畢業(yè)論文范文——基于TCF的小分子含硫化合物探針的合成與應用

摘要 含硫化合物包括小分子硫醇，硫化氫和亞硫酸鹽等，參與體內(nèi)許多重要的生化反應進程，在生物生理活動過程中扮演著極其重要的作用。生物體內(nèi)這些含硫硫化合物含量的改變和許多疾病相關，因此選擇性檢測這些含硫化合物特別是硫醇具有重要的意義。根據(jù)三種含硫化合物反應活性的差異，本文設計、合成了四個基于邁克爾加成反應機理的硫醇、硫化氫和亞硫酸鹽探針，并在乙腈/水溶液體系測試了它們對硫醇及含硫化物的光譜響應，結(jié)果表明探針TCF-Br的反應活性最高，能快速、高靈敏地檢測硫醇，其對生物硫醇的檢測限為0.17mM。TCF-N對亞硫酸鹽具有較高的選擇性，而TCF-S對硫化氫和亞硫酸鹽均具有較快的光譜響應。結(jié)合三個探針可以實現(xiàn)對三種含硫化合物的選擇性、高靈敏度檢測。關鍵詞：生物硫醇，亞硫酸鹽，硫化氫，分子探針，邁克爾加成反應IAbstractSulfur-containing compounds including small molecula thiols, hydrogen sulfide and sulfite, play vital roles in biological and physiological processes processes. The variations of the concentrations of these compounds biosamples are ralated to some diseases, therefore, selective detection of these compounds is of great interests. According to the different reaction activities of these sulfur-containing compounds, we designed and synthesized four probes based on the Michael addition reaction mechanism. The spectral responses toward different sulfur-containing compounds were performed in acetonitrile/water (1:1) solution. TCF-Br showed the highest activity toward all three sulfur-containing compounds. The detection of thiols was completed within 1 min. The detection limits of thiols were as low as sulfite from sulfide. Sulfite, silfide and thiols can be discriminated by these three probes.Keywords: sulfite; fluorescence probe; surfactant; Michael addition reaction 目錄1 文獻綜述11.1 分子探針概述11.2硫醇識別和檢測的意義31.3傳統(tǒng)硫醇檢測方法41.4熒光探針檢測硫醇的方法41.5 本文設計思路15 2 探針分子的合成182.1 實驗儀器及試劑182.2 合成方法183. 探針對三種含硫化合物的光譜響應233.1溶液的配制233.2 TCF-Br，TCF-N和TCF-S的吸收光譜233.3探針TCF-Br對含硫化合物的光譜響應243.4探針TCF-N對三種含硫化合物的光譜響應263.5探針TCF-S的測試283.6 反應機理探索283.7 利用三種探針對含硫化合物的指紋識別29 4.結(jié)論30 5.參考文獻31 III36 基于TCF的小分子含硫化合物探針的合成與應用 1 文獻綜述 1.1 分子探針概述 1.1.1 分子探針定義簡介分子識別是廣泛存在的自然現(xiàn)象，特別是在生命過程中，分子識別起著極其重要的作用。但分子識別作為分子之間發(fā)生的事件，仍需要借助一定的技術(shù)手段才能感知伴隨分子事件發(fā)生所產(chǎn)生的物理或化學信號。探針，特別是熒光探針或影像技術(shù)就是實現(xiàn)這一目標的橋梁1。探針是針對某種特定的目標物（生物分子或離子）進行（分子）識別的的探測器，它能夠特異性的識別目標物，并可直接進行檢測或帶有可檢測標記物的高效探測試劑?；瘜W及生物學意義上的探針被稱為化學探針或分子探針，是指與特定的靶分子發(fā)生特異性相互作用并可被特殊的檢測技術(shù)探知的分子。與一般的檢測方法相比，探針技術(shù)具有許多特點，包括靈敏度高、專一性強，快速準確，特別是適合于實時檢測和分子影像。這些特點使得探針成為現(xiàn)代生物學、醫(yī)學和藥學等領域中不可缺少的重要技術(shù)。2熒光探針的核心是將分子間的相互作用轉(zhuǎn)變成易檢測的（顏色、吸收光譜、熒光）信號傳遞給外界。一般情況下，探針至少由兩部分構(gòu)成：一是具有反應或識別功能的部分；二是具有信號輸出功能的部分。具有識別功能的部分可以是某種核酸或蛋白質(zhì)等生物大分子，也可以是某種配體、底物、藥物等有機分子，在探針中它們負責識別待測靶標分子。具有信號輸出功能的部分稱作熒光團或發(fā)色團，按熒光團可將熒光探針分為：香豆素類、熒光素類、羅丹明類、菁染料類、氟硼吡咯類和萘酰亞胺類。當探針的配體部分與某種金屬離子結(jié)合時，會引起熒光團的熒光參數(shù)發(fā)生改變，從而得到靶標分子的信息。3、4 1.1.2 熒光發(fā)射原理熒光物質(zhì)在吸收入射光的過程中，吸收了光子的能量并釋放出電子，釋放出的電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，而處于激發(fā)態(tài)的分子并不穩(wěn)定，因而電子會通過輻射躍遷和非輻射躍遷兩種方式衰變返回到基態(tài)。輻射躍遷的衰變過程伴隨著光子的發(fā)射，即產(chǎn)生了熒光和磷光。由于非輻射能量的損失，發(fā)射光子的能量一般小于吸收光子的能量，故而熒光物質(zhì)的發(fā)射光譜波長通常要大于吸收光譜波長。根據(jù)不同的性質(zhì)，電子躍遷可分為兩大類，其一是有著光子釋放的輻射躍遷，包括熒光和磷光兩個過程，其二為沒有光子釋放的非輻射躍遷，能量以其它形式耗散，如系間竄躍、熱轉(zhuǎn)換、內(nèi)轉(zhuǎn)換等。熒光過程是指當分子從激發(fā)態(tài)通過發(fā)光釋放能量直接回到基態(tài)的過程；磷光過程是指從分子從激發(fā)態(tài)經(jīng)過三線態(tài)發(fā)光回到基態(tài)的過程。還有一種特殊的熒光稱為延遲熒光，與正常的熒光有著相同的光譜結(jié)構(gòu)，但經(jīng)歷的過程不太一樣。延遲熒光是指某些第一激發(fā)單重態(tài)跟第一激發(fā)三重態(tài)能級接近的分子先躍遷到三重態(tài)后，然后又被熱激發(fā)到單重激發(fā)態(tài)而發(fā)射的熒光5。1.1.3比率型熒光探針設計的基本原理 比率熒光測定技術(shù)是熒光分析中的一項重要技術(shù)，是指采用熒光探針在獨立狀態(tài)下發(fā)射波長處的熒光強度和與待測物反應后在另一波長處發(fā)射的熒光強度的比值作為檢測信號來檢測物質(zhì)的一種方法6。由于比率熒光探針以同樣環(huán)境下測定的兩個波長處熒光強度的比值作為信號參量，若有影響則兩處的熒光強度都會發(fā)生同樣的變化，誤差相互抵消，比值基本不受外界影響，結(jié)果得到修正，所以可有效消除探針、樣品及設備等因素引起的數(shù)據(jù)失真，從而得到更準確的結(jié)果，同時也提高了探針測量的選擇性、靈敏度、動態(tài)相應范圍等7-9。引起熒光信號變化所涉及的機理主要有熒光共振能量轉(zhuǎn)移、光誘導電子轉(zhuǎn)移、分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移、激基締合物的形成或消失、激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移等10。 1.1.4熒光共振能量轉(zhuǎn)移基本原理熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）是指當其中一個熒光團（能量供體）處于激發(fā)狀態(tài)時，會將其能量轉(zhuǎn)移給相鄰的分子（能量受體），從而引起能量受體的激發(fā)，實現(xiàn)能量由供體向鄰近的受體轉(zhuǎn)移的過程。兩個熒光團要實現(xiàn)能量轉(zhuǎn)移，需要滿足四個條件：其一，能量供體發(fā)射光譜和受體的吸收光譜要有一定的重合；其二，兩個熒光團的距離一般小于100 ；其三，能量供體的量子產(chǎn)率與能量受體的光吸收系數(shù)都要足夠高；其四，供體與受體的偶極的相對取向要合適。熒光共振能量轉(zhuǎn)移包含兩種主要機制。一種是Frster共振能量轉(zhuǎn)移（Frster resonance energy transfer, FRET），它是指供體單線態(tài)與受體單線態(tài)之間的共振能量轉(zhuǎn)移，是熒光共振能量轉(zhuǎn)移的最主要的機制。另外一種為德克斯特(Dexter)電子傳遞機制，它是指供體三線態(tài)與受體單線態(tài)之間的共振能量轉(zhuǎn)移11。1.1.5激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移機理當存在分子內(nèi)氫鍵時，分子受到光激發(fā)后，形成氫鍵的質(zhì)子的酸性提高，使分子易發(fā)生激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移（Excited-State Intramolecular Proton Transfer，ESIPT）過程?？梢园l(fā)生ESIPT過程的分子一般含有羥基或氨基，被激發(fā)時，羥基或氨基上的質(zhì)子轉(zhuǎn)移至鄰近的與之形成氫鍵的原子上，通常形成的是五元環(huán)或六元環(huán)（原子間距離一般不超過2 ），從而由之前的醇式結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)橥浇Y(jié)構(gòu)。激發(fā)態(tài)（不是基態(tài)）時所形成的酮式結(jié)構(gòu)要比醇式結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，所以其發(fā)射的熒光波長比原分子的波長要長12。1.1.6分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移機理分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移是指處于激發(fā)態(tài)的分子發(fā)生了電荷轉(zhuǎn)移，其造成整個體系的正負電荷分離，所以發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移的分子一定包含電子給體（doner）和電子受體（accepter），而且它們之間有共軛的兀鍵作為電荷轉(zhuǎn)移的通道。因此典型的利用分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）過程實現(xiàn)檢測的熒光探針主要就是熒光團上連有吸電子基和供電子基的推-拉電子體系，其識別基團往往是推-拉電子體系整體中的一部分。當識別基團與客體作用時，對熒光團的給電子能力或拉電子能力產(chǎn)生影響：當電子給體的給電子能力或受體的接受電子能力增強時，ICT熒光染料的發(fā)射波長將發(fā)生紅移。反之，藍移。當識別基團位于供電子基團（如氨基）的一端時，與客體結(jié)合后會減少供體的供電子能力，從而導致體系的共軛程度降低，能量升高，使吸收光譜藍移，摩爾消光系數(shù)也隨之減小。于吸電子基團一端時，與客體作用后，增強了拉電子基團的拉電子能力，使整個體系的電子流動性增大，能量降低，吸收光譜紅移，摩爾消光系數(shù)增大，發(fā)射波長紅移。處于激發(fā)態(tài)上的分子由于電荷轉(zhuǎn)移而造成的電荷分離的狀態(tài)，具有正負電荷復合而回到基態(tài)的趨向，所以是不穩(wěn)定的。若這個復合過程發(fā)生輻射躍遷，就會伴隨ICT熒光發(fā)射。所以凡是能促使正負電荷復合的因素都會降低體系的能量，進而使ICT熒光光譜紅移，反之藍移13。1.1.7單體、激基締合物機理如果兩個相同的熒光團（主要是多環(huán)芳烴，例如葸、芘）之間的距離合適，且位置恰當，那么其中一個熒光團受光照射變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)分子后，就容易和另外一個基態(tài)熒光團分子形成激基締合物（excimer）。熒光發(fā)射光譜也由原來的單體發(fā)射峰轉(zhuǎn)變成波長更長、范圍較寬的發(fā)射峰。激基締合物的形成條件之一是激發(fā)態(tài)分子和基態(tài)分子間的距離必須合適14，所以我們可以通過改變兩個熒光團間的距離來控制激基締合物的形成或分解，改變距離的方法之一就是改變分子間作用力及空間位置。因此當某一熒光團與待測分子作用后，分子間作用力勢必會發(fā)生改變，從而實現(xiàn)對分子的檢測。1.2硫醇識別和檢測的意義 小分子硫醇在生命系統(tǒng)中有重要的作用。在生命體中有三種重要的含巰基的生物分子：Cys, Hcy, GSH,它們有類似的結(jié)構(gòu)。通常細胞內(nèi)硫醇濃度的改變與一系列的疾病相關，如：白細胞缺失，牛皮癬，肝損傷，癌癥，艾滋等。15,16Cys（半胱氨酸）是參與構(gòu)成蛋白質(zhì)的常見氨基酸中唯一具有自由巰基的組分，它的缺乏會導致一些疾病，如小兒生長發(fā)育遲緩，頭發(fā)花白，水腫，嗜睡，肝損傷，皮膚損害和身體乏力。17 Hcy（高半胱氨酸）的結(jié)構(gòu)與半胱氨酸十分相近，僅比半胱氨酸多了一個亞甲基（-CH2-），卻賦予了兩者截然不同的生理特性。Hcy并不是人體必需氨基酸，也基本不參與蛋白質(zhì)的合成。Hcy在血漿中濃度的增高，會導致老年癡呆癥的葉酸和維生素B12的缺失，也會導致心血管疾病，血液中Hcy的濃度還和生殖缺陷，老年人的認知障礙有關等等。18,19 GSH（谷胱甘肽）是由半胱氨酸、谷氨酸（glutamic acid, Glu）和甘氨酸（glycine, Gly）三種氨基酸構(gòu)成的小分子三肽，是細胞內(nèi)含量最高的非蛋白硫醇，起到維持許多細胞生理功能作用，如維持細胞內(nèi)氧化還原反應環(huán)境，異生物質(zhì)代謝，細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)換和基因管理。20因此，在生物樣品中檢測這些含巰基的生物分子就顯得小分子硫醇在生命系統(tǒng)中有重要的作用。1.3傳統(tǒng)硫醇檢測方法檢測硫醇的常用方法有很多，如高效液相色譜法和毛細管電泳分離法結(jié)合21不同的檢測方式，通常都是較優(yōu)的方法。類似的每種方法都由于設備花費很高，操作復雜性，樣品處理和檢測時間有各自的局限，多種類的硫醇同時要測定提出了挑戰(zhàn)。直接運用電化學技術(shù)來檢測硫醇是一種簡便的檢測方法。然而，電化學氧化法直接檢測含硫醇化合物有一定局限性，原因是大多數(shù)的含硫醇的生物還原物質(zhì)有相似的氧化電勢，使用的常用固體電極限制了它的選擇性。另一方面，直接氧化硫醇的電化學方法檢測速度慢且通常需要過高的電壓。硫醇和指示劑之間電催化反應由于要達到很高的精度和實驗條件的非常細小的調(diào)整抑制了電化學方法的廣泛應用。22,23其他質(zhì)譜檢測的方法像氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）也運用在檢測硫醇中。24.25 質(zhì)譜檢測有特異性，因為它能實時監(jiān)測離子碎片。同時具有靈敏性，因為增強了信噪比，縮短了樣品后處理和副反應，使得檢測時長變短。然而，該方法仍有一些問題，如復雜的色譜儀器的使用，復雜的樣品預處理及其檢測步驟，樣品的再現(xiàn)性差，特別是在復雜組分里如血漿，尿液等。261.4熒光探針檢測硫醇的方法近年來，有大量的硫醇檢測試劑問世，這些試劑利用巰基在特定條件下所表現(xiàn)出的強親核能力、還原能力以及與金屬離子形成配位鍵的能力來對巰基化合物進行識別和檢測，常見的反應機理主要包括以下幾種：邁克爾加成反應，和醛酮的環(huán)化反應，磺酰胺和磺酸酯的裂解，硒氮鍵斷裂，二硫鍵的裂解，氧化還原機理等。1.4.1基于加成反應邁克爾加成機理的探針近幾年已經(jīng)得到廣泛的發(fā)展，針對硫醇檢測染色體熒光探針的邁克加成的受體分子也得到廣泛的研究。這些探針從機理來看可以分為四類。 1,1加成機理：該機理是已知的某些含巰基的氨基酸進行1,1-加成反應與羰基形成新的環(huán)結(jié)構(gòu)?；谶@一概念，可以設計含有合適的熒光基團的醛或染料，與硫醇可以發(fā)生1,1-加成。作為一個普通的例子，圖1-1顯示胱氨酸反應與醛的形成，在這種情況下，一個四氫噻唑環(huán)。使用這種方法，醛衍生物基于菲，咪唑，枝狀生色團，萘酰亞胺，熒光素，若丹明，香豆素，和金屬配合物已被開發(fā)作為硫醇探針。 圖1-1 硫醇1,1-加成機理基于菲的探針1被Tanaka27等人用作硫醇1,1-加成的化學傳感體，他們用這個探針檢測了一系列氨基酸（半胱氨酸，蛋氨酸，賴氨酸，絲氨酸，脯氨酸，組氨酸)和谷胱甘肽在水和乙腈中的混合物。與半胱氨酸的反應在250nm和380nm處有吸收峰，然而其他氨基酸和葡萄糖不改變探針的發(fā)射譜。與GSH反應導致的熒光中只有很小的增加。當熒光強度30 min后測，只有與胱氨酸提供的值明顯高于空白反應（沒有氨基酸）這些結(jié)果表明，這種熒光法檢測半胱氨酸的選擇性，并能夠區(qū)分這從其他簡單的硫醇的氨基酸。觀察到的選擇性的半胱氨酸的巰基反應的存在和相應的噻唑烷環(huán)形成的結(jié)果（圖1-2）。該探針也被用來在生物成像中的應用。如圖探針1反應生成化合物2.圖1-2.探針1與Cys的反應 兩種偶氮染料（3和4）28含有醛基是由Huang和LIET報道等。作為半胱氨酸和同型半胱氨酸的比色探針。增加濃度的Cys或Hcy水平的DMF溶液在藍色的吸收帶的移位從465到442 nm的加入。Cys DMF水溶液的添加：4（9：1 V / V）在pH值為7（HEPES緩沖液）在515 nm處的誘導在吸收強度降低，具有藍移的峰值伴隨出現(xiàn)在475 nm，對應一個顏色從粉紅色到黃。4在DMF中的光學性質(zhì)：水（91，vv）對其他氨基酸（苯丙氨酸，蘇氨酸，精氨酸之外，他的，天冬酰胺，丙氨酸，亮氨酸，纈氨酸，甘氨酸，親，賴氨酸，谷氨酰胺，絲氨酸，異亮氨酸，遇見，酪氨酸，色氨酸，谷氨酸，是進行了研究，但沒有明顯的光譜變化類似于那些在4半胱氨酸和同型半胱氨酸的藍移被發(fā)現(xiàn)觀察到的，表明噻唑烷和噻嗪衍生物的選擇性形成4A 和4B。 圖1-3探針3和4與半胱氨酸和同型半胱氨酸的反應1,2-加成反應：當烯烴或炔烴基團連接到一個吸電子基團，在親核硫醇上可以發(fā)生邁克爾加成。這個基本的反應在耦合上有色或者熒光基團可以。使用這種方法，烯烴或炔烴連接吸電子基團如氰基，硝基支架，羰基，和信號單元如香豆素，馬來酰亞胺，熒光，和丹等，已被稱為巰基探針。如圖1-4所示 圖1-4 1,2-加成的機理 如圖1-5所示當化合物5處在緩沖溶液中，在340 nm時有較強的熒光，在430 nm處有觀察到的發(fā)射光。在加入半胱氨酸，同型半胱氨酸，谷胱甘肽，半胱氨酸和甘氨酸，發(fā)射強度增量為CysGSH HcyCys- Gly。29例如，在10倍的半胱氨酸或谷胱甘肽時發(fā)射增強，在量子產(chǎn)率的變化分別為0.0013和0.0010，沒有發(fā)生帶移。使用化合物6在類似實驗條件下反應量子產(chǎn)率分別提高到0.0022和0.0016 ?；衔?和6對于這些生化硫醇的選擇性，已經(jīng)通過制備不同種類的探針的探針得到探明，這些探針有的接上了賴氨酸，絲氨酸，苯丙氨酸，等氨基酸。在上述的巰基化合物的檢測范圍，這些化合物沒有任何明顯的干擾，即使在相對于探針100：1的摩爾比下。此外，化合物6比化合物5更有活性，可能是因為化合物6羥基對于臨近烯基的質(zhì)子給與能力使碳鏈更加靠近，從而使反應位便于被硫醇進攻。X=H 5 X=OH 6圖1-5 探針5,6和硫醇的反應 一種基于青色素的高選擇性針對于 Hcy 和GSH近紅外探針已經(jīng)得以制備。在探針7中加入Cys，在775nm的吸收帶強度銳減，并且在515nm處出現(xiàn)新的吸收帶30。作者證實了從7到 CyAK與半胱氨酸反應。 整個檢測機理包括了Cys向丙烯酸單元的加成生成相應的硫醚從而進一步分子間環(huán)化成為CyAK。在其他氨基酸中也研究了探針的熒光顯示能力，但是沒有觀察到熒光現(xiàn)象。值得一提的是，探針對于Cys的響應卻在對于Hcy和Gsh時觀察不到。這種差異可以歸因為分子間反應的不同的動力學速率。分子間與Cys環(huán)化成為七元環(huán)的反應能夠很好的和八元環(huán)匹配。在Gsh的例子中只有共軛的硫醚生成，因為三肽巨大的位阻阻礙了分子間的環(huán)化反應。該探針已經(jīng)用于生物構(gòu)圖領域。 圖1-6 探針9與Cys的反應 1,3加成反應：1,3-加成同樣用于鑒別存在的硫醇，在這個部分，硫醇對醌和醌的類似物的加成反應已經(jīng)被報道。如圖1-7所示 圖1-7 硫醇探針的1,3-加成機理 化合物10 被Zhang課題組用作硫醇的比色探針31。探針10在582nm處有強烈的ICT帶在和Cys加成后，由于硫醇基團和探針琨的部分發(fā)生加成反應，使琨變成相應的對苯二酚，ICT帶的強度開始降低。同樣，在和GSH加成后，ICT的強度也出現(xiàn)減小的現(xiàn)象。作者也發(fā)現(xiàn)和Cys相比，探針和GSH反應的ICT帶強度減少的更加緩慢，這可能是前者的空間位阻更大的原因。 圖1-10 化合物10和硫醇的反應 化合物11在1;1的水和乙腈混合液中在532nm處展現(xiàn)出強的ICT帶。隨著Cys的加入，ICT帶開始逐漸減小。對于和GSH的反應，探針11也有相似的現(xiàn)象。為了檢驗探針的選擇性，作者開展了相關的對照試驗，但是作者并沒有觀察探針在和其他氨基酸作用時現(xiàn)象的差異。作用機理包含了硫醇和醌的反應，導致了相應的對苯二酚生成。32 圖1-11 化合物11和硫醇反應1,4-加成反應：報道過的檢測硫醇的1,4加成機理，是基于苯并吡喃核心的，該核心包含吸電子基團（EWG）。在第一個例子中發(fā)生開環(huán)反應然而在第二例中，硫醇的加成包含了一個吡咯環(huán)的重排。如圖-15所示 圖1-12 1,4-加成機理 另一種豆香素-苯并吡喃被Yoon教授用作硫醇的檢測。通過檢測吸光度和熒光變化，來研究硫醇探針的選擇性，探針12中加入了不同種類氨基酸，有同型半胱氨酸，谷胱甘肽，半胱氨酸，精氨酸，丙氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，谷氨酰胺，谷氨酸，甘氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，賴氨酸，苯丙氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，色氨酸，酪氨酸，纈氨酸。當有硫醇存在時，探針12展現(xiàn)出了紫外-可見光譜圖變化和熒光加強。然而，當分析物中沒有硫醇存在時，并沒有導致紫外-可見光譜圖的變化，在相同條件下也沒有導致熒光發(fā)射性質(zhì)的變化。作者也證實了，對于其他硫醇，諸如MPA和ME，探針12對于Cys，GSH和Hcy表現(xiàn)出相似的性能。作為一種典型的生物硫醇Cys用于進一步檢測探針在紫外可見光譜圖下的響應。當Cys加入到含有探針17的HEPES緩沖液中，在320nm處的吸收峰逐漸減小，同時在372nm處出現(xiàn)一個新的吸收峰。在350nm處也出現(xiàn)一個很容易標記的等吸收點，這也額能預示著生成一個新的物質(zhì)。當處在320nm和372nm處的變化被檢測到時，在Cys濃度在0到35uM之間，吸收值與Cys的濃度呈線性比例。在存在HEPES的緩沖溶液中，探針12的熒光譜圖的變化也得到研究。觀察到Cys的加入導致了發(fā)射譜圖的變化，在455nm處出現(xiàn)了發(fā)射強度的增強。作者也注意到一個有趣的現(xiàn)象，探針18可以用作硫醇的細胞構(gòu)圖，探針12-硫醇體系也可用作重金屬離子的再生。硫醇的檢測機理是基于硫醇-色稀的點擊開環(huán)反應。此外，也發(fā)現(xiàn)有些金屬離子有利于脫硫反應。33 圖1-13 探針12與硫醇反應及結(jié)構(gòu)圖具有可見熒光效應的色稀衍生物13在加入一系列在HEPES緩沖溶液中的待測物諸如半胱氨酸，同型半胱氨酸，甘氨酸，苯丙氨酸，絲氨酸，谷氨酸，賴氨酸，精氨酸，谷氨酰胺，丙氨酸，遇到他，酪氨酸，尹恩課題組就做了相關的研究。22在存在包含硫醇的分析物中，探針13展現(xiàn)了454nm處的一個吸收峰的減弱，然后在500nm處有個明顯的新的峰出現(xiàn)。在520nm處，探針18展現(xiàn)出了一個發(fā)射的增強。初始的探針量子產(chǎn)率為0.04，當加入了10倍的GSH，Cys和Hcy后，量子產(chǎn)率分別達到0.65， 0.91， 0.47.對于其他氨基酸的研究，只出現(xiàn)很小的顏色或者發(fā)射譜圖的變化。諸如ME和DTT之類的硫醇類化合物，導致探針發(fā)生了相似的顏色變化。熒光的加強和紫外-可見光譜圖的變化歸因于硫醇向1,3-不飽和醛酮的1,4-加成，從而生成得到相應的硫醚。這個體系的值可以得到所檢測細胞中的硫醇種類和含量。 圖1-14 探針13和硫醇的反應1.4.2 基于與醛的成環(huán)反應Tanaka和Barbas III等人報道了一個檢測Cys的熒光增強的方法，利用在中性環(huán)境的熒光醛14. 在磷酸鈉緩沖液（pH= 7）中，14與Cys的反應后在380nm有熒光增強，而與GSH反應后只有小幅的熒光增強。反應30分鐘后，Cys的濃度（100mM至5mM）都能和熒光強度很好地對應。34 圖1-15 探針14與Cys的反應機理 Huang和Li等人報道了簡單的，利用探針15和16檢測Cys和Hcy的光化學法。在15的DMF溶液中，當Cys或Hcy增加，在紫外能觀察到465到442的藍移。在pH為7的DMF-H 2 O溶液（9：1，v/v，HEPES緩沖液）中，加入Cys，10在515nm的吸收強度下降，同時伴隨475nm處的藍移后的峰，顏色由粉至黃。該組還利用銥（III）絡合物11和鉑（II）絡合物12作為檢測器。前者對Hcy較其它氨基酸（包括Cys）和GSH，顯示獨特的發(fā)光變化。后者作為一種對Cys和Hcy高度選擇性的磷光發(fā)光探測器。 該組還利用銥（III）絡合物17和鉑（II）絡合物18作為檢測器。前者對Hcy較其它氨基酸（包括Cys）和GSH，顯示獨特的發(fā)光變化。后者作為一種對Cys和Hcy高度選擇性的磷光發(fā)光探測器.35,36 HO 15 16 17 18 圖1-16 探針15-18的結(jié)構(gòu) Peng及其同時還開發(fā)了一種新的探針19. 在沒有明顯熒光加強的下，它能夠在水溶液或者是活細胞中將Cys和Hcy及GSH區(qū)分開來。用若丹明-6G合成出來的探針19，本身就具有微弱的熒光。37當200M的Cys加入到探針19的溶液中，能夠觀察到20倍的熒光加強。（乙醇-PBS0.1 M, pH = 7.00, 3 : 7, v/v），同時在531nm處有微弱的峰出現(xiàn)。探針的熒光強度與加入Cys的呈比例，檢測限度為73.5nM。在加入Cys后，通過一個開環(huán)反應形成新的化合物同時也促進它水解為RGCOOH 。反應進行熒光加強，也伴隨著顏色由無色變?yōu)榉奂t色。在Hcy的例子中，它與探針形成的中間產(chǎn)物是無色無熒光的，從而確保了探針在Cys，Hcy和GSH中對Cys的選擇性。在生化樣品的檢測中MCF和PC12細胞在有探針的情況下表現(xiàn)出明顯的細胞間熒光，該探針也可用于探測人體尿液中的Cys。 19 圖1-17 探針19與CYS和Hcy的反應1.4.3 基于斷裂反應檢測方法Maeda等人利用芳香族親核取代來設計如圖20a的硫醇探針（19和20）。在HEPES 緩沖液(10 mm, pH 7.4) 含 0.5% EtOH溶液中，加入GSH或Cys能觀察到選擇性很大熒光的增強。十分鐘后熒光強度穩(wěn)定，在37攝氏度GSH與19和20的反應速率常數(shù)kobsd據(jù)報道分別是1.710-2和1.410-2 M-1 s-1。5,5-二硫-雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB或Ellman試劑）廣泛用于定量檢測硫醇，特別是含各種酶的物質(zhì)包括含有乙酰基和丁?；憠A酯酶（分別是AChE和BCHE）通過酶促反應釋放硫醇。作者成功的說明，探針19和20可以用做可靠的熒光檢測ChE抑制活性系統(tǒng)。38 19 20 圖1-18 探針19和20與硫醇的反應Hilderbrand等人報道了熒光開關探針21，用于硫醇的選擇性傳感和生物成像。在HEPES緩沖液中（10mM，pH7.4）中，硫醇裂解2,4 - 二硝基苯基磺?；?，釋放紅色發(fā)射性的供體-受體熒光團。硫醇為介質(zhì)的裂解磺酰基釋放苯胺吸電子體，增加染料的電子推拉性，能提高量子產(chǎn)率，在吸收和發(fā)射光譜上增大紅移（158 nm）。當加入Cys后，溶液立刻由黃色變成粉紅色，顯示熒光性，熒光開關比高達120倍。探針21在活細胞中硫醇分子的生物成像的應用也被通過使用白化瑞士小鼠胚胎成纖維細胞（3T3細胞系）證實。39 21 圖1-19 探針21與硫醇的反應 Tang等人利用硫醇選擇性裂解Se-N鍵來設計硫醇探針?；诹_丹明的熒光探針22含有一個Se-N鍵，在PBS (pH 7.4, 20 mM)中，加入GSH后，巰基的親核取代反應使Se-N鍵顯示出熒光增強。該探針為GSH的檢出限據(jù)報道是1.4 nM。探針58反應熒光性比GSH高出2-3倍。新探針被成功地應用到HL-7702細胞和HepG2細胞高的靈敏度和選擇性的硫醇成像。該探針雖然成功顯示出了人體正常肝細胞與肝癌細胞內(nèi)硫醇含量的差異，但是探針自身背景較高，無法獲得滿意的信噪比，故該小組講硫醇裂解Se-N拓展到探針23。當在PBS (pH 7.40, 15 mM)中加入GSH后，探針23顯示出信噪比（最多至170倍），檢出限是144 pM。反應時間在5分鐘內(nèi)，能用HL-7702細胞和HepG2細胞硫醇成像.40,41 22 23 圖1-20 探針22和23與硫醇的反應1.4.4 基于金屬配位的檢測方法 由Ma等人研發(fā)出的選擇性測定Cys的一種簡單，靈敏度高的化學發(fā)光法（CL）。這種方法基于奎寧能使鈰(IV)氧化Cys微弱的化學發(fā)光顯著增強。鈰（III）在奎寧存在時，將能量轉(zhuǎn)給奎寧，產(chǎn)生激活態(tài)奎寧，在300-400nm的波長范圍內(nèi)鈰（）的發(fā)射光譜和奎寧的吸收光譜有重疊?？鼘幨且粋€很好的熒光物質(zhì)，發(fā)射最大值在450 nm左右。在3.5nM至3.5 M的校準曲線呈線性關系，檢出限為2.5nm。由于靈敏度高，即使將人血清簡單地稀釋一千倍，也能用這種方法測定Cys總濃度。與通過氨基酸自動分析儀給出結(jié)果一致。 該組還報道了，這種方法還能運用于在含Cys的兔子血中，選擇性檢測GSH。在Ce(IV)奎寧系統(tǒng)中，GSH比Cys展現(xiàn)出更強的化學光，在血液中，GSH的濃度遠高于Cys。42,43 Zhang等人還開發(fā)了一種利用pH=8.8的鎘（II）-8 - 羥基喹啉-5 -磺酸（HQS）配合物溶液取代方法（探針24）。該方法可以在監(jiān)測范圍(018.2 M)檢測Cys，檢出限為0.4 M。首先，鎘先和HQS反應，再和Cys反應釋放自由HQS，重新顯示熒光性。44 24 圖1-21 探針24和硫醇的反應 一種基于蒽的探針25也被用于檢測硫醇，銅離子是作為受體來猝滅所激發(fā)的熒光的。探針和銅離子是采用原位合成的。銅離子與探針的比例低于2. 這個探針對Cys和Hcy有極高的選擇性（0.1M NaCl 0.05M HEPES為緩沖溶劑）。Cys和Hcy與探針體系的結(jié)合常數(shù)經(jīng)計算為1.8105和3.3105M。 圖1-22 探針25Yang和Chan等人報道了一種基于螺吡喃衍生物26，作為Cys/Hcy選擇性比色探針。pH7.0 10%水的乙醇溶液中，532nm處強烈的吸收帶和大約378nm的第二個吸收帶能表征出66的開環(huán)加合物。當在含有66和Cu2+, 或66和Hg2+溶液中加入Cys，532nm處的吸收強度明顯下降，而378nm處吸收強度移至405nm，且強度增強。據(jù)報道Cys的檢出限是49nM。45 圖1-23 探針26及其反應 基于21-Cu2+和羅丹明B的熒光內(nèi)濾效應（IFE）而設計的一個簡單的檢測Cys的熒光化學敏感物。當加入Cu2+后，無色無熒光性的羅丹明B螺內(nèi)酰胺衍生物21顯示出了粉紅色和弱熒光。當在21-Cu2+配位溶液中加入羅丹明B，由于熒光內(nèi)濾效應（IFE），羅丹明B的熒光信號顯著衰弱。在上述溶液中加入Cys，它將優(yōu)先與Cu2+結(jié)合，接著21-Cu2+ 配位解離，從而降低溶液的IFE熒光性，反過來導致化學敏感系統(tǒng)的熒光增強。熒光增強曲線在10.0MCys以下與Cys濃度呈線性關系，檢出限是0.14 M。46 圖1-24 21-Cu結(jié)構(gòu)及其反應1.4.5 基于納米材料的檢測方法 Thomas等人對乙腈和水的混合物（4：1）中，硫醇與Au納米棒（0.12 nm）的吸收光譜的變化進行了研究。在Cys和GSH存在的情況下，縱向表面等離子體吸收帶強度顯著降低，并伴隨在850nm處新生成的吸收帶。730nm形成的明確的等吸收點說明兩種金納米棒存在于溶液中。當Cys/GSH存在時，能在850nm處觀察到新的紅移，當Cys過量存在時，近紅外區(qū)域能觀察到吸收帶逐漸移動，表明二聚體的金納米棒通過兩個點的靜電相互作用進一步逐步聚合。47Dong等人也報道了有關硫醇的檢測方法，應用了可溶性銀原子熒光簇作為熒光感應器來表征Cys.48相關的熒光探針在615nm處被Cys所猝滅。在檢出限為20nM的條件下，能夠在6-25nM確定出樣品中是否含有Cys?；谖蘸蜔晒庑难芯?，表明通過硫醇加速了釋放出的銀原子氧化，Cys將熒光猝滅。Chang和其同事報道了一種32-nm的金納米粒子(GNPs)和被共價吸附的尼羅紅溶液，用于感測硫醇。所制備的NRGNPs熒光性弱。GNPs與硫醇強AuS鍵和作用使得產(chǎn)物在GNP上脫附，熒光性增強。該系統(tǒng)能選擇性檢測如Cys和Hcy，檢出限分別是10.2和10.9 nM。當同時采用熒光和比色測定法，選擇性會更好，因為在pH4.0，帶負電荷硫醇存在下（如，N-（2-巰基丙?；└拾彼幔?，NRGNPs顏色不改變，中性硫醇存在下（如，3-巰基-1,2-丙二醇）和帶正電荷硫醇如（如，Cys），顏色從栗色分別變?yōu)樽仙偷仙?。根?jù)的NRGNP顏色變化，GSH能輕易和氧化GSH（無聚合和取代）以及Cys和Hcy（快）區(qū)分。1.4.6 其它檢測方法 Mutus等人報道了細胞非通透的探針O-氨基苯甲酰-S-亞硝基同型半胱氨酸(AbzHcysNO)，與硫醇反應變的有熒光性。AbzHcysNO有最低限度熒光。當有過量硫醇存在時，硫醇因為能將AbzHcysNO上的NO部分通過轉(zhuǎn)亞硝化或轉(zhuǎn)巰基化移除，而增強熒光性大約140倍。利用熒光酶標儀檢測硫醇檢出限是30pmol。此系統(tǒng)也被用于確定正常人纖維細胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞表面硫醇。49 圖1-25 AbzHcysNO的結(jié)Jiang等人報道了一電荷轉(zhuǎn)移絡合系統(tǒng)，以選擇性地區(qū)分Cys和其他氨基酸，包括在MeCN-H2O（1 : 1, v/v）中，區(qū)分二羥甲基二-（2 -吡咯基）甲烷（70）和四氰基對苯二醌二甲烷（TCNQ）。如圖37所示，混合系統(tǒng)顏色逐漸由淡黃綠色轉(zhuǎn)向深綠色（接近完整的顏色轉(zhuǎn)換）。在這種情況下，自由TCNQ在397 nm處的吸收峰消失，而兩個新的吸收帶分別在317nm和長波長區(qū)（大約627nm）。當加入Cys，顏色由藍色轉(zhuǎn)變?yōu)閹缀跬该鳌?0 圖1-26 探針26和四氰基對苯二醌二甲烷（TCNQ）硫醇傳感機制 1.5 本文設計思路生物硫醇是一類具有還原能力的活性物質(zhì)，它們參與調(diào)節(jié)機體的氧化還原平衡，結(jié)構(gòu)中自由巰基的存在也使得這類物質(zhì)更易與酶、金屬離子及治療藥物等結(jié)合并發(fā)生相互作用，從而扮演了更多也更為重要的生理或病理角色。50-53此類物質(zhì)有很多，其中最受關注的是半胱氨酸（cysteine, Cys）、高半胱氨酸（homocysteine, Hcy）和谷胱甘肽（glutathione, GSH）三種與健康息息相關的小分子物質(zhì)（分子結(jié)構(gòu)如圖1-27所示）。 圖1-27 半胱氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽的分子結(jié)構(gòu)式近年來，也有許多基于萘酰亞胺和香豆素的硫醇熒光探針被相繼報道并且得到不錯的應用效果。鑒于此，本文介紹了對硫醇類物質(zhì)有響應的基于TCF的類熒光探針化合物，該探針應合成步驟簡單，光化學性質(zhì)穩(wěn)定，在水溶液中有溶解性，在生理pH條件下（用pH=7.4的PBS緩沖液模擬）與以上三種硫醇結(jié)合熒光性質(zhì)發(fā)生改變，另外對硫醇有較高的檢測靈敏度，且發(fā)射波長較長以有效避開生物試樣自身熒光的干擾。設計的探針為比率型熒光探針，比率熒光測定技術(shù)是熒光分析中的一項重要技術(shù)，是指采用熒光探針在獨立狀態(tài)下發(fā)射波長處的熒光強度和與待測物反應后在另一波長處發(fā)射的熒光強度的比值作為檢測信號來檢測物質(zhì)的一種方法。54由于比率熒光探針以同樣環(huán)境下測定的兩個波長處熒光強度的比值作為信號參量，若有影響則兩處的熒光強度都會發(fā)生同樣的變化，誤差相互抵消，比值基本不受外界影響，結(jié)果得到修正，所以可有效消除探針、樣品及設備等因素引起的數(shù)據(jù)失真，從而得到更準確的結(jié)果，同時也提高了探針測量的選擇性、靈敏度、動態(tài)相應范圍等55-56。引起熒光信號變化所涉及的機理主要有熒光共振能量轉(zhuǎn)移、光誘導電子轉(zhuǎn)移、分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移、激基締合物的形成或消失、激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移等57。基于此，我們設計了基于TCF的熒光探針。TCF本身具有熒光，3號位的甲基與四種苯甲醛衍生物加成后得到相應的探針。TCF及相應的探針結(jié)構(gòu)如圖1-28所示。在檢測硫醇時，硫醇與探針上的不飽和C=C雙鍵加成，破壞了探針的共軛結(jié)構(gòu)，從而導致了探針光學性質(zhì)的變化，借此可以對硫醇類物質(zhì)進行測試。為了檢測探針在水溶液中的性能，我們選用了DMF作為溶劑配成探針溶液，在PBS（pH=7.4）的緩沖溶液中對半胱氨酸（Cys），同型半胱氨酸（Hcy）和谷胱甘肽（GSH）進行測試，并繪制反應滴定曲線。也檢測了探針對于脯氨酸（Pro），甘氨酸（Gly），絲氨酸（Ser），組氨酸（His），丙氨酸（Ala），異亮氨酸（Ile），精氨酸（Arg），天冬氨酸（Asp）和蘇氨酸（Gla）反應的選擇性。 圖1-28 TCF結(jié)構(gòu)對于此，我們設計并合成了以下四種基于TCF的熒光探針,依次命名為TCF-Br，TCF-S,TCF-SO,TCF-N。并檢測它們與半胱氨酸（Cys），同型半胱氨酸（Hcy）和谷胱甘肽（GSH），亞硫酸鹽，硫化氫以及9種氨基酸的反應性能。分子探針結(jié)構(gòu)如圖1-29所示。 TCF-Br TCF-S TCF-SO TCF-N圖1-29 本文合成的目標分子2 探針分子的合成2.1 實驗儀器及試劑2.1.1 實驗所涉儀器 紫外-可見吸收光譜的測定采用Evolution 220 UV-visible spectrophotometer，由Ther mo Scientific公司提供。熒光光譜的測定采用Lumina fluorescence spectrometer，由Thermo Scientific公司提供。1H-NMR的測定采用Bruker AV-400 spectrometer (400M Hz)。質(zhì)譜的測定采用MA 1212 instrument，在標準條件下進行測試 (ESI, 70 eV)。所有的光譜測試都在 25 C室溫條件下進行。超純水儀（Sartorius Arium 611DI），pH計（FE20/EL20,梅特勒-托利多上海儀器有限公司），低溫冷卻循環(huán)泵、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海大顏儀器設備有限公司），循環(huán)水式多用真空泵（SHZ-DIII,上海衛(wèi)凱儀器設備有限公司），電熱恒溫鼓風干燥箱（上海醫(yī)用恒溫設備廠），超聲儀（SZ-80,賽智科技杭州有限公司），漩渦振蕩器（QL-901,海門市其林貝爾儀器制造有限公司），電子天平，恒溫磁力攪拌器（上海禾汽化工科技有限公司），槍頭、移液槍（量程有100-1000L，20-200L，10-100L，0.5-10L）（上海康敏檢驗設備有限公司），可調(diào)電接點玻璃水銀溫度計（江蘇丹陽溫度計廠)，比色皿，一次性滴管（3mL），硅膠層析板，層析柱。2.1.2 實驗所涉及的藥品丙二腈（上海阿拉丁公司），氘代氯仿和DMSO-d6（分析純），乙腈（分析