（醫(yī)學(xué)課件）高效液相色譜學(xué)習(xí)PPT培訓(xùn)課件.pptx

1、HPLC的使用與維護(hù),1,基本原理和特點(diǎn) 液相色譜儀器部件 實(shí)驗(yàn)操作與應(yīng)用 日常維護(hù),2,基本原理和特點(diǎn),基本原理：溶于流動(dòng)相(mobile phase)中的各組分經(jīng)過固定相時(shí),由于與 固定相(stationary phase)發(fā)生作用(吸附,分配,離子吸引,排阻,親和)的大小,強(qiáng) 弱不同,在固定相中滯留時(shí)間不同,從而先后從固定相中流出. 特點(diǎn)：分離效率高、分析速度快、應(yīng)用范圍廣、操作自動(dòng)化。,3,一些商品化儀器,脫氣裝置,四元泵,檢測(cè)器,柱溫箱,樣品盤,控溫箱,流動(dòng)相,4,啟動(dòng)液相色譜儀器的流程,開啟HPLC系統(tǒng)各個(gè)設(shè)備的電源 打開泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、檢測(cè)器電源， 待設(shè)備通過自檢后，打開計(jì)算機(jī)啟

2、動(dòng) 色譜管理軟件 準(zhǔn)備流動(dòng)相 過濾，脫氣 色譜泵排氣 用新配制的流動(dòng)相灌注泵,5,高效液相色譜儀組成,輸液系統(tǒng) 進(jìn)樣系統(tǒng) 分離系統(tǒng) 檢測(cè)系統(tǒng) 數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng),6,液相色譜流程圖,7,8,液相色譜的流動(dòng)相,9,液相柱-保留值與pH的關(guān)系,pH變化值 0.1,RS變化值1.6,色譜柱：Zorbax StableBond C18 4.6*250mm,5um 流動(dòng)相：27%甲醇：73%磷酸 pH： 2.5&2.6 溫度： 50 流速： 1.0mL/min.,10,2. 流動(dòng)相類別,按流動(dòng)相組成分：?jiǎn)谓M分和多組分 按極性分：極性、弱極性、非極性 按使用方式分：等度洗脫和梯度洗脫,11,對(duì)溶劑的要求,水

3、： 去離子水 自動(dòng)純水儀 純凈水 商品瓶裝水 溶劑: 色譜純（甲醇，乙腈，乙醇，丙酮，異丙醇） 試劑: 分析純,12,不管采用何種途徑，配制流動(dòng)相應(yīng)用新鮮水，水質(zhì)要求越高放置時(shí)間越短。 理想的HPLC用水應(yīng)為18.2的超純水，并通過0.22um的濾膜，除去熱源、有機(jī)物、無機(jī)離子及空氣等。,13,過濾：0.45um或更小孔徑濾膜 目的：除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其是使用無機(jī)鹽配制的緩沖液。 脫氣：除去流動(dòng)相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡 氣泡對(duì)測(cè)定的影響： 1）泵中氣泡使液流波動(dòng)，改變保留時(shí)間和峰面積 2）柱中氣泡使流動(dòng)相繞流，峰變形 3）檢測(cè)器中的氣泡產(chǎn)生基線波動(dòng),過濾與脫氣,14,

4、15,16,流動(dòng)相的保存,有機(jī)溶劑流動(dòng)相： 室溫下密封，避光保存 緩沖鹽流動(dòng)相： 當(dāng)日現(xiàn)配現(xiàn)用： 低溫下密封保存，一般不超過3天 防止微生物生長(zhǎng) 有機(jī)溶劑與水（緩沖鹽）混配的流動(dòng)相： 低溫密封保存 防止有機(jī)相的揮發(fā) 選用適宜的容器,17,1梯度洗脫的特點(diǎn),（1）改善分離, 加快分析速度； （2）改善峰形, 減少拖尾, 有利于痕量組分的檢測(cè)； （3）增加峰容量； （4）強(qiáng)烈滯留的組分不容易殘留在柱上, 保持柱性能長(zhǎng)期良好； （5）下次分析時(shí), 流動(dòng)相需要一段平衡時(shí)間；不同溶劑的UV吸收程度稍有差異, 可能會(huì)引起基線漂移,18,2梯度洗脫的主要條件, A 流動(dòng)相/弱溶劑組成； B 流動(dòng)相/強(qiáng)溶劑組

5、成； 梯度時(shí)間； 梯度曲線：線性、凸型或凹型等。,19,梯度洗脫,20,21,梯度：低壓混合,低壓梯度 用單泵產(chǎn)生梯度，泵前（低壓端）混合 對(duì)脫氣要求高 不易調(diào)節(jié)梯度的滯后體積 如設(shè)計(jì)不當(dāng)，梯度的準(zhǔn)確性受影響 滯后體積（系統(tǒng)體積）設(shè)計(jì)合理,22,梯度滯后：系統(tǒng)體積的影響,注意滯后體積包括進(jìn)樣器、阻尼 器、混合器及其管路,23,梯度滯后大小的影響,滯后體積太大會(huì)引起梯度變化的延遲 例如：滯后體積為2.0ml，流速1.0ml/min 實(shí)際梯度會(huì)比設(shè)置值晚 2 分鐘響應(yīng)，沒有問題 對(duì)微柱色譜影響更大，同上例但流速0.1ml/min 實(shí)際梯度會(huì)比設(shè)置值晚20 分鐘響應(yīng)，不能接受 滯后體積的不同會(huì)使方法

6、轉(zhuǎn)換麻煩 滯后體積比文獻(xiàn)大或小都會(huì)使方法不能重現(xiàn) 滯后體積的變化會(huì)導(dǎo)致梯度重現(xiàn)性不好 普通分析型液相色譜的滯后體積為24ml,24,滯后體積變化的影響,設(shè)計(jì)不好的HPLC系統(tǒng)，滯后體積隨反壓變化 滯后體積隨反壓變化的后果： 梯度的準(zhǔn)確性不好，造成：方法的適應(yīng)性不好 用靜態(tài)梯度混合器；固定滯后體積可明顯改善梯度特性,25,液相色譜的色譜柱,26,27,色譜柱的連接,Stop_depth長(zhǎng)度不合適造成柱前死體積,28,錐箍錐度不合適造成滲漏,色譜柱的連接,29,除去柱上端固定相變色部分 (約3mm左右)，再補(bǔ)充新的固定相。 色譜柱吸附未被洗脫成分時(shí)，柱效將明顯下降，選合適的溶劑進(jìn)行洗凈。 采用梯度

7、洗脫時(shí)，柱在重復(fù)使用前，用泵把幾倍于柱體積的起始溶劑壓經(jīng)柱子，以重新建立起始的平衡來得到再生。,可能提高柱效的方法,30,HPLC檢測(cè)器應(yīng)提供的功能,對(duì)樣品有響應(yīng)并有一個(gè)輸出信號(hào) 應(yīng)該提供在檢測(cè)器響應(yīng)值與樣品濃度之間的線性關(guān)系；并且所設(shè)計(jì)的校正技術(shù)應(yīng)該促進(jìn)這種關(guān)系,31,理想的HPLC檢測(cè)器,高靈敏度；可忽略的基線噪音 寬的線性范圍 獨(dú)立于流動(dòng)相及操作參數(shù)的響應(yīng) 對(duì)壓力、溫度及流速等變化不敏感 長(zhǎng)時(shí)間操作的穩(wěn)定性 低死體積 非破壞性 選擇性,32,靈敏度：信噪比,靈敏度是信號(hào)與噪音的比值；即峰高與基線噪音的比值（S/N） 檢測(cè)限（LOD）：S/N = 24 定量限（LOQ）：S/N = 810

8、 好的信噪比有利于： 更好的色譜峰確認(rèn) 更好的定量 更好地完成色譜峰純度/均一性,6:1,N,S,33,吸光度（Absorbance UV/Vis）檢測(cè),目前實(shí)驗(yàn)室中最流行的選擇 多數(shù)公司約75%的檢測(cè)器是吸光度檢測(cè)器（其中50%是多波長(zhǎng)，25%是PDA） 測(cè)量通過溶液后的紫外或可見光光強(qiáng)度的損失 吸光度與樣品濃度呈線性關(guān)系 在被測(cè)物的最大吸收波長(zhǎng)處檢測(cè)時(shí)靈敏度最大,34,吸光度檢測(cè)器（UV/Vis） 優(yōu)點(diǎn),這種檢測(cè)器簡(jiǎn)單、可靠 多數(shù)人熟悉并喜歡這種技術(shù) 可以作梯度實(shí)驗(yàn)并且是非破壞性的 大多數(shù)有機(jī)化合物有一定程度的吸光度 一般來說靈敏度還可以,35,吸光度檢測(cè)器（UV/Vis） 缺點(diǎn),由于不是

9、所有化合物都有吸光度，因此不是通用檢測(cè)器 對(duì)某些化合物的檢測(cè)靈敏度不及其他檢測(cè)器 樣品中不同化合物的最大吸收波長(zhǎng)不同時(shí)，需要使用多波長(zhǎng)檢測(cè)，或使用折衷的波長(zhǎng) 受流動(dòng)相組成的影響： 用截止波長(zhǎng)以上至少510nm作為工作波長(zhǎng) 緩沖鹽、離子對(duì)試劑、胺改性劑也會(huì)有影響,36,背景吸收對(duì)紫外檢測(cè)器噪音的影響,UV Spectrum of Eluents with 0.1% TFA Against HPLC Grade H2O Blank,37,溶劑混合的基線噪音,色譜條件 色譜柱： C18, 5 m, 3.9x150mm at 35 C. 流動(dòng)相： A: 0.1% TFA in Water. B: 0.

10、1% TFA in Acetonitrile. 梯度： 5 - 40% B in 35 min. 流速： 1.0 mL/min. 樣品： 水（10 L inj. vol.） 檢測(cè)： 214 nm,38,為何如此重要？,五個(gè)小肽的5ng進(jìn)樣，好的色譜系統(tǒng)非常容易鑒別出所有峰。在不好的色譜系統(tǒng)中，第一個(gè)峰則消失在基線噪音中。,39,基線噪音對(duì)積分的影響,40,維護(hù)流程圖,吸濾頭,單向閥,柱塞密封圈,線路過濾器,進(jìn)樣器,檢測(cè)器,41,吸濾頭定期清洗，更換溶劑時(shí) 單向閥定期清洗，壓力波動(dòng)大時(shí) 泵自動(dòng)清洗 在線過濾器壓力大時(shí)清洗,42,材料：不銹鋼燒結(jié)，孔徑10um 故障：堵塞 表現(xiàn)：管路中不斷有氣泡生

11、成 措施：用5稀硝酸，超聲波清洗， 再用蒸餾水清洗,吸濾頭,43,44,45,故障：寶石球或塑料墊片受污導(dǎo)致密封不好 表現(xiàn)：系統(tǒng)壓力波動(dòng)大 措施： 打開排液閥，以異丙醇為流動(dòng)相輸液 拆下單向閥，放入異丙醇中，超聲波清洗,單向閥,46,故障：堵塞 現(xiàn)象：系統(tǒng)壓力波動(dòng)大或壓力 偏高 措施：5稀硝酸，超聲波清洗 判斷依據(jù)：關(guān)閉排液閥，斷開出口管路，設(shè)定流速1mL/min，如壓力3kgf/cm2，則堵塞。,線路過濾器,47,泵的保養(yǎng)：,使用流動(dòng)相盡量要清潔； 進(jìn)液處的砂芯過濾頭要經(jīng)常清洗； 流動(dòng)相交換時(shí)要防止沉淀； 避免泵內(nèi)堵塞或有氣泡； 每次分析結(jié)束后，要反復(fù)沖洗進(jìn)樣口，防止樣品的交叉污染；,48,柱的保養(yǎng)：,柱子在任何情況下不能碰撞、彎曲或強(qiáng)烈震動(dòng)； 當(dāng)柱子和色譜儀聯(lián)結(jié)時(shí)，閥件或管路一定要清洗干凈； 要注意流動(dòng)相的脫氣； 避免使用高粘度的溶劑作為流動(dòng)相； 進(jìn)樣樣品要提純； 嚴(yán)格控制進(jìn)樣量； 每天分析工作結(jié)束后，要清洗進(jìn)樣閥中殘留的樣品； 每天分析測(cè)定結(jié)束后，都要用適當(dāng)?shù)娜軇﹣砬逑粗?若分析柱長(zhǎng)期不使用，應(yīng)用適當(dāng)有機(jī)溶劑保存并封閉；,49,色譜柱柱內(nèi)體積和平衡時(shí)間,單次樣品運(yùn)行時(shí)間 = 分析時(shí)間 + 色譜柱平衡時(shí)間 色譜柱平衡時(shí)間 = 10倍柱內(nèi)體積 流速,50,色譜柱清洗保存 反相色譜柱：用20%甲醇溶液清洗