細胞的基本培養(yǎng)技術(shù).ppt

Chapter 4 Animal Cell Culture, Biology of cells in culture Fluid for cell culture Standard cell culture techniques Establishing a cell line or cell strain Cell freezing and recovery,Animal Cell Engineering,Section 3：細胞的基本培養(yǎng)技術(shù),培養(yǎng)操作的基本要領(lǐng)和要求 原代培養(yǎng)操作 傳代培養(yǎng)操作 細胞計數(shù) 細胞培養(yǎng)應(yīng)注意的問題 細胞活力的測定方法,培養(yǎng)操作基本要領(lǐng)和要求（1）,無菌操作 防治污染；成功或失敗的首要條件 培養(yǎng)前準備 操作卡片 用品置于場地，然后消毒 操作野消毒 洗手和著裝 火焰消毒,培養(yǎng)操作基本要領(lǐng)和要求（2）,動作準確敏捷 不用手觸及已消毒物品 操作面布局合理 操作保持一定順序 培養(yǎng)用瓶和吸管的放置 防止各種用液的交叉污染 不向操作野講話或咳嗽,模擬實驗（1）,某生物技術(shù)公司招聘操作面試： 小鼠肝細胞（組織塊）和脾細胞原代培養(yǎng),操作前（準備工作）： 操作中（分離、培養(yǎng)的具體方法） 操作后（清潔）,1）培養(yǎng)前準備：制定實驗計劃和操作程序。 2）超凈臺要用75%酒精擦洗，然后紫外線消毒30分鐘，工作臺面上用品不要過多或重疊放置。 3）個人進入無菌培養(yǎng)室原則上須徹底洗手并按外科手術(shù)要求著裝，開始操作前要用75%酒精或0.2%新潔而滅消毒手和前臂。 4）實驗中需保持無菌操作要求。實驗前要點燃酒精燈，燒過的器械要注意冷卻，以防細胞損傷。 5）分別使用不同吸管吸取營養(yǎng)液、PBS、細胞懸液及其它各種用液，而不能混用 6）不要用手觸及已消毒的器皿，如已接觸，要用火焰灼燒或取備用品更換。 7）注意操作時勿大聲講話或咳嗽。,Section 3：細胞的基本培養(yǎng)技術(shù),培養(yǎng)操作的基本要領(lǐng)和要求 原代培養(yǎng)操作 傳代培養(yǎng)操作 細胞計數(shù) 細胞培養(yǎng)應(yīng)注意的問題 細胞活力的測定方法,動物細胞培養(yǎng)過程圖解,原代培養(yǎng) Primary culture,概念 從體內(nèi)取出組織細胞開始培養(yǎng)到第一次進行傳代之前的時期，一個特征性的必然的生長階段。 完成了從體內(nèi)環(huán)境到體外環(huán)境的過渡和適應(yīng)過程，恢復(fù)了分裂增殖與生長發(fā)育 的能力,取材分離細胞接種,含義:包含 原代培養(yǎng)實質(zhì)是初次培養(yǎng)，即培養(yǎng)物接種到培養(yǎng)器皿 中就不再分割，任其生長繁殖 原代培養(yǎng)中的“代” 并不是指細胞繁殖的“代”數(shù) 原代培養(yǎng)過程中不分割培養(yǎng)物 不等于不更換培養(yǎng)液 建立方法: 組織塊法；分散(細胞懸液）法 時間: 一般14周,1、取 材,理論上講，各種動物和人體內(nèi)的所有組織都可以用于培養(yǎng)。 幼體較成體、分化程度低的較分化程度高的、腫瘤組織較正常組織容易培養(yǎng) 組織取材應(yīng)先切成1cm3的小塊，可置于培養(yǎng)液中4度保存，不易超過24小時。 取材時避免污染及化學(xué)物質(zhì)的損傷。,血細胞取材,靜脈取血 指尖或耳垂取血 用肝素抗凝劑20u/ml 抽血嚴格無菌,取鼠胚,用引頸法殺死動物 浸入75酒精中5分鐘消毒 開腹取材,取雞胚,選新鮮受精雞蛋，37度孵育912天，每天翻動雞蛋一次。 無菌條件下，將雞卵置于一個小燒杯中，令氣室端向上，用碘酒消毒卵殼，再用酒精消毒。 用彎剪刀環(huán)行剪除氣室端卵殼，切開卵膜，暴露出雞胚。 用彎頭鈍玻璃棒伸入雞胚頭體之間下方，取出雞胚。,問題： 原代培養(yǎng)時，如何實現(xiàn)細胞的分離和接種？,（1）細胞懸液的分離方法,材料為血液、羊水、胸水和腹水等細胞懸液時，可以采用離心法分離細胞。 一般多用5001000rmp，510分鐘。,2、分 離,（2）組織的解離方法, 解離組織：在無菌情況下采取動物的組織或器官，放在含有抗生素的平衡鹽溶液(BSS)中，然后盡快在超凈臺或無菌室內(nèi)進行解離處理。 解離時應(yīng)注意: 1) 盡可能將脂肪和壞死組織去除干凈； 2) 剪碎組織時，避免損傷組織塊； 3) 解離組織用的各種酶系，需要先進行低速離心。,（3）解離細胞,常用機械法和消化法進行 當(dāng)實驗室需要制備具有均勻細胞層的培養(yǎng)物； 從單個細胞出發(fā)獲得細胞群體； 從一定量的組織中獲得最多的細胞量時。,A. 機械法解離細胞,1）離心分離法：適用于血液、腹水等細胞懸液的分離。 2）切割分離法：將組織塊剪切成1mm3左右的小塊。 3）機械分散法：纖維成分很少的某些軟組織（脾、胸腺、腦等）。,組織塊分離,切割分離組織法 用剪刀剪至1mm3左右的大小的塊。,機械解離分離法,某些軟組織如腦、胚胎和一些腫瘤等,B. 消化法解離細胞,1）胰蛋白酶解離細胞法：所需時間較短，主要缺點是破損細胞。 2）膠原酶解離細胞法：這種方法對解離胚胎性、正常和惡性組織是很有效的。膠原酶最終濃度200u/ml，36.5溫育，一般溫育4-48h。膠原酶和透明質(zhì)酸酶協(xié)同作用有助于分離大鼠或兔的肝臟組織。 3）螯合劑解離細胞法：分離效果差 （通常用1：1的EDTA和胰蛋白酶混合液）,消化分解法,胰蛋白酶法 適用消化細胞間質(zhì)較少的軟組織，如胚胎組織、羊膜、上皮、肝、腎等 鈣離子、鎂離子、血清等都對其有抑制作用。,膠原酶解細胞法,結(jié)締組織復(fù)合膠原，用膠原酶解，使膠原酶最終濃度為200u/ml，36.5，靜置448小時，上面懸液經(jīng)離心獲得或纖維細胞沉淀，沉淀重置于生理鹽水，去掉未解向組織塊后沉淀得到上皮樣細胞。,EDTA法,乙二胺四乙酸二鈉，非酶性消化物 用于消化分離傳代細胞，能螯合鈣離子，鎂離子， EDTA工作液用不含鈣離子和鎂離子的BSS配制成0.02%的濃度 通常和0.25的胰蛋白酶1：1合用,Section 3：細胞的基本培養(yǎng)技術(shù),培養(yǎng)操作的基本要領(lǐng)和要求 原代培養(yǎng)操作 傳代培養(yǎng)操作 細胞計數(shù) 細胞培養(yǎng)應(yīng)注意的問題 細胞活力的測定方法,能維持的代數(shù) 一般是有限細胞系 種族(主要):成纖維細胞 人,50; 猴,40; 雞,37;鼠,8 部位:人: 胚肺 5010; 腎819 猴: 肺 5; 腎 20; 耳 40 條件:如表皮細胞 +EGF 從50代 增加至150 年齡,模擬實驗（2）,小鼠肝細胞和脾細胞原代培養(yǎng)兩周后，進行傳代培養(yǎng),肝細胞： 脾細胞：,細胞傳代方法,根據(jù)細胞生長的特點，傳代方法有3種： 1、懸浮生長細胞傳代 離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。 直接傳代法：懸浮細胞沉淀在瓶壁時，將上清培養(yǎng)液去除l/2一2/3，然后用吸管直接吹打形成細胞懸液再傳代。 2、半懸浮生長細胞傳代 此類細胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細胞從瓶壁脫落下來，進行傳代。 3、貼壁生長細胞傳代 采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液（含0.02% EDTA）。,貼壁生長細胞傳代方法,1、吸盡（或倒掉）培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液 2、加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個瓶底為準）靜置2-10 min（顯微鏡下動態(tài)監(jiān)測）。 3、吸去胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)液（可終止胰酶的作用）。 4、用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細胞，形成細胞懸液。 5、吸取1/101/40細胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。 6、加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細胞懸液的新培養(yǎng)瓶內(nèi)。 7、將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。,動物細胞的傳代培養(yǎng),常用細胞培養(yǎng)技術(shù), 懸滴培養(yǎng) 培養(yǎng)瓶培養(yǎng) 旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng) 細胞同步化培養(yǎng) 克隆培養(yǎng)（見后）,常用培養(yǎng)技術(shù),1、懸滴培養(yǎng) 也稱組織塊懸滴培養(yǎng)，是最早建立的體外培養(yǎng)技術(shù)，是組織和器官培養(yǎng)的經(jīng)典方法。 將培養(yǎng)液滴于蓋玻片上并鋪展開，將待培養(yǎng)的組織或器官植塊放于鋪展開的培養(yǎng)液中央部位，然后將蓋玻片翻轉(zhuǎn)放于凹載玻片上，密封后進行培養(yǎng)。,2、培養(yǎng)瓶培養(yǎng) 將擬培養(yǎng)對象直接接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)再放入培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)的方法。 3、旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng) 將所培養(yǎng)的組織細胞接種在一管狀培養(yǎng)皿（稱旋轉(zhuǎn)管），再將旋轉(zhuǎn)管置于一可旋轉(zhuǎn)的裝置上，邊旋邊進行培養(yǎng)的一種方法。,4、 克隆培養(yǎng)法 又稱單細胞分離培養(yǎng)法，就是將從細胞懸浮液中獲得的單個細胞用于培養(yǎng)，使之重新衍生成一個新細胞群體的培養(yǎng)技術(shù)。 克隆培養(yǎng)法強調(diào)培養(yǎng)產(chǎn)物的單一性而排除異質(zhì)性，所獲得的培養(yǎng)產(chǎn)物遺傳產(chǎn)物幾乎完全相同，即培養(yǎng)得到的后裔細胞群來源于一個共同的祖細胞，稱細胞株。,Section 3：細胞的基本培養(yǎng)技術(shù),培養(yǎng)操作的基本要領(lǐng)和要求 原代培養(yǎng)操作 傳代培養(yǎng)操作 細胞計數(shù) 細胞培養(yǎng)應(yīng)注意的問題 細胞活力的測定方法,細胞計數(shù),血細胞計數(shù)板：手工計數(shù)細胞,細胞數(shù)/毫升細胞懸液4大格細胞總數(shù)/410000稀釋倍數(shù),計數(shù)原則： 不數(shù)死細胞（染藍）、壓線細胞數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右，一團細胞按一個計數(shù)！,Section 3：細胞的基本培養(yǎng)技術(shù),培養(yǎng)操作的基本要領(lǐng)和要求 原代培養(yǎng)操作 傳代培養(yǎng)操作 細胞計數(shù) 細胞培養(yǎng)應(yīng)注意的問題 細胞活力的測定方法,細胞培養(yǎng)中應(yīng)注意的幾個問題,1）培養(yǎng)液和培養(yǎng)物的比例：一定濃度的培養(yǎng)液僅能支持一定數(shù)量的細胞生長，不能盲目增加每單位體積的細胞濃度。 2）pH：初培養(yǎng)pH應(yīng)為7.4，培養(yǎng)過程應(yīng)不低于7.0。 （耐酸不耐堿） 3）培養(yǎng)瓶內(nèi)的空間：一般培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)液與液面上的空間體積之比為1:10。,4）容積、深度、表面面積：培養(yǎng)液體積與表面面積的比例為0.20.5ml/cm2。需高濃度氧的，在淺的培養(yǎng)液（2mm）中生長較好；需要低濃度氧的。在深的培養(yǎng)液（5mm）中生長較好。 5）去除死細胞 6）溫度控制：動物細胞培養(yǎng)對溫度波動的敏感性很大。溫度低于36.5，細胞生長緩慢；溫度高于37.5，細胞存活力降低。,Section 3：細胞的基本培養(yǎng)技術(shù),培養(yǎng)操作的基本要領(lǐng)和要求 原代培養(yǎng)操作 傳代培養(yǎng)操作 細胞計數(shù) 細胞培養(yǎng)應(yīng)注意的問題 細胞活力的測定方法（P28）,細胞計數(shù)，血球計數(shù)板和電子細胞計數(shù)儀 生長曲線：（潛伏期，對數(shù)生長期，水平靜止期）由于細胞基數(shù)和生長進度不同，生長曲線不一致。 細胞分裂指數(shù)，分裂細胞占全部細胞的比例 細胞貼壁率=貼壁存活細胞/接種細胞*100% 細胞周期時間測定：用同位素標記，流式細胞儀測定細胞同期,Cell culture: Biologys new dimension,Role reversal: unlike in 2-D cultures, breast tumour cells in 3-D culture (left) that become malignant (centre) can be made to revert to their original state (right) when an antibod