胰臟中胰島素的分離提取背景知識(shí).ppt

項(xiàng)目一：豬胰臟中胰島素的提取,1.1 胰臟中胰島素的分離提取背景知識(shí),1.1.1 胰島素結(jié)構(gòu)及來(lái)源 1.1.2 胰島素分類 1.1.3 胰島素重大研究發(fā)展歷程 1.1.4 胰島素性質(zhì),胰島素是一種蛋白質(zhì)類激素，體內(nèi)胰島素是由胰島細(xì)胞分泌的。胰島素是由胰島細(xì)胞受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的激動(dòng)而分泌的一種蛋白質(zhì)激素。,胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu) 由51個(gè)氨基酸殘基組成 分兩條鏈：A鏈：21個(gè)氨基酸殘基 B鏈：30個(gè)氨基酸殘基 含三個(gè)二硫鏈：一個(gè)A鏈內(nèi)的二硫鍵 兩個(gè)鏈間二硫鍵,1.1.1 胰島素結(jié)構(gòu)及來(lái)源,在各種動(dòng)物的胰臟中，胰島素的含量有些差異，牛、豬、馬、羊新鮮胰臟組織中分別含有胰島素2.5、3.0、1.5、10U/g。同一種動(dòng)物不同發(fā)育階段，其含量也有較大差別。,目前開(kāi)發(fā)應(yīng)用的胰島素品種很多，有多種分類方法。胰島素制劑可根據(jù)胰島素來(lái)源、制備工藝、作用時(shí)間長(zhǎng)短等來(lái)進(jìn)行分類。 1、按來(lái)源分類：豬胰島素、牛胰島素、人胰島素 2、根據(jù)制備工藝分類：提取胰島素、半合成胰島素、生物合成人胰島素及人胰島素類似物（長(zhǎng)秀霖、速秀霖） 3、按純度分類：普通胰島素（結(jié)晶胰島素）、單峰胰島素及單組分胰島素（高純度胰島素）。 4、按起效時(shí)間分類：速效胰島素、中效胰島素、長(zhǎng)效胰島素及混合胰島素。 5、根據(jù)制劑性狀分類：溶液型和混懸腥。 6、根據(jù)給藥裝置分類：注射式和非注射式。,1.1.2 胰島素分類,可植入閉環(huán)式泵由于更接近正常人體的胰島素分泌并能克服開(kāi)環(huán)式泵需24h體外隨身攜帶等缺點(diǎn)，已成為該制劑的研發(fā)方向，其關(guān)鍵是如何突破血糖傳感器生物兼容性等技術(shù)關(guān)鍵,要使口服藥成為現(xiàn)實(shí)的關(guān)鍵在于制備過(guò)程中如何保持其生理活性，穩(wěn)定胰島素的構(gòu)型，如何減少胰島素分子多聚體的形成，促進(jìn)胰島素在小腸的吸收，如何減輕消化酶對(duì)胰島素的破壞作用，以及如何選擇有機(jī)溶劑從而減少胃腸道的毒副作用。,1788年 人們就發(fā)現(xiàn)了糖尿病的產(chǎn)生于胰功能的破壞有密切關(guān)系； 1922年起，開(kāi)始將胰臟中獲得的胰島素應(yīng)用于臨床； 1926年首次從動(dòng)物胰臟中提取到胰島素結(jié)晶。是第一個(gè)有生物活性的蛋白質(zhì)結(jié)晶； 1955年闡明胰島素序列的一級(jí)結(jié)構(gòu)； 1965年9月17日，中國(guó)首次完整人工合成了結(jié)晶牛胰島素； 1970年用X衍射方法闡明了空間構(gòu)型，為人工合成蛋白質(zhì)、探索生命奧秘做出了重大貢獻(xiàn)； 1982年世界上第一個(gè)生物技術(shù)醫(yī)藥產(chǎn)品DNA重組人胰島素上市，也是第一個(gè)基因工程藥物產(chǎn)品。,1.1.3 胰島素重大研究發(fā)展歷程,1)用基因工程大腸桿菌( Escherichia coli, E. coli)分別發(fā)酵生產(chǎn)人胰島素( human insulin, hI)的A、B鏈,然后經(jīng)化學(xué)再氧化法,使兩條鏈在一定條件下重新形成二硫鍵,得到hI。這一方法缺點(diǎn)較多,目前已較少使用。,2)用基因工程E. coli發(fā)酵生產(chǎn)人胰島素原( human proinsulin, hP I) ,后經(jīng)加工形成hI。E. coli系統(tǒng)表達(dá)量高,但缺點(diǎn)是不利于表達(dá)h I這樣的小蛋白,產(chǎn)物易降解,故常采用融和蛋白形式將hPI連接在一個(gè)較大的蛋白質(zhì)后,表達(dá)產(chǎn)物需經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的后加工才能形成有活性的hI;,3)通過(guò)基因工程酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)hPI,經(jīng)后加工形成hI。酵母系統(tǒng)下游后加工比細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)簡(jiǎn)單,但缺點(diǎn)是生產(chǎn)慢,生產(chǎn)周期長(zhǎng),且重組蛋白分泌量少(150 mg/L) ,產(chǎn)量低。,目前,國(guó)際上生產(chǎn)醫(yī)用重組人胰島素( recombinant human insulin, rh I)的方法主要有3種:,1.1.4 胰島素性質(zhì),胰島素為白色或類白色粉末結(jié)晶。由于精制方法不同，在顯微鏡下觀察，可分兩種形態(tài)，一種為不規(guī)則細(xì)微顆粒，稱“無(wú)定型”，另一種為扁斜型六面體。,牛胰島素分子量為5733，豬胰島素分子量為5761，人胰島素分子量為5781。胰島素等電點(diǎn)為5.30-5.35,。因蛋白質(zhì)等電點(diǎn)隨溶液的離子強(qiáng)度及離子性質(zhì)不同而有所變化，因此在生產(chǎn)實(shí)踐中分離，精制或結(jié)晶時(shí)采用的等電點(diǎn)并不一定正好是此值。,胰島素在pH為4.5-6.5范圍內(nèi)，幾乎不溶水，在室溫下溶解度為10g/mL；易溶于稀酸或稀堿溶液；在80%以下乙醇或丙酮中溶解；在90%以上乙醇或80%以上丙酮中難溶；在乙醚中不溶。,胰島素具有蛋白質(zhì)的各種特殊反應(yīng)：高濃度的鹽（如飽和氯化鈉、半飽和硫酸銨溶液）可使其沉淀析出，也能被蛋白質(zhì)沉淀劑和三氯醋酸等沉淀，并有茚三酮、雙縮脲等蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng)。,胰島素能被胰島酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶等蛋白水解酶水解而失活。因胰島素通常只能注射給藥。即使這樣，在血液和組織中也能被水解，所以藥物作用時(shí)間較短。當(dāng)與魚(yú)精蛋白或珠蛋白形成復(fù)合物或制成難溶解的結(jié)晶，即能延長(zhǎng)藥效。,美國(guó)基因工程技術(shù)公司，簡(jiǎn)稱基因泰克，是由風(fēng)險(xiǎn)投資家Robert A. Swanson和生物化學(xué)家Herbert Boyer博士于1976創(chuàng)立的生物技術(shù)公司，被認(rèn)為是生物技術(shù)行業(yè)的創(chuàng)始者。創(chuàng)始人Boyer博士，是DNA重組技術(shù)先驅(qū)者。1973年，Boyer和同事Stanley Cohen用限制酶從DNA分子剪下需要的片段連接到質(zhì)粒上。1977年，公司制造出荷爾蒙生長(zhǎng)抑制素；1978年，公司合成了人類胰島素。 1980年，基因工程技術(shù)公司上市，一個(gè)小時(shí)內(nèi)每股從35美元?jiǎng)q至88美元，公司的身價(jià)因此激增至3500萬(wàn)美元。這一事件是股市漲幅最大的案例之一。1982年，第一種DNA重組藥品市場(chǎng)化：人工胰島素。（