本科及碩士生化實(shí)驗(yàn)考核試卷(總).docx

分光光度法 利用物質(zhì)對(duì)某種波長(zhǎng)的光具有選擇性吸收的特性建立起來(lái)的鑒別物質(zhì)或測(cè)量其含量的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線 通過(guò)測(cè)定一系列已知組分的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的某種理化性質(zhì)，通過(guò)作圖，得到的數(shù)值曲線百分吸光系數(shù) 一定波長(zhǎng)下，當(dāng)C以g/100ml表示時(shí)，溶液濃度為1g/100ml且光程為1cm時(shí)所測(cè)的吸光度摩爾消光系數(shù) 一定波長(zhǎng)下，當(dāng)C以mol/L表示時(shí)，溶液濃度為1mol/L 且光程為1cm時(shí)所測(cè)的吸光度空白管 用與樣品相同的一切試劑但不含待測(cè)物質(zhì)制成的用以消除被比色容器，溶劑以及其他試劑吸收單色光所造成的誤差的對(duì)照組雙縮脲反應(yīng) 雙縮脲在堿性溶液中與CuSO4反應(yīng)生成紫紅色化合物比活性 單位重量的蛋白質(zhì)樣品中所含的酶活性單位酶活性單位 37C保溫15分鐘產(chǎn)生1ug酚為一個(gè)酶單位米氏常數(shù)（Km） 酶的特征性常數(shù)，可近視的表示酶對(duì)底物的親和力，為反應(yīng)速率等于1/2Vmax時(shí)的底物濃度遷移率 帶電顆粒在單位電場(chǎng)強(qiáng)度下的泳動(dòng)速度電泳 帶電顆粒在電場(chǎng)的作用下向著與其電性相反的電極方向移動(dòng)電滲 在電場(chǎng)作用下,液體相對(duì)于固相支持物會(huì)發(fā)生相對(duì)位 移的現(xiàn)象凝膠層析 混合物隨流動(dòng)相流經(jīng)固定相的凝膠層析柱時(shí)，混合物中各物質(zhì)因分子量大小不同而被分離層析 利用各組分物理性質(zhì)的不同，將多組分混合物進(jìn)行分離及測(cè)定的方法分配系數(shù)(Kd) 衡量溶質(zhì)分子被阻滯程度的特征性常數(shù)。Kd=（VeVo）/Vo聚丙烯酰胺凝膠濃度（T） 交聯(lián)劑克數(shù)占單體與交聯(lián)劑總克數(shù)的百分?jǐn)?shù)聚丙烯酰胺凝膠交聯(lián)度（C） 100ml凝膠溶液中單體與交聯(lián)劑的總克數(shù)內(nèi)水體積（Vi）層析柱中溶脹凝膠顆粒內(nèi)部所含水相的總體積外水體積（Vo）層析柱中溶脹凝膠顆粒間隙中液體所占體積 即 空隙的總體積洗脫體積（Ve）被分離物質(zhì)通過(guò)層析柱完全被洗脫出來(lái)所需要的洗脫液的體積分子篩 凝膠顆粒是一類(lèi)具有三維空間多孔性網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，不帶電荷，起到濾過(guò)或“篩”的作用等電點(diǎn) 蛋白質(zhì)溶液處于某一PH時(shí)，蛋白質(zhì)解離成正負(fù)離子的趨勢(shì)相等，成為兼性離子，此時(shí)溶液的PH值為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)印跡術(shù) 將各種生物大分子從凝膠轉(zhuǎn)移到一種固定基質(zhì)上的過(guò)程血糖 血中葡萄糖濃度 3.896.11mmol/L限制性內(nèi)切酶 可以識(shí)別DNA的特異序列，并在識(shí)別位點(diǎn)或其周?chē)懈铍p鏈DNA的一類(lèi)內(nèi)切酶感受態(tài)細(xì)胞 受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)特殊處理，細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，成為能允許載有外源性DNA的載體分子通過(guò)的感受態(tài)細(xì)胞重組子 含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)化 受體菌直接攝取供體菌游離的DNA獲得新的遺傳性狀的過(guò)程轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)導(dǎo) 以噬菌體為媒介，將供體菌DNA片段轉(zhuǎn)移到受體菌內(nèi)，使受體菌獲得新的遺傳性狀逆轉(zhuǎn)錄 以RNA為模板，由逆轉(zhuǎn)錄酶催化四種脫氧核糖核苷酸聚合產(chǎn)生DNA的過(guò)程PCR 在模版DNA，引物和四種脫氧核糖核苷酸存在的條件下，依賴DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)堿裂解法 NaOH可溶解細(xì)胞，變性DNA與RNA，基于該特性提取質(zhì)粒DNA的方法質(zhì)粒DNA 獨(dú)立于宿主細(xì)胞染色體外，能自我復(fù)制，穩(wěn)定遺傳的雙鏈環(huán)狀DNA瓊脂糖凝膠電泳 支持物為瓊脂或瓊脂糖的電泳技術(shù)，線性DNA在電場(chǎng)中的遷移率與相對(duì)分子質(zhì)量成正比，相對(duì)分子質(zhì)量越大，受到摩擦力越大，遷移速度越慢。1、簡(jiǎn)述在DNA和RNA分離與鑒定實(shí)驗(yàn)中，0.14molL NaCl、檸檬酸鈉、5%SDS、氯仿、異戊醇、95%冷乙醇的主要作用。（5分）0.14molL NaCl：利用溶解度差異分離核糖核蛋白、脫氧核糖核蛋白（核糖核蛋白在0.14molL NaCl中溶解度高、脫氧核糖核蛋白溶解度低）檸檬酸鈉：抑制脫氧核糖核酸酶對(duì)DNA的水解5%SDS：使脫氧核糖核蛋白解聚，DNA和核蛋白分離氯仿：利用溶解度差異分離DNA和蛋白質(zhì)（蛋白質(zhì)在其中沉淀，DNA則溶于水相）異戊醇：減少泡沫產(chǎn)生，有助于于分相95%冷乙醇：將DNA析出2、采用兩種方法對(duì)待測(cè)-球蛋白溶液進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析。BCA法：標(biāo)準(zhǔn)管為50ml牛血清白蛋白（1.8mg/ml）50ml水2ml BCA工作液，A=0.250測(cè)定管為100ml-球蛋白溶液2ml BCA工作液，A0.300紫外分光光度法：標(biāo)準(zhǔn)管為2ml牛血清白蛋白（1.8mg/ml）2ml生理鹽水，A0.300 測(cè)定管為2ml-球蛋白溶液2ml生理鹽水，A0.450 分別計(jì)算兩種方法測(cè)得的-球蛋白溶液的濃度。（3分）C1s=1.8mg/ml A1s=0.250 V1s=50mlC1x= ？ A1x=0.300 V1x=100ml帶入公式，自己注意哪個(gè)對(duì)應(yīng)哪個(gè)？(2) 這兩種蛋白質(zhì)定量方法在對(duì)同一管樣品定量時(shí)，結(jié)果有很大的差別。判斷哪一種定量方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確，說(shuō)明判斷依據(jù)。（2分） BCA法更準(zhǔn)確紫外分光光度法受其他因素干擾比較大（如核酸），精度差利用的是共軛雙鍵對(duì)紫外光的吸收，酪氨酸、色氨酸均能吸收，不同蛋白質(zhì)這兩種氨基酸的含量差別大，因此缺乏特異性1、簡(jiǎn)述標(biāo)準(zhǔn)曲線的作用及繪制要點(diǎn)。（看大家整理好的那份）作用：1、利用濃度-光密度的直線特性，判斷采用方法是否符合Lambert-Beer定律2、做多次平行測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線，可判斷測(cè)定過(guò)程中操作、儀器等誤差的大小，從而確定該測(cè)定方法的可靠性3、從繪制曲線的斜率可以比較各種方法的靈敏度4、大批量樣品分析是時(shí)，可以省略多次計(jì)算，直接查閱標(biāo)準(zhǔn)曲線要點(diǎn)：2. 簡(jiǎn)述SDS-PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的原理。（4分）1、 電泳時(shí)，當(dāng)外界條件不變（如電場(chǎng)、電解液等），蛋白質(zhì)遷移率主要取決于蛋白質(zhì)的物理性狀2、 SDS能破壞蛋白質(zhì)分子間的非共價(jià)鍵，使蛋白質(zhì)變性解離，從而降低和消除各種蛋白質(zhì)間的天然電荷差異3、SDS-PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)分子量時(shí)，電場(chǎng)強(qiáng)度保持相同情況下，蛋白質(zhì)遷移率取決于分子量的大小，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)相對(duì)分子量在一定范圍內(nèi)時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)呈直線關(guān)系，符合LogMW=K-bm（LogMW：相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)；K常數(shù)；b斜率；m遷移率）4、可將一致相對(duì)分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)作圖，獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未至蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳根據(jù)遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得相對(duì)分子質(zhì)量。3. 取2ml肝勻漿(1g肝/2ml勻漿)分離DNA和RNA，（1）得到的純化DNA沉淀，加0.01M NaOH 2.0ml溶解，從中取0.1ml+2.9ml0.01M NaOH稀釋?zhuān)米贤夥止夤舛确y(cè)得A260=0.460,A2800.240,鑒定純度，計(jì)算DNA濃度(g/L)和每克肝組織中提取的DNA量（g/g）。已知K(p)DNA=0.02ml/(gcm)（2）得到的RNA沉淀加蒸餾水2ml溶解，從中取0.1ml+3.9ml蒸餾水稀釋?zhuān)米贤夥止夤舛确y(cè)得A260=0.241,A280=0.139,鑒定純度，計(jì)算RNA濃度(g/L)和每克肝組織中提取的RNA量（g/g）。已知K(p)RNA=0.025ml/(gcm)。（5分）（有點(diǎn)超綱）DNA=A260 *50 * n/1000（ug/ul）RNA=A260*40*n/1000（ug/ul） n為稀釋倍數(shù)1. 試述從兔子肝臟中分離DNA的原理。（5分）（看課本79）1、利用核糖核蛋白在0.14molL NaCl溶解度高，脫氧核糖核蛋白溶解度低，可將核糖核蛋白和脫氧核糖核蛋白二者分開(kāi)來(lái)。2. 簡(jiǎn)述影響蛋白質(zhì)電泳的因素。（5分）（課本34頁(yè)）1、帶電顆粒的物理性狀（帶電顆粒電荷數(shù)、顆粒大小、形狀、空間構(gòu)型）2、支持物的介質(zhì)（吸附作用、電滲作用、分子篩）3、緩沖溶液（PH、離子強(qiáng)度）4、電場(chǎng)強(qiáng)度3在雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)，將2.0ml待測(cè)血清加生理鹽水8.0ml稀釋成待測(cè)樣本，然后按下表操作： 空白管 標(biāo)準(zhǔn)管 待測(cè)管蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液（ml） / 0.6 /生理鹽水（ml） 1.0 0.4 /待測(cè)樣本（ml） / / 1.0 雙縮脲試劑（ml） 4.0 4.0 4.0顯色后540nm波長(zhǎng)比色，ODs0.382，ODx0.426，已知蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液濃度為20 mg/ml ，試求待測(cè)血清的蛋白質(zhì)濃度（g/L）。（4分）Cs=20mg/ml As=0.382 Vs= 0.6 mlCx= ？ Ax=0.426 Vx=1ml記得這題（將2.0ml待測(cè)血清加生理鹽水8.0ml）稀釋了5倍，記得乘回來(lái)1. 簡(jiǎn)述分光光度法原理。（5分）原理：利用不同物質(zhì)對(duì)某個(gè)波長(zhǎng)的光具有選擇性吸收的特性和Lambert-beer定律:A=Ecl,其中，E為消光系數(shù)（在一定溫度下，對(duì)同一物質(zhì)和一定波長(zhǎng)的入射光而言，為常數(shù)）c為待測(cè)物質(zhì)濃度，l為光束透過(guò)溶液的距離，可以通過(guò)待測(cè)物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)對(duì)其鑒定，或利用待測(cè)物質(zhì)在某波長(zhǎng)下的吸光度得到其濃度。須注意的是，吸光度A或光密度OD或消光度E=-lgT.其中T為透光度。單色光透過(guò)溶液時(shí)，除了被待測(cè)物質(zhì)，也被比色容器與試劑溶劑吸收，所以必須使用含有與樣本相同的一切試劑但不含待測(cè)物質(zhì)的空白管來(lái)消除此影響。 3. 用紫外分光光度法測(cè)定牛血清白蛋白含量時(shí)，準(zhǔn)確吸取牛血清0.1ml，加生理鹽水9.9ml。稀釋成待測(cè)樣本，在280nm和260nm兩處波長(zhǎng)分別測(cè)得光密度值，A2800.454，A260=0.250,求牛血清白蛋白濃度（g/L）。已知牛血清白蛋白百分吸光系數(shù)6.3（100ml/(gcm)）。（4分）OD280/OD2601.5,樣本蛋白質(zhì)含量（mg/ml）=OD280/k*10（k=）記得這道題有稀釋100倍（吸取牛血清0.1ml，加生理鹽水9.9ml）答案：72mg/ml1. 簡(jiǎn)述分光光度法的波長(zhǎng)選擇的原則。（5分）（看書(shū)本第9頁(yè)）2. 簡(jiǎn)述雙縮脲法和紫外法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的原理及優(yōu)缺點(diǎn)。（5分）紫外：蛋白質(zhì)分子中有含共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸，可以吸收紫外光，吸收峰在280nm處，且再此波長(zhǎng)內(nèi)吸收峰的光密度值與其濃度成正比關(guān)系，故可作為蛋白質(zhì)定量測(cè)定的依據(jù)。優(yōu)缺點(diǎn)：1、操作簡(jiǎn)單快速、樣品稀釋后倒入比色杯即可，2、樣品不損失，測(cè)定后可回收，多用于純化蛋白質(zhì)的微量測(cè)定。但，精確度差，核酸等其他物質(zhì)在同一紫外區(qū)也有吸收且不同蛋白質(zhì)中芳香族氨基酸的含量變動(dòng)大。故，若要或者較為準(zhǔn)確數(shù)值，需測(cè)OD260OD280后根據(jù)經(jīng)驗(yàn)公式調(diào)整或有待測(cè)蛋白質(zhì)的純品做比較或知其消光系數(shù)。雙縮脲法： 雙縮脲在堿性溶液中與硫酸銅反應(yīng)生成紫紅色化合物，而蛋白質(zhì)分子中含有許多肽鍵在堿性溶液中也能與Cu2+反應(yīng)生成紫紅色化合物。在一定范圍內(nèi)，其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比。故可測(cè)定蛋白質(zhì)濃度優(yōu)缺點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，迅速，受蛋白質(zhì)種類(lèi)性質(zhì)影響較小，但，靈敏度不高，特異性不高，除肽鍵外，其余基團(tuán)也可反應(yīng) 3在凝交通透層析（葡聚糖G50）中，藍(lán)葡聚糖2000洗脫體積為8.2ml，細(xì)胞色素C的洗脫體積為14ml，DNFP甘氨酸的洗脫體積為18.2ml,試計(jì)算該層析柱的內(nèi)、外水體積及細(xì)胞色素C的分配系數(shù)。（4分）看一下分析化學(xué)1、 加水：隔絕空氣的氧，使膠面平整2、 甘氨酸：氯離子電泳時(shí)移動(dòng)最快，后面形成離子濃度低的電導(dǎo)區(qū)，低電導(dǎo)區(qū)形成高電壓梯度，帶動(dòng)中間的蛋白質(zhì)和最慢的甘氨酸離子移動(dòng)，甘氨酸有助于蛋白質(zhì)濃縮成一