用時(shí)可向100ml培養(yǎng)液中加入0.5-2ml谷氨酰胺濃縮液，終濃度為1-4mmol/L 酚紅大多數(shù)培養(yǎng)液中使用酚紅作為pH 指示紅色表示中性pH，黃色代表酸性pH，紫色表示堿性pH在一些特殊培養(yǎng)液中不含酚紅因?yàn)橐延幸恍┭芯勘砻鳎悍蛹t能模擬類固醇激素（尤其是雌激素）樣作用抗生素溶液抗生素使用種類與濃度：      &

14、nbsp;        工作濃度 儲存溫度 殺滅細(xì)菌 penicillin 100 u/ml -20 G(+) streptomycin 100 ug/ml -20 G(+) 、G(-) gentamicin 50 ug/ml - 20 G(+) 、G(-)、支原體 amphotericin B 2.5 ug/ml -20 真菌 nystatin 50 ug/ml -20 真菌 器材和液體的準(zhǔn)備細(xì)胞培養(yǎng)用的玻璃器材培養(yǎng)瓶、吸管等在清洗干凈以后，裝在鋁盒和鐵筒中，160，2小時(shí)干烤滅菌后備用手術(shù)器材、瓶塞、配制好的PBS液1

15、5磅，121，20分鐘蒸氣滅菌MEM培養(yǎng)液、小牛血清、消化液用G6濾器負(fù)壓抽濾后備用   無菌操作中的注意事項(xiàng)在無菌操作中，一定要保持工作區(qū)的無菌清潔操作前無菌室及無菌操作臺以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘操作時(shí)，小心取用無菌之實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或容器瓶口，亦不要在打 開之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45角取用 在整個無菌操作過程中都應(yīng)該在酒精燈的周圍進(jìn)行哺乳動物細(xì)胞冷凍保存冷凍保存要點(diǎn)冷凍過程要緩慢。4 3060 分鐘-20

16、30 分鐘 -80 1618 小時(shí)（或過夜）液氮長期保存凍存細(xì)胞必須處在對數(shù)生長期，活力大于90，無微生物污染。細(xì)胞濃度控制在：11075107/ml。常用細(xì)胞冷凍保存液10DMSO 完全細(xì)胞生長培養(yǎng)液（20血清基礎(chǔ)培養(yǎng)液）10甘油 完全細(xì)胞生長培養(yǎng)液（20血清基礎(chǔ)培養(yǎng)液）冷凍保存細(xì)胞的解凍與復(fù)蘇要點(diǎn)快速解凍凍存細(xì)胞從液氮中取出后，立即放入37水浴中，輕輕搖動冷凍管，使其在1 分鐘內(nèi)全部融化（不要超過3 分鐘）解凍后的細(xì)胞可直接接種到含完全生長培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中直接進(jìn)行培養(yǎng)，24 小時(shí)后再用新鮮完全培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液，以去除DMSO如果細(xì)胞對冷凍保護(hù)劑特別敏感解凍后的細(xì)胞應(yīng)先通過離心去除冷凍

17、保護(hù)劑，然后再接種到含完全生長培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中解凍冷凍保存細(xì)胞的離心方法從液氮中取出凍存的細(xì)胞，立即放入37水浴中快速解凍將12ml 凍存細(xì)胞液加入到25ml 新鮮完全細(xì)胞生長培養(yǎng)液中，輕輕混勻用80g 離心23 分鐘，棄上清液用完全生長培養(yǎng)液輕輕懸浮細(xì)胞團(tuán)，并計(jì)數(shù)細(xì)胞接種細(xì)胞到培養(yǎng)瓶中，起始密度為3105/ml。細(xì)胞培養(yǎng)系列二 常用器材及處理方法 體外培養(yǎng)細(xì)胞使用的器材品種較多。由于離體細(xì)胞對各種毒物都很敏感，所以細(xì)胞培養(yǎng)所用器材的清洗、消毒處理是培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵之一。一、玻璃器材 常用的玻璃器材有各種規(guī)格的玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、吸管、離心管等。無論是初次使用還是培養(yǎng)后重復(fù)使用的玻璃器材

18、均需要進(jìn)行消毒處理。首次使用的玻璃器材應(yīng)先用自來水初步刷洗，然后用稀鹽酸溶液（1%）浸泡過夜，再用自來水沖洗，最后處理方法與重復(fù)使用的器皿的處理。重復(fù)使用的玻璃器皿的處理步驟：（1）刷洗。用軟毛刷和優(yōu)質(zhì)中性洗滌劑刷洗，去除器皿內(nèi)外表面的雜質(zhì)。刷洗時(shí)注意不要用力過重，以防損壞器皿內(nèi)表面光潔度，影響細(xì)胞生長；也不能留有死角。器皿數(shù)量大時(shí)，可使用超聲波清潔裝置，沖洗干凈后晾干。（2）清潔液處理。將刷洗晾干后的玻璃器皿放入硫酸-重鉻鉀清潔液中。清潔液配方如下，見下表：表 清潔液配方 名 稱*清潔液濃度25%(弱液)50%(次強(qiáng)液)75%(強(qiáng)液)重鉻酸鉀1000g1000g1000g濃 硫 酸2500m

19、L5000mL7500ML蒸餾水(或廢液)7500Ml5000mL2500mL該清潔液具有高度腐蝕性，操作時(shí)必須穿長筒膠靴，戴防酸橡皮手套，圍裙和眼鏡，以防清潔液濺出而灼傷。在配液時(shí)還需注意將酸緩慢放入水中，以防酸遇水放熱產(chǎn)生酸濺出或使玻璃及陶制容器裂開而使清潔液外泄。切勿將水加入酸中，以防酸濺出。常用清潔液為75%和50%兩種。將玻璃器皿放入時(shí)最好裝入塑料網(wǎng)袋內(nèi)，再浸入清潔液中，玻璃瓶內(nèi)不要?dú)埩魵馀荨Ｒ话憬?224小時(shí)后取出。在清潔液中取出的器皿先用自來水沖洗10次以上，再用單蒸水沖洗三次以上，最后用雙蒸水（或去離子水）沖洗12次，晾干，包裝殺菌。一般用121磅高壓蒸氣滅菌20分鐘。玻璃濾

20、器使用后及時(shí)用自來水沖洗濾器表面的剩余物，然后用單蒸水浸泡，除去濾板內(nèi)堵塞雜物，若用濾膜則將濾膜丟棄，加4N鹽酸浸泡12小時(shí)以上，用自來水沖洗，再用單蒸水抽濾2次，雙蒸水(或去離子水)抽濾沖洗、包裝、121高壓蒸氣滅菌20分鐘。也可用5%潔消精浸泡20分鐘后，再按上述方法沖洗和滅菌。 二、塑料器材 體外培養(yǎng)細(xì)胞中塑料器皿的使用越來越多，有進(jìn)口的，也有國產(chǎn)的。主要有多孔培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶及吸嘴。多孔培養(yǎng)板有4孔、6孔、24孔、96孔等規(guī)格可供選擇。多數(shù)為進(jìn)口產(chǎn)品，已消毒滅菌密封包裝，使用時(shí)只需打開即可。有一次性使用的，也有反復(fù)使用的。在我國不少實(shí)驗(yàn)室，由于經(jīng)費(fèi)有限，經(jīng)過清洗和消毒滅菌再使用的

21、較多。塑料器皿若使用后，先用自來水浸泡沖洗、晾干，再用3%HCl或2%NaOH溶液浸泡過夜，用自來水充分沖洗，或先用2%NaOH處理之后再用3%HCl浸泡30分鐘，最后用自來水沖洗干凈，并用雙蒸水沖洗3次以上，晾干。消毒采用紫外線直接照射或輻照滅菌辦法。清洗時(shí)要防止產(chǎn)生劃痕，以免影響細(xì)胞的貼附性。所以，培養(yǎng)要求較高的細(xì)胞的塑料器材，最好一次性使用。三、橡皮器材 應(yīng)選擇質(zhì)軟、耐高溫、毒性小的橡皮制品(最好是硅制品)做各種瓶或試管的塞子、蓋子。新購置的橡皮制品，用自來水沖洗去除其表面粉粒和污物。先用5%氫氧化鈉煮沸15分鐘，用自來水沖洗8次，再用4%鹽酸煮沸15分鐘，用自來水沖洗8次，單蒸水沖洗3次，雙蒸水(或去離子水)沖洗一次，晾干后包裝或置于鋁盒內(nèi)，用121高壓蒸氣滅菌20分鐘。已用過的橡皮制品，先用自來水沖洗干凈，然后用洗衣粉加熱煮沸10分鐘后，用自來水邊沖邊用力攪動，以充分洗凈殘余洗衣粉，然后用蒸餾水煮沸2