T細(xì)胞檢測技術(shù).ppt

T細(xì)胞檢測技術(shù),機(jī)體接受外來抗原及自身抗原刺激后，通過細(xì)胞免疫和體液免疫及相關(guān)系統(tǒng)協(xié)同作用，對抗原產(chǎn)生應(yīng)答。,T 細(xì)胞應(yīng)答： T細(xì)胞增殖 分泌細(xì)胞因子 細(xì)胞毒效應(yīng) 表達(dá)特定表面標(biāo)志,淋巴細(xì)胞,DNA合成,分化,母細(xì)胞,刺激物,細(xì)胞變大,細(xì)胞漿擴(kuò)大,空泡,核仁明顯,核染色質(zhì)疏松,一、淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗,1、原理,（1）形態(tài)學(xué)檢測,2、檢測方法,方法學(xué)評價,優(yōu)點(diǎn)：形態(tài)學(xué)方法簡便易行，普通光學(xué)顯微鏡便能觀察結(jié)果，適于基層實(shí)驗室應(yīng)用。 缺點(diǎn)：是依靠肉眼觀察形態(tài)學(xué)變化，判斷結(jié)果易受主觀因素影響，重復(fù)性和準(zhǔn)確性較差。,（2）3H-TdR摻入法（MTT法）,PHA 淋巴細(xì)胞（54h） 3HTdR摻入 （MTT被還原） 收集細(xì)胞，檢測射線（490nm吸光度）,優(yōu)點(diǎn)：3H-TdR摻入法敏感性高，客觀性強(qiáng)，重復(fù)性好。 缺點(diǎn)：但需一定設(shè)備條件，同時還存在放射性核素污染問題。,原理： CFSE等染料可連結(jié)到細(xì)胞內(nèi)蛋白的氨基酸群（PKH26能插入脂膜），并隨細(xì)胞分裂而分配到子代細(xì)胞中，每分裂一次，熒光強(qiáng)度減少一倍。 方法學(xué)評價 優(yōu)點(diǎn)：操作簡單；重復(fù)性強(qiáng)；安全； 缺點(diǎn)：CFSE可能干擾細(xì)胞增殖,（3）CFSE（PKH26等）染色法,二、T細(xì)胞分泌功能的檢測,T細(xì)胞經(jīng)各種絲裂原或特異性抗原刺激后,分泌的各種細(xì)胞因子,可借助免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)分別檢測細(xì)胞因子含量、生物學(xué)活性或基因表達(dá)水平，從而間接反映T細(xì)胞功能。,1、生物活性檢測,對于依賴于該細(xì)胞因子而增殖的細(xì)胞，細(xì)胞增殖程度與細(xì)胞因子含量呈正相關(guān)。 方法學(xué)評價 優(yōu)點(diǎn)：敏感（pg）；顯示細(xì)胞因子的活性； 缺點(diǎn)：影響因素多（同一細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，多種細(xì)胞因子呈現(xiàn)相同功能，細(xì)胞因子及其相應(yīng)受體同時分泌）；,2、免疫學(xué)檢測,（1）ELISA: 操作簡單，非特異性影響大； （2）ELISPOT: 高度的敏感性，可重復(fù)性強(qiáng)，抗原特異性精確； （3）ICS：可同時檢測產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞表型；需要樣本量大于ELISPOT，破膜后的細(xì)胞不能做進(jìn)一步功能檢測；,優(yōu)點(diǎn)：簡單，適用性廣，應(yīng)用特異的單克隆抗體，可檢測單一細(xì)胞因子的含量； 缺點(diǎn)：無法反應(yīng)細(xì)胞因子的生物活性；不同單克隆抗體檢測的結(jié)果不同；敏感性稍差（100pg）,方法學(xué)評價,（1）Realtime-PCR （2）分子雜交,2、分子生物學(xué)檢測,三、T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒實(shí)驗,特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）識別靶細(xì)胞表面特異性抗原，通過Fas途徑及顆粒酶途徑，介導(dǎo)靶細(xì)胞溶解。,1、51Cr釋放實(shí)驗,鉻酸鈉（Na251CrO4）中的六價鉻能被活細(xì)胞攝取，并在細(xì)胞溶解后以三價鉻的形式被釋放。 方法學(xué)評價 優(yōu)點(diǎn)：靈敏、特異，是CTL活性測定的經(jīng)典方法； 缺點(diǎn)：操作繁瑣；放射性；靶細(xì)胞51Cr自發(fā)釋放；,2、IC Assay（In vivo cytotoxicity Assay）,表達(dá)特定抗原的腫瘤細(xì)胞系經(jīng)CFSE標(biāo)記后，皮下注射入小鼠，被小鼠體內(nèi)抗原特異性CTL作用24小時后，取出腫瘤細(xì)胞，檢測其CFSE含量。 方法學(xué)評價 優(yōu)點(diǎn)：反應(yīng)體內(nèi)殺傷效果； 缺點(diǎn)：影響因素多；,四、T細(xì)胞表面標(biāo)志的檢測,特異性T淋巴細(xì)胞活化需要第一信號和第二信號。因此檢測CTL表面特異性受體或相關(guān)的表面標(biāo)志可以反映CTL的活化狀態(tài)。,1、Tetramer技術(shù),模擬T細(xì)胞活化的第一信號，構(gòu)建熒光標(biāo)記的MHC-肽復(fù)合物，被特異性T細(xì)胞識別。通過檢測標(biāo)記的熒光，反應(yīng)活化的特異性T細(xì)胞。 方法學(xué)評價 優(yōu)點(diǎn)：簡便，快速，敏感 缺點(diǎn)：成本高，受HLA型別的限制,2、表面標(biāo)志CD107a/b的檢測,CD107a/b表達(dá)于T細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)膜上，隨著脫顆粒作用，一過性表達(dá)于細(xì)胞表面