綜述—試論述噬菌體溶菌機(jī)制的研究進(jìn)展

試論述噬菌體溶菌機(jī)制的研究進(jìn)展 姓名：caohaichuan 學(xué)號： 專業(yè)：微生物學(xué) 摘 要：噬菌體（bacteriophage，簡稱 phage）主要通過抑制宿主 細(xì)胞細(xì)胞壁的合成導(dǎo)致宿主菌溶解及通過溶解酶作用破壞宿主細(xì)胞 壁，以大腸桿菌單鏈 RNA 噬菌體 Q，真菌線狀單鏈 DNA（ssDNA） 微小病毒 X174 噬菌體和單鏈 DNA 噬菌體 MS2 及大腸桿菌 噬菌 體為例，分別論述噬菌體的兩種溶菌機(jī)制。 噬菌體 S 和 R 基因分 別編碼穿孔素（holin）和內(nèi)溶素（endolysin），形成穿孔素-內(nèi)溶 素（holin-endolysin）系統(tǒng)達(dá)到溶解宿主菌的目的。進(jìn)一步揭示該 系統(tǒng)溶解基因的協(xié)調(diào)作用及相關(guān)基因的調(diào)控機(jī)制。 關(guān)鍵詞：噬菌體；溶解酶；細(xì)胞壁；穿孔素；內(nèi)溶素 噬菌體是感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒的 總稱，因部分能引起宿主菌裂解，故稱為噬菌體。它在宿主菌內(nèi)可 高效復(fù)制,迅速地形成數(shù)百個子代噬菌體顆粒,每一個子代顆粒具備 相同的侵襲、繁殖能力,重復(fù)4個感染周期后,一個噬菌體顆?？蓺?數(shù)10 億個細(xì)菌,這是噬菌體極具特色的一種生物學(xué)特性。其溶菌機(jī) 制主要包括兩個方面，一個是通過抑制宿主細(xì)胞細(xì)胞壁的合成導(dǎo)致 宿主菌溶解；另外一個方面是通過溶解酶作用導(dǎo)致宿主細(xì)胞壁的破 壞。這兩個方面都能夠有效的進(jìn)行破壞宿主菌細(xì)胞壁的合成，從而 達(dá)到溶菌的目的?；谑删w溶菌機(jī)制，在治療細(xì)菌感染、消毒以 及反生物武器等領(lǐng)域具有良好應(yīng)用前景，本文從以下幾個方面綜述 其最新研究進(jìn)展。 1. 噬菌體溶菌機(jī)制的研究 噬菌體包括兩種類型，溫和噬菌體和烈性噬菌體。其中具有溶 菌作用的是烈性噬菌體，亦稱毒性噬菌體。噬菌體對其宿主菌的溶 解是由專一溶解基因編碼的特異性蛋白或噬菌體自身蛋白介導(dǎo)的溶 解系統(tǒng)統(tǒng)一完成的，這一溶解系統(tǒng)具有一套完整、精密的調(diào)節(jié)機(jī)制 和控制體系，而且其作用基質(zhì)多集中宿主菌的細(xì)胞壁上，噬菌體蛋 白通過不同的途徑影響和破壞宿主菌胞壁質(zhì)的生物合成及正常結(jié)構(gòu)， 從而導(dǎo)致噬菌體宿主菌細(xì)胞損傷、死亡。烈性噬菌體成功吸附宿主 菌后，就開始穿入溶菌過程，因其結(jié)構(gòu)和基因控制的不同而顯示出 不同的溶菌機(jī)制。 1.1. 通過抑制宿主細(xì)胞細(xì)胞壁的合成導(dǎo)致宿主菌溶解 該機(jī)制實際上是小基因組噬菌體的溶菌機(jī)制。缺乏溶壁酶的小 基因組噬菌體利用多肽在不同階段抑制宿主菌的胞壁質(zhì)合成酶，從 而在不同階段溶解宿主菌。例如大腸桿菌單鏈RNA噬菌體Q沒有獨 立的溶解基因，主要利用衣殼蛋白A2參與宿主菌的溶解。A2蛋白是一 種多功能的單拷貝蛋白質(zhì), 有吸附性菌毛、保護(hù)噬菌體RNA抵抗外部 核糖核酸酶( RNA酶)、溶解宿主菌的作用。A2蛋白抑制宿主菌胞壁 質(zhì)生物合成關(guān)鍵步驟的催化劑MurA，通過靶向正常細(xì)胞胞壁生物合 成途徑中的不同階段的酶而導(dǎo)致新合成的肽聚糖降解，從而逐漸使 宿主細(xì)胞溶解。 此外，真菌線狀單鏈DNA（ssDNA）微小病毒X174噬菌體只含 有10個基因，其溶菌機(jī)制是產(chǎn)生單一的溶解蛋白E。蛋白E由必須基 因D編碼，有91個包含在+1區(qū)的密碼子讀框中，可有效抑制肽聚糖合 成酶Mra Y1，Mra Y是介導(dǎo)肽聚糖合成中最初的脂質(zhì)聯(lián)合的催化劑。 研究表明，E蛋白還可以抑制特殊的肽聚糖前體物質(zhì)二氨基庚酸進(jìn)入 細(xì)胞壁2，從而抑制真菌細(xì)胞壁的合成，可代替抗生素抑制真菌細(xì) 胞。類似的還有單鏈DNA噬菌體MS2，該噬菌體只含有4個基因，其中 溶解基因L重疊在宿主菌表膜，而且在+1區(qū)復(fù)制，編碼一個75個氨基 酸的膜蛋白介導(dǎo)宿主菌的溶解。 1.2. 通過溶解酶作用導(dǎo)致宿主細(xì)胞壁的破壞 除了絲狀噬菌體以外(絲狀噬菌體并不裂解宿主菌,而是以分泌 形式擴(kuò)增噬菌體病毒顆粒) ,幾乎所有的噬菌體都是通過引起宿主細(xì) 胞溶解來結(jié)束它們的感染周期的3。其中雙鏈DNA噬菌體的溶菌方式 就是利用溶壁酶溶解、破壞其宿主菌的細(xì)胞壁而達(dá)到裂解細(xì)菌的目 的。溶壁酶可以打開細(xì)胞壁上各種分子的共價鍵使細(xì)胞壁水解,從而 殺死細(xì)菌。通過對大腸桿菌的噬菌體研究發(fā)現(xiàn),噬菌體具有4個 溶解基因，包括S、R、RZ和RZ1 ,它們積聚在單一晚期基因啟動子 pR溶解片夾下游的重疊簇中4。然而，噬菌體的4個溶解基因中 只有S和R是宿主細(xì)胞溶解所必需的,S和R編碼的穿孔素和內(nèi)溶素兩種 蛋白能夠直接導(dǎo)致宿主菌的溶解5。而RZ和RZ1只有當(dāng)外膜被毫克分 子濃度的二價陽離子固定后才具溶解作用。 基因S編碼的產(chǎn)物為穿孔素，其作用是在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層上 形成跨膜“孔洞”，使基因R產(chǎn)生的酶可以穿過細(xì)胞膜，到達(dá)細(xì)胞壁， 達(dá)到降解細(xì)胞壁的目的6?；騌編碼產(chǎn)物為內(nèi)溶素，是一種可溶解 的細(xì)胞質(zhì)糖基轉(zhuǎn)移酶，也是一種能夠水解細(xì)胞壁的溶壁酶，這種可 溶性蛋白能破壞3類不同的肽聚糖多聚體的共價鍵，具有溶壁活性7。 在宿主菌內(nèi)，S或R單一作用時，對宿主菌無明顯溶菌功效，只有基 因S和基因R協(xié)同作用時，才能夠作用于肽聚糖，破壞細(xì)胞壁，是宿 主菌溶解，即穿孔素-內(nèi)溶素系統(tǒng)。噬菌體就是利用穿孔素-內(nèi)溶 素系統(tǒng)溶解宿主菌的。 2. 穿孔素-內(nèi)溶素系統(tǒng) 穿孔素-內(nèi)溶素系統(tǒng)能夠破壞宿主菌細(xì)胞壁，達(dá)到溶菌目的，但 是，由于內(nèi)溶素缺少一個單一序列，因此內(nèi)溶素必須與S基因協(xié)同作 用，才能作用于肽聚糖3。穿孔素-內(nèi)溶素系統(tǒng)溶菌機(jī)制主要是從宿 主菌內(nèi)部發(fā)揮溶菌作用，噬菌體進(jìn)侵入細(xì)菌體內(nèi)，依賴宿主菌的蛋 白質(zhì)等物質(zhì)合成大量的子代噬菌體，同時釋放大量的穿孔素和內(nèi)溶 素。然而大部分內(nèi)溶素因缺少信號肽序列，從而無法穿過細(xì)胞膜， 所以內(nèi)溶素需要依靠穿孔素，才能穿過細(xì)胞膜，到達(dá)細(xì)胞壁。但是， 在革蘭氏陽性菌中，由于其細(xì)胞壁肽聚糖層沒有外膜的保護(hù)，內(nèi)溶 素可以從外部直接作用于細(xì)胞壁的肽聚糖層，從而不依賴穿孔素， 就能直接溶解細(xì)菌。 2.1. 穿孔素 穿孔素是由基因S編碼的，基因S是由一個含有107個密碼子組成 的開放閱讀框（open reading frame,0RF），其顯著特征就是具有 雙起始基序特征，能夠編碼2個具有對抗功能的內(nèi)膜蛋白，S105和 S1078。S105含有105個氨基酸，具有跨膜結(jié)構(gòu)，并發(fā)揮穿孔素作 用，在脂質(zhì)雙分子層上形成“孔洞”，以便保證內(nèi)溶素能夠順利通 過細(xì)胞膜，作用于細(xì)胞壁。S107是一種抗穿孔素，可特異性抑制穿 孔素的功能4。當(dāng)穿孔素作用于細(xì)胞膜時，S107能夠調(diào)節(jié)S105功能， 防止過早形成跨膜“孔洞”。 2.2. 內(nèi)溶素 所有的雙鏈DNA噬菌體編碼至少一種胞壁水解酶，即內(nèi)溶素，在 噬菌體中，內(nèi)溶素是R基因編碼的產(chǎn)物。研究證明，內(nèi)溶素具有兩 個功能域，細(xì)胞壁結(jié)合域（CBDs）和酶活性域（EADs）10。內(nèi)溶素 緊緊的結(jié)合到細(xì)胞壁的肽聚糖層上的殘基上，使細(xì)胞溶解。然而， 酶活性域依靠酶的催化機(jī)制裂解細(xì)菌肽聚糖層的特定位點，破壞肽 聚糖層結(jié)構(gòu)。來自Mathias Schmelcher等人10的研究，發(fā)現(xiàn)兩種假 單胞菌噬菌體溶菌素KZ144和EL188對革蘭氏陰性菌具有溶解作用， 并具有一個N-端CBD和一個C-端EAD的結(jié)構(gòu)元件。其中，KZ144的N-端 可以非常緊密的結(jié)合到綠膿假單胞菌的細(xì)胞壁上并且能夠識別其他 革蘭氏陰性菌的肽聚糖，破壞肽聚糖層，裂解細(xì)胞壁。然而，最近 幾年的研究主要來是針對酶的活性域進(jìn)行的，來進(jìn)一步揭示內(nèi)溶素 的溶菌機(jī)制。 噬菌體內(nèi)溶素至少有4種不同的胞壁水解酶活性，包括糖苷轉(zhuǎn)移 酶，溶菌酶，酰胺酶和肽鏈內(nèi)切酶。內(nèi)溶素在穿孔素的協(xié)調(diào)下，沿 著跨膜“孔洞”穿過細(xì)胞膜作用于細(xì)胞壁，其中，糖苷轉(zhuǎn)移酶和溶 菌酶攻擊細(xì)胞壁上糖苷鍵連接的氨基糖；酰胺酶和肽鏈內(nèi)切酶攻擊 寡肽交聯(lián)鏈的氨基化合物和肽鍵11。從而破壞細(xì)胞壁，溶解宿主菌， 同時釋放大量的子代噬菌體顆粒。在革蘭氏陽性菌中，由于其細(xì)胞 壁肽聚糖層沒有外膜包裹，當(dāng)內(nèi)溶素從外部作用時，其能夠進(jìn)入到 肽聚糖層并破壞這些微生物體。因此，噬菌體產(chǎn)生的內(nèi)溶素具有與 抗生素一樣的效果，很大程度上避免了耐藥性。然而，在革蘭氏陰 性菌中，由于肽聚糖層有一層外膜保護(hù)，內(nèi)溶素?zé)o法自行穿過外膜 到達(dá)細(xì)胞壁。因此，對于革蘭氏陰性菌來說，內(nèi)溶素的溶菌機(jī)制是 較為復(fù)雜的。 3. 小結(jié) 大腸桿菌單鏈RNA噬菌體Q，真菌線狀單鏈DNA（ssDNA）微小 病毒X174噬菌體，單鏈DNA噬菌體MS2及大腸桿菌噬菌體通過不 同的溶菌機(jī)制特異性識別不同的宿主菌，作用于肽聚糖，從而破壞 宿主菌細(xì)胞壁，達(dá)到溶菌目的。噬菌體對宿主菌的溶解是由專一的 溶解基因編碼的特異性蛋白或噬菌體自身蛋白介導(dǎo)的溶解系統(tǒng)共同 完成的，調(diào)控機(jī)制通過協(xié)調(diào)作用，有效、準(zhǔn)確地完成溶菌過程。噬 菌體具有嚴(yán)格的宿主專一性，這就使得其在特異性殺傷宿主菌方面 具有很大優(yōu)勢。在疾病治療上，噬菌體與抗生素相比較，噬菌體不 僅能夠有效地控制疾病發(fā)生，而且還能有效避免病原體的耐藥性， 這是抗生素所不能比擬的。 噬菌體通過抑制細(xì)胞壁的合成或者通過溶壁酶作用來達(dá)到溶菌 目的，從分子水平上進(jìn)行研究，主要是由一些溶菌基因編碼的特異 性蛋白協(xié)同作用，這些溶解基因編碼的蛋白可以通過某一特定機(jī)制 作用于細(xì)胞膜和細(xì)胞壁上，在文章前面提到的兩種溶解基因S和R就 是如此的，基因S編碼的蛋白穿孔素通過作用于細(xì)胞膜使其形成跨膜 “孔洞”，從而使內(nèi)溶素（基因R編碼的蛋白）能夠更好的穿過細(xì)胞 膜并作用于細(xì)胞壁的肽聚糖層，最終溶解宿主菌?；騍編碼兩個具 有對抗作用的內(nèi)膜蛋白，S105和S107,S105蛋白的作用是引導(dǎo)內(nèi)溶素 穿過細(xì)胞膜，而S107的作用則是調(diào)節(jié)S105蛋白出現(xiàn)的時間，防止穿 孔素過早的形成跨膜“孔洞”，保證精確地調(diào)節(jié)穿孔素-內(nèi)溶素系統(tǒng)， 并有效溶解宿主菌。 由于噬菌體具有嚴(yán)格的宿主專一性，只能對特定的病原體產(chǎn)生 作用，噬菌譜較窄。隨著對噬菌體分子結(jié)構(gòu)和基因功能的深入了解， 對其溶菌機(jī)制的認(rèn)識將會更加深入和明確，以便解決噬菌體噬菌譜 較窄以及探索噬菌體溶菌機(jī)制的共同途徑等問題。為了實現(xiàn)噬菌體 在抗治療細(xì)菌感染、消毒和反生物武器及解決抗生素耐藥性等方面 的廣泛應(yīng)用，我們必須探索一種新型的，噬菌譜較廣的溶菌機(jī)制。 噬菌體溶菌機(jī)制的深入研究具有重大意義及廣闊的應(yīng)用前景，更是 我們今后研究的方向。 參考文獻(xiàn) 1F. SANGER, G. M. AIR, B. G. BARRELL, et al. Nucleotide sequence of Bacteriophage X174 DNAJ. Nature，1977，265: :687-695. 2Thomas G, Bernhardt, Ing-Nang Wang, et al. A protein antibiotic in the phage Q virion : diversity in lysis targetsJ. Science, 2001, 292:2326-2329. 3徐焰.噬菌體溶菌機(jī)制研究進(jìn)展J.重慶醫(yī)學(xué),2003,32(1):106-108. 4Angelika G，David L，Smith，et al. Dimerization between the holin and holin inhibitor of phageJ. J Bacteriol.，2000，182(21): 6075-6081. 5 Wang IN, Smith DL, Young R, et al. HOLINS: the protein clocks of bacteriophage infectionsJ. Annu. Rev. Microbiol., 2000, 54:799- 825. 6S. Tanaka, W. M. Clemons Jr. Minimal requirements for inhibition of MraY by lysis protein E from bacteriophage X174J. Molecular Microbiology, 2012,85(5):975-985. 7Michael D, Young R. Holins kill without warningJ. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98(16):9348-9352. 8Angelika G, Udo Blsi, Young R. Genetic and biochemical analysis of dimer and oligomer interactions of the S holinJ. J Bac