實(shí)驗(yàn)二鹼性磷酸酶的動(dòng)力學(xué)鑒定_第1頁
實(shí)驗(yàn)二鹼性磷酸酶的動(dòng)力學(xué)鑒定_第2頁
實(shí)驗(yàn)二鹼性磷酸酶的動(dòng)力學(xué)鑒定_第3頁
實(shí)驗(yàn)二鹼性磷酸酶的動(dòng)力學(xué)鑒定_第4頁
全文預(yù)覽已結(jié)束

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡介

實(shí)驗(yàn)二 鹼性磷酸酶的動(dòng)力學(xué)鑒定Km測定一、原理當(dāng)溫度、PH及酶濃度恒定的條件下,酶促反應(yīng)的初速度隨作用物濃度S增大而增大,但增大到一定限度時(shí),作用物濃度再增加,則反應(yīng)速度不再增加。此時(shí)反應(yīng)速度為最大速度(Vmax)。Michaelis Menten對酶促反應(yīng)速度與作用物濃度之間的這種關(guān)系進(jìn)行了大量實(shí)驗(yàn)研究,并于1913年提出了數(shù)學(xué)方程式,即著名的米一曼方程式:式中Km即為米氏常數(shù),Vmax為最大反應(yīng)速度,當(dāng)V=Vmax/2時(shí),則Km=S。Km是酶的特征常數(shù),測定Km是研究酶的一種方法。由于用Michaeis-Menten方程中的V與S作圖求Km,不方便,Lineweaver-Burk將上式變形,以4/V對1/S作圖,即: 作圖后,將各點(diǎn)連線延長,直線與橫軸的交點(diǎn)為 ,根據(jù)在橫軸上的截距,可以計(jì)算出該酶的Km。 本實(shí)驗(yàn)以鹼性磷酸酶為例,用磷酸苯二鈉為其作用物,鹼性磷酸酶能分解磷酸苯二鈉產(chǎn)生酚和磷酸,酚在鹼性溶液中與4氨基安替比林作用,經(jīng)鐵氰化鉀氧化生成紅色的醌衍生物,根據(jù)紅色深淺可測出酶活力高低。其反應(yīng)式如下: 利用在不同作用物濃度的條件下,測定的酶活性(A),按Lieweaver-Burk二氏法作圖,從x軸上的截距求得其Km值。 二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備(一)儀器 1.恒溫水浴2.滴定管3.有塞錐瓶4.721型分光光度計(jì)(二)試劑1. 0.04mol/L作用物液: 稱取10.16g磷酸苯二鈉(C6H5PO4Na22H2O),用煮沸后冷卻的蒸溜水溶解,并稀釋至1,000ml,加4ml氯仿防腐,貯于棕色瓶內(nèi),置冰箱內(nèi)保存,可用一周。2. 0.1mol碳酸鹽緩沖液(pH10.0): 稱取無水碳酸鈉6.36g及碳酸氫鈉3.36g,溶解于蒸餾水中,并稀釋至1,000ml.3. 鹼性磷酸酶液: 取純化的鹼性磷酸酶5mg,用pH10緩沖液配制成100ml,放置冰箱內(nèi)保存?;蛴米约禾崛〉柠|性磷酸酶液,用pH10緩沖液稀釋至57倍。4. 0.5mol/L NaOH溶液5. 0.3%4氨基安替比林: 稱取3g4氨基安替比林及碳酸氫鈉42g,用蒸餾水溶解,并稀釋至1,000ml,貯于棕色瓶中,放冰箱內(nèi)保存。6. 0.5%鐵氰化鉀: 稱取10g鐵氰化鉀及30g硼酸各溶于800ml蒸餾水中,溶解后兩液混合加水至2,000ml。置棕色瓶中,放冰箱內(nèi)保存。三、操作1. 取大試管7支,按下表操作:加入酶液,混勻之后立即計(jì)時(shí),各管在37水浴中準(zhǔn)確保溫15分鐘后,立即加入0.5Mol NaOH液1.0ml以終止反應(yīng)。2. 顯色 各管中加入0.3%4氨基安替比林1.0ml和0.5%鐵氰化鉀2.0ml,充分混勻,放置10分鐘,以0管為對照,在波長510nm下比色,記錄各管的吸光度。3. 作圖 所策測各管的吸光度代表各管中反應(yīng)速度V,以之為縱軸,以作用物濃度S為橫軸,在坐標(biāo)紙上連接各點(diǎn)作圖,觀察曲線的形狀。以各管吸光度值的倒數(shù) 為縱坐標(biāo),以作用物濃度的倒數(shù) 為橫坐標(biāo),作圖并求此酶的Km值。注意:采用兔肝提取堿性磷酸酶來測定其Km時(shí),一般可稀釋2-3倍,由于各實(shí)驗(yàn)室所用試劑等各種條件差異,酶活性可能有不同,所以在實(shí)驗(yàn)前應(yīng)作調(diào)節(jié),按本實(shí)驗(yàn)條件,用最高的作用物濃度管做實(shí)驗(yàn),所得到的吸光度應(yīng)調(diào)節(jié)在0.8以下,如酶活性過大,在規(guī)定的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)作用物分解過快,所測到的數(shù)值將與反應(yīng)初速度相差較遠(yuǎn),則所測的Km不準(zhǔn)。如酶活性過低則受測定方法的靈敏度限制。如從第一管加入酶液開始計(jì)時(shí),每隔1分鐘向下一

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 人人文庫網(wǎng)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評論

0/150

提交評論