微生物實(shí)驗(yàn)室的分類及要求

微生物實(shí)驗(yàn)室的分類及要求,一、微生物的生物安全等級,根據(jù)生物因子對個(gè)體和群體的危害程度可將微生物分為4 級 1.危害等級I （低個(gè)體危害，低群體危害） 這類微生物包括：不會(huì)導(dǎo)致健康工作者和動(dòng)物致病的細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲等生物因子。 2.危害等級 (中等個(gè)體危害，有限群體危害) 這類微生物能引起人或動(dòng)物發(fā)病，但一般情況下對健康工作者、群體、家畜或環(huán)境不會(huì)引起嚴(yán)重危害的病原體。實(shí)驗(yàn)室感染不導(dǎo)致嚴(yán)重疾病，具備有效治療和預(yù)防措施，并且傳播風(fēng)險(xiǎn)有限。,3.危害等級 III （高個(gè)體危害，低群體危害） 這類微生物能引起人類或動(dòng)物嚴(yán)重疾病，或造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，但通常不能因偶然接觸而在個(gè)體間傳播，或能使用抗生素、抗寄生蟲藥治療的病原體。 4.危害等級 (高個(gè)體危害，高群體危害) 能引起人類或動(dòng)物非常嚴(yán)重的疾病，一般不能治愈，容易直接或間接或因 偶然接觸在人與人，或動(dòng)物與人，或人與動(dòng)物，或動(dòng)物與動(dòng)物間傳播的病原體。,二、生物危害評估,生物危害評估的內(nèi)容： 危害程度評估應(yīng)至少包括下列內(nèi)容： A.生物因子的種類（已知的、未知的、基因 修飾的或未知傳染性的生物材料）、 B.來源 C.傳染性 D.致病性 E.傳播途徑 F.在環(huán)境中的穩(wěn)定性 E.感染劑量 F.濃度 G.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) H.預(yù)防和治療。,三、微生物致病能力的影響因素,決定微生物致病能力的因素主要有以下幾個(gè)方面： A.菌量； B.菌齡； C.感染途徑； D.被感染者； E.存留時(shí)間；,5.實(shí)驗(yàn)室門應(yīng)帶鎖并可自動(dòng)關(guān)閉。實(shí)驗(yàn)室的門應(yīng)有可視窗。 6.實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有足夠的存儲(chǔ)空間擺放物品以方便使用。在實(shí)驗(yàn)室工作區(qū)域外還應(yīng)有供長期使用的存儲(chǔ)空間。 7.實(shí)驗(yàn)室內(nèi)應(yīng)使用專門的工作服，應(yīng)戴乳膠手套。 8.實(shí)驗(yàn)室工作區(qū)域外應(yīng)有存入個(gè)人衣物的條件。 9.實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配備高壓蒸汽滅菌器，并按期檢查和驗(yàn)證，以保證符合要求。 10.應(yīng)在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)配備生物安全柜。 11.應(yīng)設(shè)洗眼設(shè)施，必要時(shí)應(yīng)有應(yīng)急噴淋裝置。 12.應(yīng)通風(fēng)，如使用窗戶自然通風(fēng)，應(yīng)有防蟲紗窗。 13.有可靠的電力供應(yīng)和應(yīng)急照明，必要時(shí)，重要設(shè)備如培養(yǎng)箱、生物安全柜、冰箱等應(yīng)有備用電源。 14.實(shí)驗(yàn)室出口應(yīng)有在黑暗中可明確辨認(rèn)的標(biāo)識。,五、微生物實(shí)驗(yàn)室的建筑要求,1.實(shí)驗(yàn)室的建設(shè)應(yīng)以“無回路”為宗旨。 2.在時(shí)間和空間上可有效隔離各種檢測活動(dòng)。 3.實(shí)驗(yàn)室的區(qū)域設(shè)置上應(yīng)至少包括以下部分： a.樣品的接收和儲(chǔ)藏區(qū)； b.樣品的前處理區(qū)； c.樣品的微生物檢測區(qū)； d.培養(yǎng)區(qū)（BSL2 實(shí)驗(yàn)室可與檢測區(qū)合并）； e.標(biāo)準(zhǔn)菌株存放區(qū)（冰箱、低溫冰柜或常溫保存箱）； f.培養(yǎng)基與器材準(zhǔn)備區(qū)（也可與滅菌區(qū)合并）； g.無菌區(qū)；,h.污染物處理區(qū)； i.辦公區(qū)； j.更衣室； 4.建筑要求： a.墻壁、天花板、地面和桌椅、操作臺(tái)應(yīng)光滑易清潔。 b.天花板應(yīng)設(shè)置為統(tǒng)一無隙整體，以減少灰塵下落 c.地面、墻壁、天花板連接處應(yīng)有弧度。 d.除非密閉包裝，液體運(yùn)輸管路不應(yīng)在工作區(qū)上方穿過。 e.換氣系統(tǒng)中應(yīng)有空氣過濾裝置。,微生物檢測的新技術(shù),1.皿膜法以紙片法為代表,紙片法是目前被廣泛接受的方法。國標(biāo)餐具大腸菌群采用的就是紙片法。 優(yōu)點(diǎn)：無需制備培養(yǎng)基，攜帶方便，非漫延菌落計(jì)數(shù)較方便。 缺點(diǎn)：檢測成本相對偏高。與傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)缺乏對應(yīng)規(guī)律，不能替代傳統(tǒng)檢測方法，重現(xiàn)性較差。,2.微生物生化自動(dòng)鑒定儀,代表廠商：BD crystal,梅里埃 VITEK系統(tǒng)，英國AUTOREAD細(xì)菌鑒定系統(tǒng)。 鑒定原理：在細(xì)菌鑒定板中加入指示劑記錄細(xì)菌生長后發(fā)生的顏色變化，利用統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算生化反應(yīng)的概率。得出生化反應(yīng)的結(jié)果。 優(yōu)點(diǎn)：可以完全替代傳統(tǒng)生化反應(yīng)，可一次檢出多種致病微生物，靈敏度高。 缺點(diǎn)：仍然需要進(jìn)行傳統(tǒng)增菌培養(yǎng)，成本較高。,CRYSTAL生化鑒定結(jié)果,3.PCR擴(kuò)增技術(shù),PCR（polymerase chain reaction) ：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，又稱體外DNA擴(kuò)增技術(shù)。是近年來發(fā)展起來的一種體外擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)。 1985年由美國 Cetus 公司的Kary Mullis 首創(chuàng)的PCR技術(shù)，可以將微量DNA片段擴(kuò)增一百萬倍以上。 PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)：敏感度高、特異性強(qiáng)、產(chǎn)率高、重復(fù)性好以及快速簡便等，廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)、考古學(xué)、法醫(yī)學(xué)及體育等領(lǐng)域，并已普及到許多普通實(shí)驗(yàn)室，大大簡化了傳統(tǒng)的分子克隆技術(shù)，從而比較容易地對目的基因進(jìn)行分析、鑒定。,二、PCR的原理：,94變性5MIN,55退火,72引物延伸,模板變性,退火,第二次循環(huán),延伸,Step1. 變性：加熱使模板DNA在高溫下（94）變性，雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈，即變性階段。 Step2. 退火：溶液溫度降至5060，模板DNA與引物按堿基配對原則互補(bǔ)結(jié)合，即退火階段。 Step3. 延伸：溶液反應(yīng)溫度升至72，耐熱DNA聚合酶以單鏈為模板，利用引物的3-OH，以反應(yīng)混合物中的4種脫氧核苷三磷酸（dNTP）為底物，按53方向復(fù)制出互補(bǔ)DNA，即引物的延伸階段。,【實(shí)驗(yàn)步驟】,1. 在0.2 mL Eppendorff管內(nèi)配置50 L反應(yīng)體系：,2. 按下述程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增: 1） 94 預(yù)變性 3 min； 2） 94 變性 1 min； 3） 55 退火 45 sec； 4） 72 延伸 1 min； 5） 重復(fù)步驟24, 34次； 6） 72 延伸 10 min； 7） End. 3. 瓊脂糖凝膠電泳分析PCR結(jié)果 配制1瓊脂糖凝膠，取10 L擴(kuò)增產(chǎn)物電泳。保持電壓100V。電泳結(jié)束后，在紫外燈下觀察結(jié)果。,PCR實(shí)驗(yàn)的缺點(diǎn)： 1.模板DNA的制備較難。由于食品中成分復(fù)雜，油脂及金屬離子等會(huì)抵制TQP酶的活性，如用煮沸裂解法直接提取DNA，則很難去除油脂等雜質(zhì)。 2.假陰性結(jié)果：由于影響PCR的因素很多，擴(kuò)增效果常不理想。會(huì)出現(xiàn)較多的