體液蛋白質檢驗PPT課件

第七章 體液蛋白質與非蛋白質含氮化合物檢驗,1,一、血漿蛋白質的分類及功能 血漿蛋白質的分類組成 血漿蛋白質是血漿固體成份中含量最多、組成復雜、功能廣泛的一類化合物。占血漿固體成份90左右，目前已經研究的血漿蛋白質有500多種，分離出的純品物200來種，除免疫球蛋白外，主要由肝細胞合成。,第一節(jié) 概 述,2,（一）血漿蛋白質的功能 1. 維持血漿膠體滲透壓 清蛋白維持75%80%的血漿滲透壓。 2. 作為某些物質的載體 如清蛋白能與多種物質結合（FA、膽紅素），而某些球蛋白具特異地運輸某些物質的功能，運鐵蛋白、運皮質醇蛋白。 3. 維持體液pH恒定 血漿蛋白PI一般都小于7.4是弱酸，一部分的弱酸鹽形式存在，構成緩沖對。,3,4.免疫功能 血漿中許多具有免疫功能的球蛋白，主要由漿細胞合成，電泳時位于r區(qū)帶，如IgG、IgA、IgM、IgD、IgE，此外，還有具有免疫作用的非特異球蛋白，如補體。 5.凝血與纖溶作用 凝血與纖溶是一對矛盾的統(tǒng)一、凝血因子與纖溶因子絕大部分是血漿蛋白質，它們促進血液凝固，防止血液流失和溶解血栓，防止重要臟器的動脈栓塞。,4,6.營養(yǎng)作用 血漿蛋白質可分成AA，用于合成組織蛋白或氧化供能。 7.催化作用 血漿中有許多酶類，其中部分在血漿中發(fā)揮作用，稱血漿功能性酶，如凝血酶原、纖溶酶原、銅藍蛋白、LPL、LCAT、腎素等。,5,（二）血漿蛋白質的分類,1、根據分離方法分類鹽析法：白蛋白/球蛋白（pH7.0半飽和的硫酸銨溶液）,電泳法：,醋酸纖維素薄膜電泳：6種,瓊脂糖凝膠電泳：13種,聚丙烯酰胺凝膠電泳：30種,SDS聚丙烯酰胺凝膠等電雙向電泳：300種,分辨率增高,+,-,醋酸纖維素薄膜,纖維蛋白原,6,2、根據生理功能分類,7,二、血漿中常見血漿蛋白質特性 在炎癥、創(chuàng)傷、感染、心肌梗塞、腫瘤等情況下其血漿濃度會發(fā)生明顯改變的蛋白質稱為急性時相反應蛋白（acute phase reactants protein APRP）。主要包括AAG、AAT、Hp、CER、C3、C4、纖維蛋白原、CRP；PA、Alb、TRF。,8,（一）前清蛋白（pueallumun PA）電泳時移速比清蛋白快，位于其前方面得名。結構：分子量5.4萬，四個相同亞基形成的四聚體理化性質：PI=4.7，由肝細胞合成，半壽期短12h。測定方法：常用的方法是免疫化學方法功能:營養(yǎng)指標，載體功能（甲狀腺素維生素）。 【參考范圍】0.20.4g/L, 【臨床意義】急性炎癥，惡性腫瘤，肝硬化或腎炎時下降。,9,（二）視黃醇結合蛋白,視黃醇結合蛋白(Retinol-Binding Protein,RBP)是血液中維生素的轉運蛋白，由肝臟合成、廣泛分布于血液、腦脊液、尿液及其他體液中。測定視黃醇結合蛋白能早期發(fā)現(xiàn)腎小管的功能損害，并能靈敏反映腎近曲小管的損害程度，還可作為肝功能早期損害和監(jiān)護治療的指標。,10,降低維生素A缺乏癥、低蛋白血癥、吸收不良綜合征、肝疾病(除外營養(yǎng)過剩性脂肪肝)、阻塞性黃疸、甲狀腺功能亢進癥、感染癥、外傷等。升高腎功能不全、營養(yǎng)過剩性脂肪肝。尿液RBP：急慢性腎炎，糖尿病腎病；慢性腎衰1 血清RBP：急慢性肝炎；肝硬化；,11,（三）清蛋白（allumim, ALb）分子量66458，由肝實質細胞合成，半壽期1519天，是血漿中含量最多的蛋白質，占4060，主要功能，維持血漿膠體滲透性，緩沖作用，運輸作用，營養(yǎng)作用，調節(jié)某些激素或藥物活性。 清蛋白可微量地通過腎小球，約0.04，但大部分被腎小管重吸收。清蛋白的測定方法目前主要是溴甲酚綠（BCG）法。,12,【參考范圍】3555g/L 【臨床意義】血漿白蛋白增高臨床少見，主要見于嚴重失水引起血液濃縮。血漿白蛋白降低臨床常見。合成障礙急、慢性肝炎。丟失過多，腎病綜合癥、慢性腎小球、腎炎、糖尿病、系統(tǒng)性斑狼瘡等。分解過多，營養(yǎng)不良，慢性胃腸道疾病。,13,（四）1-抗胰蛋白酶（1AT或AAT），分子量5.5萬，pI4.8，含糖1012，電泳時位于1區(qū)帶，占90左右，由肝細胞合成，能抑制多種酶活性，尤其是蛋白酶，占血清中抑制蛋白酶活力的90左右，抑制作用有明顯的pH依賴性，在中性和弱堿性中活力最大。 AAT也是一種急性時相反應蛋白，主要功能是對抗多形核蛋白細胞吞噬作用時釋放的溶酶體蛋白水解酶。,14,AAT測定方法 目前主要采用免疫化學法。 【參考范圍】成人0.832.0g/L， 【臨床意義】AAT下降見于胎兒呼吸窘迫癥，AAT缺陷所致的肺氣腫、肝硬化等。AAT上升見于急性炎癥、外科手術后，長期服用可的松藥物，妊娠及服用避孕藥物。,15,（五）1-酸性糖蛋白（-AG或AAG）分子量約4萬，含糖約45，pI2.73.5，主要由肝細胞合成，某些腫瘤組織也可合成。AAG是主要的急性相反應蛋白，急性炎癥時上升，與免疫防御功能有關。 AAG測定方法 使用AAG抗體，進行免疫散法或免疫比濁法檢測， 【參考范圍】0.252.0g/L 【臨床意義】主要作為急性時相反應的指標，風濕病、惡性腫瘤、心肌梗塞患者上升，營養(yǎng)不良、嚴重肝病下降。,16,17,【參考范圍】1030g/L 【臨床意義】AFP作為腫瘤標志物，對原發(fā)性肝癌的診斷很有價值，80以上原發(fā)性肝癌患者血清AFP上升，但無特異性，肺癌、胰腺癌，肝硬化患者血清AFP亦升高，此外，羊水AFP含量測定可用于胎兒產前監(jiān)測，AFP增高，提示胎兒畸形（神經管缺損、脊柱裂、無腦兒）死胎。,18,（七）癌胚抗原,癌胚抗原是大腸癌組織產生的一種糖蛋白，作為抗原可引起患者的免疫反應。此種抗原稱為癌胚抗原（carcino-embryonic antigen CEA），可廣泛存在于內胚葉起源的消化系統(tǒng)癌，也存在于正常胚胎的消化管組織中，在正常人血清中也可有微量存在。 癌胚抗原是一個廣譜性腫瘤標志物，它能向人們反映出多種腫瘤的存在，對大腸癌、乳腺癌和肺癌的療效判斷、病情發(fā)展、監(jiān)測和預后估計是一個較好的腫瘤標志物，但其特異性不強，靈敏度不高，對腫瘤早期診斷作用不明顯。,19,CEA最初發(fā)現(xiàn)于結腸癌和胎兒腸組織中，故名癌胚抗原。CEA升高常見于大腸癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、甲狀腺髓樣癌等。但吸煙、妊娠期和心血管疾病、糖尿病、非特異性結腸炎等疾病，15%53%的病人血清CEA也會升高，所以CEA不是惡性腫瘤的特異性標志，在診斷上只有輔助價值。此外，血清CEA水平與大腸癌的分期有明確關系，越晚期的病變，CEA濃度越高。,20,97%的健康成人血清CEA濃度在25g/L以下。原發(fā)性小腸癌CEA分布原發(fā)性小腸癌CEA分布原發(fā)性結腸癌患者CEA增高占4580%。除原發(fā)性結腸癌以外，胰腺癌、膽管癌、胃癌、食管癌、腺癌、肺癌、乳腺癌和泌尿系統(tǒng)的腫瘤陽性率也很高，一般在5070%。良性腫瘤、炎癥和退行性疾病，如結腸息肉、潰瘍性結腸炎、胰腺炎和酒精性肝硬化變病人CEA也有部分升高，但遠遠低于惡性腫瘤，一般小于20g/L，CEA超過20g/L時往往提示有消化道腫瘤。所以測定CEA可以作為良性與惡性腫瘤的鑒別診斷依據。為消化道腫瘤的輔助診斷指標。參考值5.9g/L,21,（八）結合珠蛋白（ Hp）又名觸珠蛋白，是一種糖蛋白，主要由肝合成，電泳時位于2區(qū)帶，是一種急性時相反應蛋白，為兩對肽鏈組成的四聚體（22）。鏈有1和2兩種，其中1有兩種遺傳變異體。 Hp的主要功能與血漿中游離血紅蛋白結合，（不可逆結合），并送至肝細胞內降解，因此Hp在溶血后含量急劇下降。,22,血漿Hp測定方法 測定Hp-Hb復合物中過氧化物酶活性。在血漿中加入過量Hb，生成Hp-Hb復合物，凝膠層折法收復合物分離，測定結合的Hb。電泳法。免疫化學法。 【參考范圍】0.52.2g/L 【臨床意義】急性時相反應中血漿Hp上升，燒傷、腎病綜合征引起Alb丟失時Hp上升，血管內溶血Hp下降。,23,（九）2-巨球蛋白（2MG或AMG）是血漿中分子量最大的蛋白質，分子量為62.580萬，含糖量8。 AMG由肝細胞與單核吞噬細胞系統(tǒng)合成，半壽期5天。 AMG最突出的特性能與多種分子和離子結合，特別是它能與多種蛋白水解酶結合而影響這些酶的活性，是血漿中主要的蛋白酶抑制劑。能選擇地保護某些蛋白酶活性的作用。 AMG測定方法 免疫化學法， 【參考范圍】1.254.10g/L 【臨床意義】在低蛋白血癥，AMG上升，妊娠、服用避孕藥時AMG上升。,24,（十）銅藍蛋白（CER）含銅的糖蛋白，分子量約1216萬，含糖量約10，因含銅而呈藍色，故名銅藍蛋白。主要由肝臟合成。 CER具有氧化酶活性，使血液中Fe2+氧化成Fe3+，故又稱亞鐵氧化酶。CER還起著抗氧化劑的作用。防止組織中脂質過氧化物和自由基的生成。 CER測定方法 免疫化學法或酶活性測定。 【參考范圍】0.20.5g/L。 【臨床意義】CER屬于急性時相反應蛋白。在感染、創(chuàng)傷和腫瘤時上升，Wilson?。ǜ味範詈俗冃裕〤ER下降。,25,（十一）轉鐵蛋白（TRF） 血漿中主要含鐵蛋白質，分子量7.7萬，含糖約6，由肝及網狀皮系統(tǒng)合成，半壽期7天。 主要運載由消化道吸收的鐵和RBC降解釋放的鐵，此外還可逆地結合多價金屬離子，如Ca、Zn、Cu等。 TRF測定方法 放免法、散射比濁法。 【參考范圍】2.54.3g/L。 【臨床意義】TRF在急性時反應中下降，如炎癥、惡性病變時、TRF、Alb、PA同時下降，慢性肝病及營養(yǎng)不良亦下降，妊娠、口服避孕藥，注射雌激素TRF上升。,26,（十二）2-微球蛋白（BMG） 由淋巴細胞合成，分子量11800，pI5.7，存在于所有有核細胞的表面，特別是淋巴細胞和腫瘤細胞并由此釋放入血，半壽期107min。 BMG測定方法 常用放免法，ELISA法。 【參考范圍】1.02.5mg/L。 【臨床意義】主要用于監(jiān)測腎小管功能，特別是腎移植后，如有排異反應，BMG在尿中排出量上升，腎功能衰竭，炎癥、腫瘤血漿BMG上升。,27,（十三）C-反應蛋白（CRP） 是一種能結合肺炎雙球菌細胞壁C-多糖的蛋白質，分子量11.514萬，五條肽鏈組成，肝細胞合成。CRP能激活補體，促進粒細胞、巨噬細胞的運動和吞噬，具有調理素樣作用。 CRP測定方法 免疫擴散法，火箭免疫電泳法，ELISA法，放免法， 【參考范圍】8.0mg/L。 【臨床意義】作為急性時相反應的一個極靈敏指標 ，急性心肌梗死，創(chuàng)傷、感染、炎癥、外科手術、腫瘤浸潤迅速上升。,28,上述蛋白質除PA、Alb、BMG外都屬于糖蛋白，含糖量最高的是AAG、45，除BMG外都主要由肝細胞合成。,29,三、疾病時的血漿蛋白質變化 （一）炎癥、創(chuàng)傷 在炎癥、創(chuàng)傷、感染、心肌梗塞、腫瘤等情況下其血漿濃度會發(fā)生明顯改變的蛋白質稱為急性時相反應蛋白（acute phase reactants protein APRP）。主要包括AAG、AAT、Hp、CER、C3、C4、纖維蛋白原、CRP；PA、Alb、TRF。,30,（二）肝臟疾病 血漿蛋白質大多數(shù)由肝臟合成，因此肝臟疾病可導致多種血漿蛋白質發(fā)生變化。 如乙肝活動期AAT，Hp、PA、Alb，特別是血漿PA的含量是肝功能損傷的敏感指標。 肝硬化時AAT、IgA、AMG，CER、CRP，而AAG、Hp、C3，PA、Alb、TRF。,31,（三）腎臟疾病 腎臟疾病可出現(xiàn)蛋白尿而導致血漿蛋白質丟失，丟失的蛋白質與其分子量有關。小分子量蛋白質丟失最明顯，而大分子量的蛋白質因肝細胞代償性地合成增加，絕對含量升高。所以血漿Alb、PA、AAG、AAT、TRF，而AMG、-LP（血清脂蛋白 ）、Hp，這稱為選擇性蛋白質丟失。 當嚴重腎病是腎小球失去分子篩作用，可導致非選擇性蛋白質丟失，表現(xiàn)為廣泛地低血漿蛋白質血癥。,32,生化檢驗中測定蛋白質的方法很多，主要利用蛋白質的分子組成，結構或性質進行。一、蛋白質分析技術 （一）測定蛋白質特征元素氮 如凱氏定氮法，是測定蛋白質的經典方法，1883年Kjeldahl首創(chuàng)，精密度準確度高，但操作復雜、費時、技術性強，不適合臨床常規(guī)檢測，一般用于標準血清的標定和校正。,第二節(jié) 體液蛋白質檢驗,33,（二）利用重復的肽鏈結構 如雙縮脲法，1914年首創(chuàng)，操作簡便，重復性好，各種蛋白產生的顏色反應相近，但靈敏度較低，是目前臨床上測定總蛋白的常規(guī)方法。,34,（三）利用酪氨酸、色氨酸殘基與試劑的反應或紫外吸收特性 1. 酚試劑法 1921年，F(xiàn)olin首創(chuàng)，1951年改良成廣泛使用的Lowry法，靈敏度高（較雙縮脲法高100倍），主要用于微量蛋白質檢測，但各種蛋白質中酪氨酸含量不一，故準確性較差，試劑配制復雜且不穩(wěn)定，化學干擾大，目前臨床上僅用于粘蛋白測定。 2. 紫外吸收法 在280nm處有一吸收峰，快速、簡單，不需加任何試劑，保留蛋白質活性，化學干擾大。,35,（四）利用與染料的結合能力 1. 考馬斯亮藍G-250結合蛋白法（CBB法）1976年Bradford應用于蛋白質測定，操作簡便、快速、重復性好，靈敏度高，干擾因素少，但特異性不高，大分子肽（分子量300以上），也參與反應，線性范圍窄，臨床上主要用于尿、腦脊液蛋白質測定。 2. 溴甲酚綠結合清蛋白法（BCG法） 靈敏度高，血清用量少，操作簡便，但特異性不高，部分球蛋白也能與之結合（1-球蛋白、運鐵蛋白、觸珠蛋白等），是目前臨床上測定清蛋白的常規(guī)方法。,36,（五）利用沉淀后借濁度或光折射測定 如比濁法、折光測定法，方法簡便，試劑易得，但濁度的強弱受反應的條件影響大（加試劑的方法、溫度等），結果準確性差，一般用于尿、腦脊液蛋白測定。 （六）電泳法 CAE、PAGE目前臨床上常用電泳技術，但只能測定各種蛋白質的百分含量。 （七）利用免疫學特性 免疫化學法，特異性、靈敏度高，只能用于某種特異蛋白的測定。,37,（一）血清總蛋白的測定（雙縮脲法） 【原理】蛋白質分子中的肽鏈在堿性條件下能與二價銅離子作用生成紫紅色的絡合物，產生的顏色強度在一定范圍內與蛋白質的含量成正比，但雙縮脲反應并非蛋白質特有的顏色反應，分子中含二個以上肽鍵者均有此反應。,38,【試劑】雙縮脲試劑 未失結晶水的硫酸銅（CuSO45H2O）3.0g溶于500ml新鮮制備的蒸餾水或剛煮沸冷卻的去離子水中，加酒石酸鉀鈉（NaKC4O4H64H2O）9.0g，碘化鉀5.0g，待完全溶解后加入6mol/L NaOH溶液100ml，最后加蒸餾水至1L，置聚乙烯瓶內蓋緊保存。 酒石酸鉀鈉的作用是絡合銅離子，維持銅離子在堿性溶液中的溶解度，碘化鉀防止兩價銅離子還原。 【參考范圍】6080g/L,39,【臨床意義】 （一）血清總蛋白增高 1. 血液濃縮 嚴重腹瀉 、嘔吐、高燒 2. 合成增加 主要見于球蛋白合成增加，多發(fā)性骨髓瘤。 （二）血清總蛋白降低 1.血液稀釋 靜脈滴注過多低滲溶液，各種原因所引起的水鈉潴留。 2. 攝入不足和消耗增加 營養(yǎng)不良，慢性胃腸道疾病引起的消化吸收不良，消耗性疾病，結核病、甲亢、惡性腫瘤。 3. 合成障礙 主要見于肝臟疾患。 4. 蛋白質丟失 嚴重燒傷，大量血漿滲出，腎病綜合癥。,40,（二)血清清蛋白測定（溴甲酚綠法） 【原理】溴甲酚綠（BCG）在pH4.2的環(huán)境中，在有非離子去垢劑（Brij-35）存在時，可與清蛋白結合形成藍綠色復合物，顏色的深淺在一不定范圍內與清蛋白含量成正比。 BCG與清蛋白結合的特異性較低，它不僅與Alb結合呈色，還可與其他蛋白質呈色，其中1-球蛋白，TRF、Hp最明顯，但反應速度不同，Alb可立即反應（快反應），其他蛋白質反應慢（慢反應）。,41,【試劑】 1. 10mmol/L BCG貯存液 BCG1.75g，溶于5ml 1 mol/L NaoH溶液中，加蒸餾水至250ml。 2. 0.5mol/L琥珀酸緩沖貯存液（pH 4.0）NaoH10g，琥珀酸56g，溶解于800ml蒸餾水中，用1mol/L NaoH溶液調pH至4.100.05加蒸餾水至1L。 3. 疊氮鈉貯存液 疊氮鈉40g溶于1000ml蒸餾水中。 4. Brij-35溶液 Brij-35 29g，加蒸餾水80ml，置80ml左右水溶使其溶解，然后加水至100ml。,42,5. BC