白血病細(xì)胞的免疫分型

白血病細(xì)胞的免疫分型白血病細(xì)胞的免疫分型 正常血細(xì)胞從多能干細(xì)胞分化、發(fā)育、成熟為功能細(xì)胞的過程中，細(xì)胞膜、細(xì)胞漿或胞核抗原的出現(xiàn) 、表達(dá)增多與減少甚至消失與血細(xì)胞的分化發(fā)育階段密切相關(guān)，而且表現(xiàn)出與細(xì)胞系列及其分化程度相 關(guān)的特異性。因此，這些抗原的表達(dá)與否可作為鑒別和分類血細(xì)胞的基礎(chǔ)。白血病是造血系統(tǒng)的惡性腫 瘤，在形態(tài)上變化雖相當(dāng)大，但仍能表達(dá)正常血細(xì)胞所具有的抗原，因而仍可依據(jù)其抗原的表達(dá)譜對白 血病進(jìn)行免疫分型。由于白血病細(xì)胞具有腫瘤細(xì)胞的特征，其抗原表達(dá)又不完全同于正常血細(xì)胞，?？?出現(xiàn)某些抗原缺乏、過度表達(dá)、系列交叉表達(dá)某一系列或階段不應(yīng)有的抗原，這又增加了白血病免疫分 型的復(fù)雜性。 近年來白血病的免疫分型已成為診斷血液惡性腫瘤不可缺少的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。國際上公認(rèn)的通用的方 法是流式細(xì)胞術(shù)（FCM），此外還有免疫組化法，電鏡和熒光顯微鏡也可以幫助診斷。其中流式細(xì)胞術(shù)（ FCM）和免疫組化法較為常用。 流式細(xì)胞術(shù)中，白血病免疫分型是利用熒光素標(biāo)記的單克隆抗體（McAb）作分子探針，多參數(shù)分析白 血病細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿或細(xì)胞核的免疫表型，由此了解被測白血病細(xì)胞所屬細(xì)胞系列及其分化程度 。因為 FCM 能快速，多參數(shù)，客觀的定性又定量測定細(xì)胞膜，漿，核的抗原表達(dá)。另一個重要理由是至 今尚未發(fā)現(xiàn)白血病的特異抗原。所以能用正常血細(xì)胞的單抗來進(jìn)行免疫分型是基于白血病形成的分化阻 斷學(xué)說即白血病細(xì)胞基因異常，分化受阻于某階段形成不同亞型的白血病。這群細(xì)胞充盈于骨髓?？乖?表達(dá)與其相應(yīng)系列/階段的血細(xì)胞無明顯差異。與形態(tài)學(xué)檢查相似僅能根據(jù)數(shù)量的差異來判斷病變細(xì)胞的 屬性。單參數(shù)免疫標(biāo)志測定易將正常細(xì)胞包括在內(nèi)。因此，近年來主張用設(shè)門（gating）方法。即用 CD4 5 與側(cè)向角（side scatter,SSC），對數(shù)取樣后可將骨髓細(xì)胞清晰地分出淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞，成熟粒細(xì) 胞，幼稚細(xì)胞和紅細(xì)胞群，其理論依據(jù)是 CD45 是所有白細(xì)胞的抗原。其表達(dá)量在淋巴細(xì)胞最高，單核細(xì) 胞，成熟粒細(xì)胞，早期造血細(xì)胞（blasts）依次減弱。紅細(xì)胞（中，晚幼紅細(xì)胞，成熟紅細(xì)胞）不表達(dá) C D45。SSC 反映細(xì)胞的顆粒性，成熟粒細(xì)胞 SSC 最高，依次為單核細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，blasts，紅細(xì)胞。以 CD45/SSC 雙參數(shù)，對數(shù)取樣時即可把各細(xì)胞群區(qū)分出來。若同時加上一個，二個甚或三個熒光標(biāo)記的單 抗，則很容易識別非正常細(xì)胞群所表達(dá)的抗原。這樣可以排除正常細(xì)胞的干擾。在幼稚細(xì)胞低的情況 下或檢測殘存白血病時尤為必要 。FCM 分析白血病免疫表型時，測量細(xì)胞數(shù)量一般在 1000050000 細(xì)胞 之間，而且快速、特異、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，能區(qū)分細(xì)胞起源、劃分其分化發(fā)育階段等，對白血病的診斷 與分型、治療方案選擇與預(yù)后判斷、發(fā)病機(jī)理研究等有重要價值。 細(xì)胞免疫化學(xué)是細(xì)胞化學(xué)吸收了免疫學(xué)的理論和技術(shù)而發(fā)展起來的一門重要方法學(xué).在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)領(lǐng)域 中被廣泛應(yīng)用.尤其在細(xì)胞學(xué)中該技術(shù)的應(yīng)用是微觀世界形態(tài)學(xué)研究從單一的形態(tài)學(xué)描述上升到結(jié)構(gòu)、功 能和代謝為一體的動態(tài)觀察。并可對細(xì)胞的屬性、分化階段和變異進(jìn)行鑒別，有助于臨床疾病的診斷。 細(xì)胞免疫標(biāo)記技術(shù)的方法學(xué)建立至今僅為短短 30 年左右的時間，但其發(fā)展異常迅速，檢測方法可多達(dá) 20 多種以上。其基本原理是將組織和細(xì)胞作為抗原，與其相應(yīng)的特異抗體產(chǎn)生抗原抗體反應(yīng)，并借助熒 光色素、酶、膠體金、鐵蛋白等顯示系統(tǒng)，在被測組織和細(xì)胞所相應(yīng)的位置顯示出來。由于抗原抗體 系統(tǒng)具有高度的特異性和敏感性，能夠?qū)⒓?xì)胞形態(tài)學(xué)和功能代謝緊密的結(jié)合起來，進(jìn)行觀察和分析。免 疫酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶的高效，快速催化作用彼此結(jié)合，由此形成一種既 具有免疫熒光、放射免疫的優(yōu)點(diǎn)，又避免了他們的缺點(diǎn)。這項技術(shù)的原理和操作與熒光法有許多相似之 處，所不同的是用酶來替代熒光素作為標(biāo)志物，并采用底物被酶分解后的顯色反應(yīng)來顯示抗原抗體的結(jié) 合與否。 作為血液學(xué)中的細(xì)胞免疫組化染色，應(yīng)該首選堿性磷酸酶(AP)顯色系統(tǒng)。 因為在血液和骨髓細(xì)胞中 有一部分細(xì)胞含有非常豐富的內(nèi)源性過氧化物酶，雖然在操作時可采取一些措施來抑制細(xì)胞內(nèi)過氧化物 酶，但這種處理比較粗糙，往往不能完全抑制該細(xì)胞內(nèi)源酶的活性,又可造成部分細(xì)胞表面抗原的破壞或 丟失。而對血液系統(tǒng)中許多惡性疾病的診斷，通常是檢測其細(xì)胞表面的分化抗原。再則在血液和骨髓組 織中，還存在大量的成熟紅細(xì)胞。其中的血紅蛋白對本法也會產(chǎn)生強(qiáng)烈的干擾，(因血紅蛋白具過氧化物 酶的功能)，可對被檢標(biāo)本的背景產(chǎn)生難以去除的非特異性染色。從而導(dǎo)致結(jié)果難以判斷。 這里就以流式細(xì)胞術(shù)為主要研究方法對白血病細(xì)胞的免疫分型進(jìn)行闡述。 骨髓血細(xì)胞是形態(tài)學(xué)分型的基礎(chǔ)，F(xiàn)CM 白血病免疫分型是對形態(tài)學(xué)分型的重要補(bǔ)充和進(jìn)一步深化，國 際白血病 MIC 分型協(xié)作組認(rèn)為免疫分型對每一例急性白血病都是必不可少的，對下列情況意義更大：1、 用形態(tài)學(xué)、細(xì)胞化學(xué)染色不能肯定細(xì)胞來源的白血病。2、形態(tài)學(xué)為急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）或急性 未分化白血?。ˋUL）但缺乏特異性淋巴細(xì)胞系列抗原標(biāo)記。3、混合性白血病。4、部分髓系白血病。目 前，免疫分型對粒細(xì)胞和單核細(xì)胞白血病的鑒別尚有一定困難。5、慢性淋巴細(xì)胞白血病。6、微小殘留 白血病。 免疫分型常用的免疫標(biāo)志及其意義 白血病系列分化抗原 T 淋巴細(xì)胞白血?。篊D3、CD5、CD7。 B 淋巴細(xì)胞白血?。篊D10、CD19、CD22。 NK 淋巴細(xì)胞白血病：CD16、CD56、CD57。 髓系白血?。篊D13、CD14、CD33、MPO（髓過氧化物酶）。 紅白血?。篏lyA（血型糖蛋白 A）。 巨核細(xì)胞白血?。篊D41、CD42、CD61。 白血病系列非特異性抗原 CD34、HLADR 為早期細(xì)胞抗原，無系列特異性，可與 CD38 聯(lián)合運(yùn)用于免疫分型。一般而言，干/祖 細(xì)胞 CD34、HLADR、CD38，原始細(xì)胞 CD34、HLADR、CD38，而幼稚細(xì)胞（如早幼粒細(xì)胞 ）CD34、HLADR、CD38。 白血病分化階段抗原 T 細(xì)胞抗原 CD4、CD8。 B 細(xì)胞抗原：CD10、Cy（胞漿 鏈）、SmIg（表面膜免疫球蛋白）、CD38 和 CyIg（胞漿免疫球蛋 白）、CD11C。 白細(xì)胞共同抗原 CD45 為白細(xì)胞共同抗原，但原幼細(xì)胞表達(dá)量比成熟淋巴細(xì)胞低，幼紅細(xì)胞不表達(dá)。用 SSC/CD45 PerC P 雙參數(shù)分析可十分容易鑒別骨髓和血液中的原始或成熟細(xì)胞。用兩個系列或階段特異性 McAb 加 CD45 進(jìn) 行三色免疫熒光染色，經(jīng) FSC、SSC、McAbl-FITC、McAb2-PE、CD45 PerCP 五參數(shù)分析，可特異地分析原 幼白血病細(xì)胞的免疫表型而不受成熟細(xì)胞的干擾。 白血病的免疫分型 一、AML MO、 Mo blasts 有低的 SSC 和 FSC。在 CD45SSC 圖上出現(xiàn)在淋巴細(xì)胞位置上，至少表達(dá)一個 特異性標(biāo)志如 CD13 或 CD116，但 MPO 比 CD13 與 CD33 更靈敏。一般淋系標(biāo)志陰性，但也可表達(dá) CD7 或 CD4。Mo blasts 一般 HLADR、CD34 陽性，有些研究表明 CD7 與 CD34 共表達(dá)在 AML 且預(yù)后差。 M1、 流式上 M1 與 M0 相似不易區(qū)分，M1 一般 CD13、CD33、HLADR，但 CD34 表達(dá)少于 M 0，可能表達(dá)部分 CD15。 M2、 M0 與 M1 的主要區(qū)別是成熟度增加，blasts 減少，CD15 較 M1 較顯著，CD34 弱于 M1，CD13 有時表達(dá)強(qiáng)于 CD33，多數(shù)病例 HLADR（-）。CD45SSC 圖顯示從髓系 blast 區(qū)至成熟骨髓細(xì)胞區(qū) 的連續(xù)細(xì)胞帶，CD45SSC 圖有助于確定 blasts 比例。 M3、高顆粒性，具較高的 SSC，但 CD45 較成熟 C 少，多數(shù)情況 HLADR（-）或表達(dá)減少，CD34 少于 M2、一般 CD13 弱（），可有 CD2 表達(dá)。 M4 與 M5、 兩型表型相似，但 M4 較 M5 表達(dá)更多的 CD34（），較之 M0、M1，M4 與 M5 有更大 的 FSS 和 SSC，CD45SSC 圖上，成熟 C 出現(xiàn)在單核區(qū)，重要的表型為 CD13、CD33、HLADR、CD14 和 CD15，CD33 可表達(dá)強(qiáng)于 CD13，CD33（）、CD13（）、CD34（）很可能為 M5，但只出現(xiàn)在少 數(shù)病人中，部分 M5 可見 CD56（）。 M6、 M6 較少見且特征不明顯，一般 HLADR，CD34、CD13、CD33 陽性，CD45SSC 圖顯示主要 為紅系成份。 綜述：白血病細(xì)胞的免疫分型 03 級交大教改班 史蔚 5031819004 - 3 - M7、 巨核細(xì)胞白血病，在 AML 中少于 1。一般 CD61（Gpa）和/或 CD41（Gpb-a）陽性 ，而注意由于血小板粘附在 blasts 上造成的假陽性，可以用流式雙色分析在 EDTA 存在下，測 Gpb /a 與 CD34 以減少激活血小板的粘附。 二、ALL： ALL 是兒童中最常見的惡性腫瘤，約占全部腫瘤的 25，在成人，ALL 約占急性白血病 的 25，我們將 ALL 分為 B 祖細(xì)胞型，CD10或 CD10，前 B 細(xì)胞型，B 細(xì)胞型，T 細(xì)胞型。 B 祖細(xì)胞型 ALL：在幼兒約占 ALL 的 6570，青少年為 5560，成人為 50。在兒童 ，約 90病例 CD10，在幼兒只有少于 50病例 CD10，blasts 一般 FSC、SSC 很少，是 FAB 標(biāo)準(zhǔn) 的 L1 或 L2，一般 TdT(+)HLA-DR(+)，CD19(+)，此型又分為 2 個亞型，CD10和 CD10，前者預(yù)后 好，多數(shù)病例 CD24，CD34，CD20 表達(dá)隨成熟度增加而增加，B 祖細(xì)胞被定義為 sIg-。 前 B 細(xì)胞型 ALL：此亞型約占兒童 ALL 的 25，細(xì)胞一般為 CD19，CD24，HLADR，胞漿 CD 22，CD10，TdT 隨 CD20 變化，CD34 多為陰性，前 B 亞型被認(rèn)為比 B 祖型預(yù)后更差，這與 t(1；1 9)出現(xiàn)相關(guān)并由此產(chǎn)生 E2APBX1 融合蛋白，它的表型為 CD19、CD10、CD9，不同程度 CD20 表達(dá)，CD34，確認(rèn)此表型有助于診斷基因上不確定的病例。 B 細(xì)胞型 ALL：成熟 B 細(xì)胞型 ALL 約占 ALL25，B 細(xì)胞型 ALL 較之 B 祖細(xì)胞型 ALL 有更大的 FSC 和 SSC，在 CD45SSC 圖上出現(xiàn)在淋巴和單核細(xì)胞區(qū)域，即 FAB 標(biāo)準(zhǔn)的 L3，表型為 CD19、CD20、 CD22、CD24 且 sIg（多數(shù)為 IGM）多數(shù)病例 CD10。但成熟抗原及 sIg 使之區(qū)別于更早的 B 系 ALL， 極少數(shù)成熟 B 細(xì)胞 ALL 無 FABL3 形態(tài)。 TALL：多數(shù)病例有大的 FSC、SSC，在 CD45SSC 圖上可能出現(xiàn)在淋系未成熟細(xì)胞和髓系未成 熟細(xì)胞或單核細(xì)胞區(qū)，多數(shù)表現(xiàn)為胸腺亞型，最常見亞型為皮質(zhì)晚期表達(dá)，CD1、CD2、CD5、CD7、CD 4/ CD8 雙陽與極少膜表面 CD3、TdT 多為陽性。另一常見亞型為皮質(zhì)早期表達(dá) CD2、CD5、CD7、TdT 強(qiáng)表達(dá)。髓質(zhì)期亞型表達(dá) CD2、CD5、CD7、與 CD3CD4/CD3+CD8+,很少見 TdT 表達(dá)。前 T 細(xì)胞亞型 ，表達(dá) CD7 胞漿 CD3且無其它 T 細(xì)胞抗原，T 細(xì)胞腫瘤的特征是喪失 T 細(xì)胞抗原而表現(xiàn)出其它異常 抗原組合。 雜合型白血?。弘S著流式技術(shù)的廣泛應(yīng)用，我們發(fā)現(xiàn)許多病例并不能嚴(yán)格劃分為淋系或髓系，真 正的雙表型病人多為 t(9；22)或（11q23），現(xiàn)在雜合型的誤診率很高。最常導(dǎo)致誤診的原因是在分 析中未能排除非白細(xì)胞，過度強(qiáng)調(diào)弱的非特異性結(jié)合，忽略了某些抗體缺乏系特異性，最重要的系特 異性抗原在 B 系、T 系、髓系分別為 CD22、CD3 和 MPO。 三、CML： 由于慢性期顯著的細(xì)胞分化，在 CD45SSC 圖上除了髓系細(xì)胞占主導(dǎo)外，只顯示一個正 常 骨髓像，CML 可確診，如有 Ph1 即 t(9；22)(q34;q11)，它可形成新的雜合 BCRABL 癌基因，其產(chǎn)生 的一段 8.5kb 異常，RNA 可編碼一個 210KD（P210）的融合蛋白，使正常的造血細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)?CML 細(xì) 胞，該產(chǎn)物可用 CR 擴(kuò)增后用標(biāo)記探針在流式細(xì)胞儀上檢測，這種分子流式技術(shù)正在研究中并將使流 式技術(shù)擴(kuò)展到分子領(lǐng)域。 CML 起病與發(fā)展相對緩慢，慢性期的持續(xù) 1 年左右最終發(fā)展為加速期和急變期。流式細(xì)胞技術(shù)對 急變期亞型的診斷具有極高價值。直接影響到治療效果。 急變期 CML 主要表現(xiàn)為髓系，偶為淋系，髓性急變可表現(xiàn)出多種形態(tài)包括未分化細(xì)胞。淋性急變 具典型形態(tài)特征，為 CD10B 祖細(xì)胞 ALL 極少有 T 細(xì)胞型 ALL。 四、CLL： CLL 細(xì)胞主要為較正常淋巴細(xì)胞稍大的小淋巴細(xì)胞。免疫分型主要為：SIgM、SIgD 弱表 達(dá)， B 系抗原為 CD19、CD20、CD43、CD79a 與 CD5 共表達(dá)，CD23 表達(dá)使得 CLL 區(qū)別于帽細(xì)胞淋巴癌 MU， 即（CLL：CD23，MCL：CD23），CD10、CD23、CD11c 和 CD25、CD20 常弱表達(dá)，盡管 CLL 起 病慢，但 CLL 病人的生存率變化很大，有染色體異常的病預(yù)后不良，最常見的三聯(lián)體 trisony12、14 q、13q、11q，免疫表型上沒有特異的變化而免疫表型的變化并不是提示染色體異常。最近，有研究 表明，三聯(lián)體 trisony12 與 SIg、CD20 表達(dá)量高度相關(guān)，與 CD23相關(guān) 與 FMC7 相關(guān)。 B 型前淋巴細(xì)胞白血?。˙DLL）較 CLL 更為嚴(yán)重，流式細(xì)胞技術(shù)在區(qū)分 BDLL 和 CLL 上發(fā)揮 很大作用，BDLL 多為 CD5，CD22，表達(dá)更強(qiáng)的 sig。 MU 病人平均生存率不超過 5 年，與 CLL 在形態(tài)上很難區(qū)分，與 CLL 相似有 CD5B 祖細(xì)胞，但 Si g 表達(dá)強(qiáng)于 CLL，且 CD22。 另一與 CLL 難于區(qū)分的是 FCC，細(xì)胞為強(qiáng) Sig、CD5、CD10、CD23，具 B 系表型：對于診斷 為 CLL，CD5、FMC7、CD22 與 SIg，CD20 異常強(qiáng)表表達(dá)的病例我們要考慮是否為 DLL、MCC 或 CLL 的亞 型（trisomy12）因為它們危險性更大。 參考文獻(xiàn)： 1. 急性早幼粒細(xì)胞白血病免疫表型分析. 中華血液學(xué)雜志,1998,19 (1)31 2. 唐亞輝，馬葵，李次芬等。 AL 的形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)分型。中華血液學(xué) 雜志， 2002 ； 23 (5)； 264-266 3. 王晉芬，郗彥鳳，王