基因功能分析的基本策略.ppt

第十二章,基因功能分析的基本策略,轉(zhuǎn)基因模型是研究基因功能的主要手段,轉(zhuǎn)基因生物： 外源基因?qū)肷矬w表達(dá)。 基因打靶： 外源基因替換內(nèi)源基因。 基因敲除。 基因敲入。 基因沉默： 導(dǎo)入特定基因，抑制內(nèi)源性基因表達(dá)。,第一節(jié) 轉(zhuǎn)基因技術(shù),轉(zhuǎn)基因技術(shù)(transgenic technology)：將外源基因?qū)爰?xì)胞，隨機(jī)整合到受體基因組內(nèi)，并隨細(xì)胞分裂而遺傳給后代。 細(xì)胞模型。 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。 轉(zhuǎn)基因植物。,一.轉(zhuǎn)基因生物的意義,20 世紀(jì) 80 年代 (Brinster and Palmiter)： 著名的轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)驗(yàn)，金屬硫蛋白基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)大鼠生長(zhǎng)激素基因表達(dá)。 轉(zhuǎn)基因生物的用途： 研究手段：疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。 改良動(dòng)物性狀：抗病性、耐寒性等。 生產(chǎn)產(chǎn)品：抗體、疫苗等的生產(chǎn)。,二、基本原理,構(gòu)建攜帶目的基因的載體。 外源基因?qū)耄簩⒛康幕蛲ㄟ^(guò)顯微注射等方法注入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的受精卵或著床前的胚胎細(xì)胞中。 使目的基因整合到基因組中。 將此受精卵或著床前的胚胎細(xì)胞再植入受體動(dòng)物的輸卵管或子宮中。 使其發(fā)育成攜帶外源基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。,基本原理,供體基因,受體的受精卵,基本原理,轉(zhuǎn)基因的受精卵,基本原理,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,基本過(guò)程,上游基因改造和載體構(gòu)建 中游基因轉(zhuǎn)移、胚胎移植與建系 下游基因整合、表達(dá)的檢測(cè)與細(xì)胞篩選,1. 上游基因改造和載體構(gòu)建,外源基因: 完整的轉(zhuǎn)錄單位, 由順式作用元件、結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)組成。 報(bào)告基因 (reporter gene) : 在表達(dá)載體中引入易于檢測(cè)的提示重組體存在的基因。GFP、 LacZ、AP、LUC。 融合基因 (fusion gene): 將特定的目的基因與報(bào)告基因拼接成融合基因，并與順式作用元件拼接成完整的轉(zhuǎn)錄單位。,動(dòng)物轉(zhuǎn)基因常用的載體,腺病毒載體 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 非病毒類載體：如質(zhì)粒等。,2. 中游基因轉(zhuǎn)移、胚胎移植與建系,基因?qū)爰夹g(shù)：物理、化學(xué)和生物學(xué)方法 1) 顯微注射法 （microinjection) 2) 胚胎干細(xì)胞法（embryonic stem cells, ES細(xì)胞） 3) 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法 4) 精子載體法,1) DNA顯微注射法,制備超量受精卵。 DNA 顯微注射。 轉(zhuǎn)移注射卵到輸卵管或子宮。 轉(zhuǎn)基因鼠的鑒定及鼠系建立。,DNA 顯微注射,持卵管,DNA注射針,精原核,卵原核,DNA 顯微注射,DNA 顯微注射到尚未發(fā)生核融合的受精卵的精原核。顯微鏡下觀察，精原核比卵原核大，容易辨別。 線性 DNA 整合效率比超螺旋 DNA 高出數(shù)倍，因而用于顯微注射的轉(zhuǎn)入基因通常是去除載體序列的線狀 DNA。,DNA 顯微注射法的特點(diǎn),DNA 大小無(wú)限制，最大可達(dá) 250Kb。 隨機(jī)整合：在染色體上整合的位點(diǎn)是隨機(jī)的，整合的拷貝數(shù)也不一定。 轉(zhuǎn)入的基因有可能碰巧整合到具有重要功能的基因之中，干擾該基因的正常表達(dá)，影響轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的正常發(fā)育和代謝。 總效率較低(實(shí)際成功率1/1000)。,提高顯微注射 DNA 表達(dá)的成功率,轉(zhuǎn)入的外源基因要能夠高效表達(dá)，最好是可以誘導(dǎo)表達(dá)。 轉(zhuǎn)入基因中應(yīng)該包含有幫助提高整合效率的序列，如微衛(wèi)星序列。,微衛(wèi)星序列,微衛(wèi)星序列,誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子,外源基因,2) 胚胎干細(xì)胞法,胚胎干細(xì)胞(embryo stem cells, ES 細(xì)胞)： 可人工培養(yǎng)增殖的小鼠胚泡發(fā)育期胚胎細(xì)胞，當(dāng)把這種胚胎細(xì)胞重新導(dǎo)入另一胚泡期的胚胎之后，它仍然保持著分化成其他類型細(xì)胞的能力。 ES 細(xì)胞具有與胚胎細(xì)胞相似的形態(tài)特征和分化特性。,胚胎干細(xì)胞法,分離和培養(yǎng) ES 細(xì)胞。 外源基因?qū)?ES 細(xì)胞。 導(dǎo)入外源基因的 ES 細(xì)胞的子宮轉(zhuǎn)移。 轉(zhuǎn)基因鼠的鑒定及鼠系建立。,胚胎干細(xì)胞的分離和培養(yǎng),胚泡,培養(yǎng)皿中分離胚泡內(nèi)層細(xì)胞,胰蛋白酶消化解離,加飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng),胚胎干細(xì)胞,胚胎干細(xì)胞的分離和培養(yǎng),胚胎干細(xì)胞外源 DNA 的導(dǎo)入,DNA 胚胎干細(xì)胞 囊胚 原囊胚 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,磷酸鈣-DNA 共沉淀法 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法 電穿孔法,微注射,外源 DNA 的整合,用于 ES 細(xì)胞的 DNA 載體一般帶有定點(diǎn)整合元件, 避免了隨機(jī)整合。 定點(diǎn)整合位點(diǎn)應(yīng)選擇在基因組內(nèi)編碼非必需產(chǎn)物的地方，以減少整合對(duì)細(xì)胞正常功能的影響。 定點(diǎn)整合位點(diǎn)必須在基因組的可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的地方。,胚胎干細(xì)胞法的特點(diǎn),定點(diǎn)整合。 ES 細(xì)胞在體外培養(yǎng)，外源 DNA 導(dǎo)入后可用正-負(fù)選擇法篩選擇正確整合的 ES 細(xì)胞, 相對(duì)較簡(jiǎn)單。 目前只在小鼠身上獲得成功。,3）逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建 獲得四/八細(xì)胞胚胎/囊胚/原腸胚 外源 DNA 導(dǎo)入早期胚胎： 獲得病毒顆粒感染早期胚胎 包裝細(xì)胞與早期胚胎共培養(yǎng) 感染后的胚胎植入受體動(dòng)物子宮，發(fā)育成攜帶外源基因的動(dòng)物。,逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法,外源基因,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,逆轉(zhuǎn)錄病毒感染,四/八細(xì)胞胚胎/囊胚/原腸胚,嵌合小鼠,純合體小鼠,逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法的特點(diǎn),通過(guò)病毒 DNA 插入宿主 DNA 的機(jī)制，將外源目的基因整合到宿主基因組，整合效率高。 反轉(zhuǎn)錄病毒載體容量有限，只能轉(zhuǎn)移小片段DNA(10kb)。 對(duì)家禽類的轉(zhuǎn)基因研究有重要意義。,4）精子載體法,外源 DNA 精子 卵細(xì)胞 受精卵 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,共育法 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法 電穿孔法,顯微注射,3. 下游基因整合與表達(dá)檢測(cè)及篩選,染色體基因水平：是否整合了外源基因以及整合的位點(diǎn)和拷貝數(shù)。 轉(zhuǎn)錄水平：轉(zhuǎn)基因的 mRNA 的存在與否以及表達(dá)水平。 蛋白水平：轉(zhuǎn)基因的蛋白質(zhì)的表達(dá)以及功能檢測(cè)。,鑒定方法,PCR Southern blot 染色體原位雜交 Northern blot RT-PCR Western blot,基因轉(zhuǎn)移鼠純合鼠系的建立,三、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用,分析動(dòng)物表型與外源基因的關(guān)系，揭示外源基因的功能。 建立人類疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。 基因產(chǎn)品的制備：乳腺、膀胱生物反應(yīng)器。,人類疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型,完整的動(dòng)物模型可以模擬人類疾病的起始和發(fā)展，幫助了解疾病的病因和發(fā)展過(guò)程。 為測(cè)試各種可能的治療方案提供一個(gè)統(tǒng)一有效的系統(tǒng)。 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型提供了人類疾病的研究手段。,人類疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型,各種人類遺傳病的鼠模型，如： 老年性癡呆癥(Alzheimersdisease)、 關(guān)節(jié)炎(arthritis)、 肌肉營(yíng)養(yǎng)缺乏癥(muscular distrophy)、 腫瘤發(fā)生(tumorigenesis)、 高血壓(hypertension)、 神經(jīng)退行性疾病(neurodegenenerative disorder)、 內(nèi)分泌功能障礙(endocrinological disfunction)、 動(dòng)脈硬化癥及其他很多疾病。,利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物反應(yīng)器：乳腺、膀胱、血液生物反應(yīng)器等。 抗凝血酶 III：轉(zhuǎn)基因綿羊的乳汁中。 乳球蛋白 紅細(xì)胞生成素 凝血因子 VIII 凝血因子 IX 生長(zhǎng)激素,轉(zhuǎn)基因改良移植器官,改造異種來(lái)源器官的遺傳性狀，使之適應(yīng)于人體器官或組織的移植。 1997 年起，利用遺傳改良的轉(zhuǎn)基因豬肝做為嚴(yán)重肝病患者的離體生命支持物。,動(dòng)物的克隆,1996 年，首次實(shí)現(xiàn)動(dòng)物的無(wú)性生殖。 由綿羊的乳腺細(xì)胞提供細(xì)胞核，卵細(xì)胞提供細(xì)胞質(zhì)發(fā)育而來(lái)。 核移植技術(shù)（Nuclear Transfer),核移植技術(shù)（Nuclear Transfer),第二節(jié) 基因打靶,基因打靶(Gene Targeting) ：通過(guò) DNA 定點(diǎn)同源重組，改變基因組中的某一特定基因，在生物活體內(nèi)研究此基因的功能。 基因敲除(gene knockout): 將某個(gè)基因定向去除。 基因敲入(gene knockin): 定向?qū)⒁欢位蛐蛄刑娲硪欢位蛐蛄小?一、基因打靶的基本程序,打靶載體的構(gòu)建。 打靶載體導(dǎo)入 ES 細(xì)胞及其鑒定。 基因敲除 ES 細(xì)胞注射入胚泡。 胚泡植入假孕小鼠的子宮。 嵌合體的雜交建立基因打靶的純合鼠系。,1. 打靶載體的構(gòu)建,同源基因片段,質(zhì)粒載體,HB1,HB2,neor基因,HSV-tk基因,2. 打靶載體導(dǎo)入ES細(xì)胞,磷酸鈣-DNA 共沉淀法 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法 電穿孔法 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法 顯微注射法,打靶載體的正-負(fù)選擇,與整合位點(diǎn)兩端區(qū)域同源的兩段 DNA 序列(HB1和HB2)。 目的基因。 編碼抗 G418 的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（neor基因）。 2個(gè)不同的胸苷激酶基因（HSV-tk1和HSV-tk2），分別來(lái)自I 型II型單純皰疹病毒。,打靶載體的正篩選,載體,載體,同源重組,neor,G418正篩選，細(xì)胞存活,染色體,染色體,打靶載體的負(fù)篩選,染色體,染色體,非特異性整合,GCV負(fù)篩選，細(xì)胞死亡,PCR 鑒定,在打靶載體的 HB1 和 HB2 之間，加上一個(gè)載體和鼠的基因組中都沒(méi)有的獨(dú)特DNA 序列（US）。 如發(fā)生隨機(jī)整合，PCR 無(wú)法擴(kuò)增出預(yù)期的DNA 片段。 如果整合于特定位點(diǎn)時(shí)，則 PCR 可以擴(kuò)增出預(yù)期大小的片段。,PCR 鑒定：特異整合,P2,P1,PCR反應(yīng)有特異條帶,特異整合,基因敲除小鼠的獲得,基因敲除ES細(xì)胞注射入胚泡 胚泡植入假孕小鼠的子宮 嵌合體的雜交育種：同源重組只發(fā)生在一條染色體上，因而同源重組后只能得到嵌合體，將嵌合體雜交，即可得到純合子。,基因敲除和 RNA 干擾,基因敲除是在基因水平將某個(gè)基因定點(diǎn)去除，動(dòng)物整體水平。 RNA 干擾不是敲除基因，而是誘導(dǎo) RNA 的特異性降解，干擾基因的表達(dá)。一般是在細(xì)胞水平。,第三節(jié) RNA 干擾,1990 年，Jorgense 等通過(guò) 轉(zhuǎn)基因改造牽?；伾?外源基因不但不能加深花的顏色，反而造成內(nèi)源基因表達(dá)的降低。,RNA 干擾是dsRNA 導(dǎo)致的基因沉默,1998 年，F(xiàn)ire 等在 C. elegans 中用 antisense RNA 抑制基因表達(dá)。 ds RNA 比 sense 或 antisense RNA 都好。 注射甚至口服 dsRNA 都能誘發(fā)基因沉默。 很少量的雙鏈 RNA 就能誘發(fā) C. elegans 整體的基因沉默，甚至能傳遞到子一代。 RNA 干擾：RNA interference (RNAi),RNAi 是真核生物中廣泛存在的現(xiàn)象,植物：干擾因素自葉脈向外擴(kuò)散，綠色熒光蛋白(GFP)基因 被抑制，顯露出紅色。,線蟲：左側(cè)為 GFP 轉(zhuǎn)基因線蟲；右側(cè)線蟲則經(jīng) GFP dsRNA 處理。部分細(xì)胞 RNAi 相關(guān)蛋白表達(dá)較低，仍有綠色熒光。,Hela 細(xì)胞：經(jīng) ORC6 siRNA 作用后，細(xì)胞出現(xiàn)多核現(xiàn)象。 綠色為 tubulin，紅色為 DNA。ORC6 細(xì)胞分裂調(diào)控蛋白。,果蠅：右側(cè)果蠅為野生型，左側(cè)為 shRNA 造成的色素缺乏的 缺陷型。,RNA 干擾,RNA 干擾：雙鏈 RNA 誘導(dǎo)的同源 mRNA 降解。 RNA 干擾技術(shù)可以用于基因敲除，選擇性關(guān)閉特定細(xì)胞基因。,siRNA 的產(chǎn)生,Dicer：RNase III 的一種，可降解 dsRNA 成 siRNA。 Short interfering RNA (siRNA)：2123nt,siRNA 誘導(dǎo)同源序列的降解,RNA-Induced Silencing Complex 產(chǎn)生兩種后果： 同源 mRNA 的降解。 同源 mRNA 翻譯受阻。,基因沉默的機(jī)制是多方面的,dsRNA 造成的 mRNA 降解。 Post-translational gene silencing dsRNA 造成同源性基因的甲基化和表達(dá)關(guān)閉。 dsRNA 造成染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化。 dsRNA 對(duì)蛋白質(zhì)的合成產(chǎn)生影響。,RNAi 和基因敲除,在基因組 DNA 上，通過(guò)同源重組進(jìn)行的基因敲除。 在 mRNA 水平進(jìn)行的基因敲除： Antisense oligonucleotides Ribozyme RNA interference：dsRNA；siRNA；shRNA,dsRNA 能夠誘發(fā)細(xì)胞的抗病毒反應(yīng),在哺乳動(dòng)物存在干擾素相關(guān)的抗病毒體系。 dsRNA 激活 dsRNA-dependent protein kinase(PKR)，進(jìn)一步誘導(dǎo)非序列依賴的內(nèi)源性 RNA 降解。 在胚胎期細(xì)胞，上述非特異的抗病毒體系尚未形成。通過(guò) dsRNA 可以誘導(dǎo)序列特異的 RNAi。,siRNA 與 shRNA, 30bp siRNA 可以誘導(dǎo) RNAi，并克服哺乳細(xì)胞的障礙。 Short hairpin RNA： (shRNA) 可達(dá)成穩(wěn)定的基因敲除。,shRNA 表達(dá)載體系統(tǒng),miRNA 表達(dá)載體系統(tǒng),siRNA 設(shè)計(jì)原則,siRNA antisense 鏈 5 端穩(wěn)定性較低時(shí)具有更好的效率。 必要時(shí)采用專業(yè)軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)。 采用多個(gè) siRNA 片段，并篩選其中最有效的。 有時(shí) siRNA 的干擾效果只表現(xiàn)在蛋白水平。 盡可能使用較低的 siRNA 濃度，以保證其特異性。 設(shè)立補(bǔ)救試驗(yàn)可進(jìn)一步確認(rèn) RNAi 與效果之間的關(guān)