發(fā)酵培養(yǎng)基及制備.ppt

第三章 發(fā)酵培養(yǎng)基及其制備,主要內(nèi)容,第一節(jié) 發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇 第二節(jié) 發(fā)酵培養(yǎng)基的設計與優(yōu)化 第三節(jié) 發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及來源 第四節(jié) 淀粉水解糖的制備 第五節(jié) 糖蜜原料 第六節(jié) 石油代糧發(fā)酵的原料 第七節(jié) 其他原料發(fā)酵,第一節(jié) 發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇,發(fā)酵培養(yǎng)基： 滿足菌體的生長、促進產(chǎn)物的形成 要符合增產(chǎn)節(jié)約、因地制宜 能否設計出一個好的發(fā)酵培養(yǎng)基，是一個發(fā)酵產(chǎn)品工業(yè)化成功中非常關(guān)鍵的一環(huán)。,孢子培養(yǎng)基,孢子培養(yǎng)基是供菌種繁殖孢子的一種常用固體培養(yǎng)基，對這種培養(yǎng)基的要求是能使菌體迅速生長，產(chǎn)生較多優(yōu)質(zhì)的孢子，并要求這種培養(yǎng)基不易引起菌種發(fā)生變異。 配制要求： 營養(yǎng)不要太豐富，否則不宜產(chǎn)孢子。 所用無機鹽的濃度要適量，不然也會孢子量和孢子顏色。 要注意培養(yǎng)基的pH和濕度。,種子培養(yǎng)基,種子培養(yǎng)基是供是供微生物菌體的生長繁殖。為了在較短的時間內(nèi)獲得數(shù)量較多的強壯的種子細胞，種子培養(yǎng)基要求營養(yǎng)豐富、完全，氮源、維生素的比例應較高，所用的原料也應是易于被微生物菌體吸收利用。 配制要求： 營養(yǎng)比較豐富和完全，總濃度略稀??； 成分接近于發(fā)酵培養(yǎng)基。,發(fā)酵培養(yǎng)基,發(fā)酵培養(yǎng)基是除需要維持微生物菌體的正常生長外，主要目的是合成預定的發(fā)酵產(chǎn)物，所以，發(fā)酵培養(yǎng)基碳源物質(zhì)的含量往往要高于種子培養(yǎng)基。 發(fā)酵培養(yǎng)基還應考慮便于發(fā)酵操作以及不影響產(chǎn)物的提取分離和產(chǎn)品的質(zhì)量。 要求： 發(fā)酵培養(yǎng)基的組成除有菌體生長所必需的元素和化合物外，還要有合成產(chǎn)物所需的特定元素、前體和促進劑等； 考慮培養(yǎng)基用分批補料工藝。,對發(fā)酵培養(yǎng)基進行科學的設計，包括兩個方面的內(nèi)容： 是對發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及原輔料材料的特性有較為詳細的了解； 是在此基礎上結(jié)合具體微生物和發(fā)酵產(chǎn)品的代謝特點及對培養(yǎng)基的成分進行合理的選擇和優(yōu)化。,一、發(fā)酵培養(yǎng)基選擇的依據(jù),根據(jù)微生物的特點選擇培養(yǎng)基 細菌、酵母菌、霉菌、放線菌四類 根據(jù)不同用途選擇培養(yǎng)基 液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基 根據(jù)生產(chǎn)實踐和科學試驗的不同要求選擇 根據(jù)經(jīng)濟效益分析選擇培養(yǎng)基 價廉、來源豐富、運輸方便、就地取材、無毒,二、發(fā)酵培養(yǎng)基成分選擇的原則,不同的微生物所需要的培養(yǎng)基成分是不同的，要確定一個合適的培養(yǎng)基，就需要了解生產(chǎn)根據(jù)不同生產(chǎn)菌種的培養(yǎng)條件、生物合成的代謝途徑、代謝產(chǎn)物的化學性質(zhì)等確定培養(yǎng)基。,1菌體的同化能力,微生物來源和種類的不同，所能分泌的水解酶系。 酵母菌只能利用簡單的糖類 ：中國酒曲中含有豐富的淀粉酶和糖化酶，國外利用麥芽含有豐富的淀粉水解酶類。 許多碳源和氮源都是復雜的有機大分子，如豆餅粉、黃豆餅粉等。,1菌體的同化能力,微生物利用氮源的能力因菌種、菌齡的不同而有差異。 同一微生物處于生長不同階段時，對氮源的利用能力不同，在生長早期容易利用易同化的銨鹽和氨基氮，在生長中期則由于細胞的代謝酶系已經(jīng)形成，則利用蛋白質(zhì)的能力增強。因此在培養(yǎng)基中有機氮源和無機氮源應當混合使用。,2代謝物的阻遏和誘導作用,對于快速利用的碳源如葡萄糖來講，當菌體利用葡萄糖時產(chǎn)生的分解代謝產(chǎn)物會阻遏或抑制某些產(chǎn)物合成所需酶系的形成或酶的活性，即發(fā)生“葡萄糖效應”。 抗生素發(fā)酵生產(chǎn)時，考慮分批補料或連續(xù)補料的方式來解除。 酶制劑生產(chǎn)，難被利用的碳源(如淀粉、糊精等)有利于產(chǎn)酶，幾乎都選用淀粉類原料作為碳源。,2代謝物的阻遏和誘導作用,有些產(chǎn)物會受氮源的誘導與阻遏 蛋白酶的生產(chǎn)受培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)或多肽的誘導，而受銨鹽、硝酸鹽、氨基氮的阻遏。這時在培養(yǎng)基氮源選取時應考慮以有機氮源(蛋白質(zhì)類)為主。 在選擇和配制發(fā)酵培養(yǎng)基時，要注意快速利用的碳(氮)源和慢速利用的碳(氮)源的相互配合，發(fā)揮各自優(yōu)勢，避其所短。,3合適的碳氮比,培養(yǎng)基中的碳氮的比例（C/N）在發(fā)酵工業(yè)中尤為重要。 氮源過多，則菌體繁殖旺盛，pH偏高，不利于代謝產(chǎn)物的積累；氮源不足，則菌體繁殖量少，從而影響產(chǎn)量。 碳源過多，則容易形成較低的pH；碳源不足，菌體衰老和自溶。 碳氮比不當還會影響菌體按比例吸收營養(yǎng)物質(zhì)，直接影響菌體生長和產(chǎn)物的形成，菌體在不同生長階段，對其碳氮比的最適要求也不一樣。,3合適的碳氮比,酵母細胞中碳氮比約為100：20， 霉菌約為100：10。 一般發(fā)酵工業(yè)中碳氮比約為l00：（0.2-2.0) 。 氨基酸發(fā)酵中，因為產(chǎn)物中含有氮，所以碳氮比就相對高一些。如谷氨酸發(fā)酵的C：N為100：(1521)，若碳氮比為100：(0.22.0)，則會出現(xiàn)只長菌體，幾乎不產(chǎn)谷氨酸的現(xiàn)象。,理論+經(jīng)驗 根據(jù)前人的經(jīng)驗和培養(yǎng)基成分確定時一些必須考慮的問題，初步確定可能的培養(yǎng)基成分； 通過單因子實驗最終確定出最為適宜的培養(yǎng)基成分； 采用合理的實驗設計方法優(yōu)化配方。 正交實驗設計，方差分析 響應面法設計及分析,單因子實驗,碳源的選擇 氮源的選擇 誘導劑及前體的選擇 無機鹽的選擇,對于單因素或兩因素試驗，因其因素少 ，試驗的設計 、實施與分析都比較簡單 。但在實際工作中 ，常常需要同時考察 3個或3個以上的試驗因素 ，若進行全面試驗 ，則試驗的規(guī)模將很大 ，往往因試驗條件的限制而難于實施 。正交試驗設計就是安排多因素試驗 、尋求最優(yōu)水平組合 的一種高效率試驗設計方法。,正交試驗設計的概念及原理,例如，要考察增稠劑用量、pH值和殺菌溫度對豆奶穩(wěn)定性的影響。每個因素設置3個水平進行試驗 。 A因素是增稠劑用量，設A1、A2、A3 3個水平；B因素是pH值，設B1、B2、B3 3個水平；C因素為殺菌溫度，設C1、C2、C3 3個水平。這是一個3因素3水平的試驗，各因素的水平之間全部可能組合有?種 。,3因素3水平的全面試驗水平組合數(shù)為33=27，4因素3水平的全面試驗水平組合數(shù)為34=81 ，5因素3水平的全面試驗水平組合數(shù)為35=243，這在科學試驗中是有可能做不到的。,1.1 正交試驗設計的基本概念 正交試驗設計是利用正交表來安排與分析多因素試驗的一種設計方法。它是由試驗因素的全部水平組合中，挑選部分有代表性的水平組合進行試驗的，通過對這部分試驗結(jié)果的分析了解全面試驗的情況，找出最優(yōu)的水平組合。,(1)A1B1C1 (2)A2B1C2 (3)A3B1C3 (4)A1B2C2 (5)A2B2C3 (6)A3B2C1 (7)A1B3C3 (8)A2B3C1 (9)A3B3C2,A3,A2,A1,B3,C3,這9個試驗點在選優(yōu)區(qū)中分布是均衡的，在立方體的每個平面上 ，都恰是3個試驗點；在立方體的每條線上也恰有一個試驗點。 9個試驗點均衡地分布于整個立方體內(nèi)，有很強的代表性， 能夠比較全面地反映選優(yōu)區(qū)內(nèi)的基本情況。,正交表 由于正交設計安排試驗和分析試驗結(jié)果都要用正交表，因此，我們先對正交表作一介紹。,其中“L”代表正交表；L右下角的數(shù)字“8”表示有8行 ，用這張正交表安排試驗包含8個處理(水平組合) ；括號內(nèi)的底數(shù)“2” 表示因素的水平數(shù)，括號內(nèi)2的指數(shù)“7”表示有7列 ，用這張正交表最多可以安排7個2水平因素。,L9(34)正交表,D,正交試驗設計的基本程序,對于多因素試驗，正交試驗設計是簡單常用的一種試驗設計方法，正交試驗設計的基本程序包括試驗方案設計及試驗結(jié)果分析兩部分。,試驗目的與要求,試驗指標,選因素、定水平,因素、水平確定,選擇合適正交表,表頭設計,列試驗方案,試驗方案設計：,試驗結(jié)果分析,進行試驗，記錄試驗結(jié)果,試驗結(jié)果極差分析,計算K值,計算k值,計算極差R,繪制因素指標趨勢圖,優(yōu)水平,因素主次順序,優(yōu)組合,結(jié) 論,試驗結(jié)果分析：,試驗結(jié)果方差分析,列方差分析表，進行F 檢驗,計算各列偏差平方和、自由度,分析檢驗結(jié)果，寫出結(jié)論,實例：為提高山楂原料的利用率，研究酶法液化工藝制造山楂原汁，擬通過正交試驗來尋找酶法液化的最佳工藝條件。,2.1 試驗方案設計,試驗設計前必須明確試驗目的，即本次試驗要解決什么問題。試驗目的確定后，對試驗結(jié)果如何衡量，即需要確定出試驗指標。試驗指標可為定量指標，如強度、硬度、產(chǎn)量、出品率、成本等；也可為定性指標如顏色、口感、光澤等。一般為了便于試驗結(jié)果的分析，定性指標可按相關(guān)的標準打分或模糊數(shù)學處理進行數(shù)量化，將定性指標定量化。,（1） 明確試驗目的，確定試驗指標,對本試驗而言，試驗目的是為了提高山楂原料的利用率。所以可以以液化率液化率=(果肉重量-液化后殘渣重量)/果肉重量100%為試驗指標，來評價液化工藝條件的好壞。液化率越高，山楂原料利用率就越高。,根據(jù)專業(yè)知識、以往的研究結(jié)論和經(jīng)驗，從影響試驗指標的諸多因素中，通過因果分析篩選出需要考察的試驗因素。一般確定試驗因素時，應以對試驗指標影響大的因素、尚未考察過的因素、尚未完全掌握其規(guī)律的因素為先。 試驗因素選定后，根據(jù)所掌握的信息資料和相關(guān)知識，確定每個因素的水平，一般以2-4個水平為宜。對主要考察的試驗因素，可以多取水平，但不宜過多（6），否則試驗次數(shù)驟增。因素的水平間距，應根據(jù)專業(yè)知識和已有的資料，盡可能把水平值取在理想?yún)^(qū)域。,（2） 選因素、定水平，列因素水平表,對本試驗分析，影響山楂液化率的因素很多，如山楂品種、山楂果肉的破碎度、果肉加水量、原料pH 值、果膠酶種類、加酶量、酶解溫度、酶解時間等等。經(jīng)全面考慮，最后確定果肉加水量、加酶量、酶解溫度和酶解時間為本試驗的試驗因素，分別記作A、B、C和D，進行四因素正交試驗，各因素均取三個水平，因素水平表見表所示。,因素水平表,Kjm，kjm,計算簡便，直觀，簡單易懂，是正交試驗結(jié)果分析最常用方法。,正交試驗的結(jié)果分析,直觀分析法極差分析法,極差分析法R法,1. 計算,2. 判斷,Rj,因素主次,優(yōu)水平,優(yōu)組合,Kjm為第j列因素m水平所對應的試驗指標和，kjm為Kjm平均值。由kjm大小可以判斷第j列因素優(yōu)水平和優(yōu)組合。,Rj為第j列因素的極差，反映了第j列因素水平波動時，試驗指標的變動幅度。Rj越大，說明該因素對試驗指標的影響越大。根據(jù)Rj大小，可以判斷因素的主次順序。,（1） 確定試驗因素的優(yōu)水平和最優(yōu)水平組合,分析A因素各水平對試驗指標的影響。由表3可以看出，A1的影響反映在第1、2、3號試驗中，A2的影響反映在第4、5、6號試驗中，A3的影響反映在第7、8、9號試驗中。 A因素的1水平所對應的試驗指標之和為KA1=y1+y2+y3=0+17+24=41，kA1= KA1/3=13.7； A因素的2水平所對應的試驗指標之和為KA2=y4+y5+y6=12+47+28=87，kA2=KA2/3=29； A因素的3水平所對應的試驗指標之和為KA3=y7+y8+y9=1+18+42=61，kA3=KA3/3=20.3。,不考察交互作用的試驗結(jié)果分析,根據(jù)正交設計的特性，對A1、A2、A3來說，三組試驗的試驗條件是完全一樣的（綜合可比性），可進行直接比較。如果因素A對試驗指標無影響時，那么kA1、kA2、kA3應該相等，但由上面的計算可見，kA1、kA2、kA3實際上不相等。說明，A因素的水平變動對試驗結(jié)果有影響。因此，根據(jù)kA1、kA2、kA3的大小可以判斷A1、A2、A3對試驗指標的影響大小。由于試驗指標為液化率，而kA2kA3kA1，所以可斷定A2為A因素的優(yōu)水平。,同理，可以計算并確定B3、C3、D1分別為B、C、D因素的優(yōu)水平。四個因素的優(yōu)水平組合A2B3C3D1為本試驗的最優(yōu)水平組合，即酶法液化生產(chǎn)山楂清汁的最優(yōu)工藝條件為加水量50mL/100g，加酶量7mL/100g，酶解溫度為50,酶解時間為1.5h。,根據(jù)極差Rj的大小，可以判斷各因素對試驗指標的影響主次。,（2） 確定因素的主次順序,以各因素水平為橫坐標，試驗指標的平均值（kjm）為縱坐標，繪制因素與指標趨勢圖。由因素與指標趨勢圖可以更直觀地看出試驗指標隨著因素水平的變化而變化的趨勢，可為進一步試驗指明方向。,（3） 繪制因素與指標趨勢圖,試驗結(jié)果分析,加酶,加水,溫度,時間,第三節(jié) 發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及來源,1、工業(yè)常用的碳源,葡萄糖、糖蜜、淀粉、糊精、油和脂肪、有機酸。,2、工業(yè)常用的氮源,有機氮源、無機氮源,生理酸堿性物質(zhì)：無機氮源經(jīng)微生物生理作用 （代謝）后能形成酸堿性物質(zhì),3、 無機鹽及微量元素,低濃度對微生物生長和產(chǎn)物合成有促進作用， 在高濃度時常表現(xiàn)出明顯的抑制作用。 生產(chǎn)中要通過試驗預先了解菌種對無機鹽和微量元素的 最適需求量，以穩(wěn)定或提高產(chǎn)量。,4、生長因子、前體物質(zhì)、產(chǎn)物抑制劑和促進劑,發(fā)酵培養(yǎng)基中某些成分的加入有助于調(diào)節(jié)產(chǎn)物的形成， 而并不促進微生物的生長，,一、碳源,1、作用,提供微生物菌種的生長繁殖所需的能源和合成菌體所必需的碳成分,提供合成目的產(chǎn)物所必須的碳成分,2、來源,糖類、油脂、有機酸、正烷烴,3、工業(yè)上常用的糖類, 葡萄糖,所有的微生物都能利用葡萄糖 但是會引起葡萄糖效應,工業(yè)上常用淀粉水解糖,但是糖液必須達到一定的質(zhì) 量指標,不同的制糖工藝生產(chǎn)的糖液質(zhì)量差別很大, 糖蜜,糖蜜是制糖生產(chǎn)時的結(jié)晶母液，它是制糖工業(yè)的副產(chǎn)物。,糖蜜主要含有蔗糖，總糖可達50%75%。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜。,不用加工方法對甘蔗糖蜜的影響,糖蜜使用的注意點：,除糖份外，含有較多的雜質(zhì)，其中有些是有用的，但是許多都會對發(fā)酵產(chǎn)生不利的影響，需要進行預處理。,例：谷氨酸發(fā)酵,有害物資：膠體成分（起泡、結(jié)晶）、鈣鹽（結(jié)晶） 生物素（發(fā)酵控制）,預處理：澄清脫鈣脫除生物素,例：檸檬酸發(fā)酵,有害物質(zhì)：鐵離子含量高（導致異檸檬酸的生成）,預處理：黃血鹽, 淀粉、糊精,使用條件：微生物必須能分泌水解淀粉、糊精的酶類,缺點：難利用、 發(fā)酵液比較稠、一般2.0%時加入一定的-淀粉酶 成分比較復雜，有直鏈淀粉和支鏈淀粉等等。,優(yōu)點：來源廣泛、價格底 難利用，可以解除葡萄糖效應,例：地衣牙孢桿菌生產(chǎn)-淀粉酶,碳源對生長和產(chǎn)酶的影響,碳源 細胞量 -淀粉酶 葡萄糖 4.2 0 蔗糖 4.02 0 糊精 3.06 38.2 淀粉 3.09 40.2,李江華，無錫輕工大學學報，2004,(1.5g麩皮),嗜堿芽胞桿菌(AC-2)中碳源對堿性纖維素酶分泌的影響,結(jié)果：各種碳源相差不大,推論：該菌種的堿性纖維素酶為組成型,蘇勤，林業(yè)化學與工業(yè)，2004,二、氮源,氮源主要用于構(gòu)成菌體細胞物質(zhì)（氨基酸，蛋白質(zhì)、核酸等）和含氮代謝物。常用的氮源可分為兩大類：有機氮源和無機氮源。,1、無機氮源,種類：氨鹽、硝酸鹽和氨水,特點：微生物對它們的吸收快，所以也稱之謂迅速利用的氮源。但無機氮源的迅速利用常會引起pH的變化如： (NH4)2SO4 2NH3 + 2H2SO4 NaNO3 + 4H2 NH3 + 2H2O + NaOH,無機氮源被菌體作為氮源利用后，培養(yǎng)液中就留下了酸性或堿性物質(zhì)，這種經(jīng)微生物生理作用（代謝）后能形成酸性物質(zhì)的無機氮源叫生理酸性物質(zhì)，如硫酸胺，若菌體代謝后能產(chǎn)生堿性物質(zhì)的則此種無機氮源稱為生理堿性物質(zhì)，如硝酸鈉。正確使用生理酸堿性物質(zhì)，對穩(wěn)定和調(diào)節(jié)發(fā)酵過程的pH有積極作用。,所以選擇合適的無機氮源有兩層意義： 滿足菌體生長 穩(wěn)定和調(diào)節(jié)發(fā)酵過程中的pH,毛霉產(chǎn)蛋白酶的研究,陳濤，中國釀造，2004,初始pH的影響:,pH偏酸比較好，中性蛋白酶影響大,無機氮源的影響：,硫酸銨硝酸銨硝酸鈉尿素,2、有機氮源,來源：工業(yè)上常用的有機氮源都是一些廉價的原料，花生餅 粉、黃豆餅粉、棉子餅粉、玉米漿、玉米蛋白粉、蛋 白胨、酵母粉、魚粉、蠶蛹粉、尿素、廢菌絲體和酒 糟。,成分復雜：除提供氮源外，有些有機氮源還提供大量的無機 鹽及生長因子。,例 玉米漿： 可溶性蛋白、生長因子（生物素）、苯乙酸 較多的乳酸 硫、磷、微量元素等,有機氮源成分復雜可以從多個方面對發(fā)酵過程進行影響，而另一方面有機氮源的來源具有不穩(wěn)定性。所以在有機氮源選取時和使用過程中，必須考慮原料的波動對發(fā)酵的影響,氮源使用的一些相關(guān)問題：,有機氮源和無機氮源應當混合使用,早期：容易利用易同化的氮源無機氮源 中期：菌體的代謝酶系已形成、則利用蛋白質(zhì),有些產(chǎn)物會受氮源的誘導和阻遏,例： 蛋白酶的生產(chǎn),有機氮源選取時也要考慮微生物的同化能力,開發(fā)效果好、有針對性的有機氮源仍然是令人感興趣 的課題,三、無機鹽的微量元素,1、作用：各種不一樣,2、來源：C、N源，以鹽的形式補充,3、用量：根據(jù)具體的產(chǎn)品，以實驗決定,4、使用注意點,A. 對于其它渠道有可能帶入的過多的某種無機離子和 微量元素在發(fā)酵過程中必須加以考慮,例：鐵離子 青霉素發(fā)酵中，鐵離子的濃度要小于20g/ml 發(fā)酵罐必須進行表面處理,B、使用時注意鹽的形式（pH的變化）,例：黑曲酶NRRL-330,生產(chǎn)-淀粉酶，P對酶活的影響 pH 酶活 不加 4.25 120分鐘 加 K2HPO