細(xì)胞破碎與固液分離技術(shù).ppt

第二章 細(xì)胞破碎與固液分離技術(shù),獲取目的物質(zhì)的先期步驟,概述,生物分離的第一步是將生物機(jī)體從發(fā)酵液中分離，通常使用過(guò)濾和離心等方法。 發(fā)酵細(xì)胞的代謝產(chǎn)物有的分泌到細(xì)胞或組織之外，還有許多是存在于細(xì)胞內(nèi)部。 對(duì)于胞外產(chǎn)物只需直接將發(fā)酵液預(yù)處理及過(guò)濾，獲得澄清的濾液，作為進(jìn)一步純化的出發(fā)原液。,對(duì)于胞內(nèi)產(chǎn)物，則需首先收集菌體，進(jìn)行細(xì)胞破碎，使代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)入液相中，然后，再進(jìn)行細(xì)胞碎片的分離。 大多數(shù)情況下，抗生素、胞外酶、一些多糖及氨基酸等目標(biāo)產(chǎn)物存在于在發(fā)酵液中。 使胞內(nèi)產(chǎn)物釋放出來(lái)一般需要破碎細(xì)胞壁。細(xì)胞破碎的方法在生物化學(xué)領(lǐng)域中得到了很廣泛的運(yùn)用，但多數(shù)在小規(guī)模生產(chǎn)中，在大規(guī)模生產(chǎn)尤其是基因工程中應(yīng)用極少。,目的,破碎目的是使產(chǎn)物最大限度的釋放出來(lái) 同時(shí)，細(xì)胞破碎需要考慮對(duì)后期分離的影響。 材料和產(chǎn)物的特性、提純要求是選擇破碎方法的依據(jù)。,選擇的一般原則 A、提取產(chǎn)物在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，用機(jī)械法破碎 B、提取產(chǎn)物在細(xì)胞膜附近，用化學(xué)法 C、提取產(chǎn)物與細(xì)胞膜或細(xì)胞壁結(jié)合，可采用化學(xué)法和機(jī)械法結(jié)合的方法,破碎方法的選擇,破碎過(guò)程中應(yīng)注意的問(wèn)題 A、多種破碎方法相結(jié)合可產(chǎn)生很大優(yōu)勢(shì) B、對(duì)下游分離技術(shù)的影響：破碎顆粒清除，產(chǎn)物分離純化 C、在上游發(fā)酵階段，考慮到發(fā)酵過(guò)程和環(huán)境對(duì)破碎難易程度影響 D、菌種的培育及改造，胞內(nèi)產(chǎn)物 胞外產(chǎn)物,細(xì)胞結(jié)構(gòu)與破碎,為了破碎細(xì)胞，必須克服的主要阻力是網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的共價(jià)鍵。 在用酶法或化學(xué)法來(lái)溶解細(xì)胞壁時(shí)，細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成顯得特別重要，可用來(lái)作為選擇溶菌酶和化學(xué)方法的依據(jù)。,細(xì)胞破碎技術(shù),機(jī)械法,化學(xué)及生物化學(xué)法,物理法,破碎技術(shù),1、機(jī)械法 主要通過(guò)機(jī)械切力的作用使組織細(xì)胞破碎的方法，常用的器械有組織搗碎機(jī)、勻漿器、研缽和研磨、壓榨器等。,破碎技術(shù),2、物理法 （1）反復(fù)凍溶法 原理：因突然冷凍，細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成及胞內(nèi)外溶劑濃度的突然改變而破壞細(xì)胞。 方法：將待破碎的細(xì)胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。 特點(diǎn)：此法適用于組織細(xì)胞，多用于動(dòng)物性材料，對(duì)微生物細(xì)胞作用較差。,（2）急熱驟冷法 將材料投入沸水中，維持85-90分鐘，至水浴中急速冷卻，此法可用于細(xì)菌及病毒材料。 （3）滲透破碎法 利用細(xì)胞內(nèi)外滲透壓差使水分進(jìn)入細(xì)胞而破碎。,3、化學(xué)及生物化學(xué)法 自溶法和酶溶法利用自身或制備酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎，需要進(jìn)行適當(dāng)處理。 酶溶法適用性廣、溫和且可控。 化學(xué)法利用有機(jī)試劑改變細(xì)胞壁或膜的通透性，也較溫和，但效率低，易造成污染。,比較,這些方法中，化學(xué)及生物化學(xué)法較溫和，細(xì)胞破壞后產(chǎn)物多數(shù)不會(huì)發(fā)生不可逆的變性，規(guī)模也容易放大，生產(chǎn)中最常用。機(jī)械法剪切力破壞較大，產(chǎn)生熱量，而且不容易規(guī)模放大，但設(shè)備較成熟，也常用；物理法處理量少，只用于實(shí)驗(yàn)室。,破碎率的測(cè)定,1、直接測(cè)定法 設(shè)備：顯微鏡、電子微粒計(jì)數(shù)器 破碎前細(xì)胞數(shù) 破碎后細(xì)胞數(shù)：用染色法排除釋放物對(duì)計(jì)數(shù)的干擾。 如：碎的G+可染色呈G-的顏色。G染色法受損酵母亮紅色，未損酵母呈紫色。,測(cè)定釋放的蛋白質(zhì)量或酶的活力。通常將破碎后的細(xì)胞懸浮液離心，測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)的含量或酶的活力，并與所獲得的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)值直接比較。,目的產(chǎn)物測(cè)定法,原理：細(xì)胞破碎后，大量帶電荷的內(nèi)含物釋放到水相，電導(dǎo)率上升，而與破碎率的增加呈線性關(guān)系。 先制定標(biāo)準(zhǔn)曲線：微生物的種類(lèi)、處理的條件、細(xì)胞濃度、溫度和懸浮液中電解質(zhì)的含量 在同等條件下測(cè)其電導(dǎo)率，計(jì)算破碎率。,測(cè)定導(dǎo)電率,固液分離,固液分離將兩種不同狀態(tài)的物質(zhì)進(jìn)行區(qū)分，以便于后續(xù)工作，是重要的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)。,動(dòng)、植物組織、體液等 胞外產(chǎn)物 提取 發(fā)酵液 預(yù)處理 c分離 c破碎 碎片分離 初步純化 精制 制成品 培養(yǎng)液 加 熱 沉 淀 勻 化 離 心 沉 淀 分子篩 無(wú)菌過(guò)濾 酶反應(yīng) 調(diào) pH 離 心 超 聲 萃 取 吸 附 離 子 超 濾 絮 凝 過(guò) 濾 胞 溶 過(guò) 濾 萃 取 親 和 凍 干 錯(cuò)流過(guò)濾 研 磨 錯(cuò)流過(guò)濾 超 濾 吸 附 噴 干 憎 水 結(jié) 晶 電 泳,生物分離工作的一般過(guò)程,利用一種能將固體微粒截留而讓流體通過(guò)的多孔介質(zhì)，將固體微粒從氣體中或液體中分離出來(lái)。,過(guò)濾,織物介質(zhì)：最常用的過(guò)濾介質(zhì)，工業(yè)上稱(chēng)為濾布(網(wǎng))，由天然纖維、玻璃纖維、合成纖維或者金屬絲編織而成?？山亓舻淖钚☆w粒的直徑為5-65微米。 多孔固體介質(zhì)：具有很多微細(xì)孔道的固體材料，如多孔陶瓷、多孔金屬及多孔性塑料制成的管或板，能截留1-3 m的微小顆粒。 堆積介質(zhì)：由沙、木炭之類(lèi)的固體顆粒堆積而成的床層，稱(chēng)作濾床，用作過(guò)濾介質(zhì)使含少量懸浮物的液體澄清。 多孔膜：用于膜過(guò)濾的各種有機(jī)分子膜和無(wú)機(jī)材料膜。,過(guò)濾介質(zhì),過(guò)濾推動(dòng)力是指濾餅和過(guò)濾介質(zhì)兩側(cè)的壓力差。此壓力差可以是重力或人為壓差。增加過(guò)濾推動(dòng)力的方法有： 1、增加懸浮液本身的液柱壓力，一般不超過(guò)50KN/m2，稱(chēng)為重力過(guò)濾。 2、增加懸浮液液面的壓力，一般可達(dá)500KN/m2稱(chēng)為加壓過(guò)濾。 3、在過(guò)濾介質(zhì)下面抽真空，通常不超過(guò)真空度86.6KN/m2，稱(chēng)為真空過(guò)濾。 此外，過(guò)濾推動(dòng)力還可以用離心力來(lái)增大，稱(chēng)為離心過(guò)濾。,過(guò)濾推動(dòng)力,過(guò)濾阻力包括介質(zhì)阻力和濾餅阻力。 大多情況下，過(guò)濾阻力主要取決于濾餅阻力。,過(guò)濾阻力,Darcy定理 U = (1/A)(dQ/dt)為流體的速度 (in: m/s)， p = 壓力差 (in: Pa)， l = 床層厚度 (in: m)， K = Darcys 滲透系數(shù)，與流體和床層的性質(zhì)有關(guān)。,過(guò)濾理論,板框壓濾機(jī) 轉(zhuǎn)筒真空過(guò)濾機(jī) 帶式真空過(guò)濾機(jī) 離心過(guò)濾機(jī),過(guò)濾設(shè)備,板框壓濾機(jī)的構(gòu)造 由許多塊帶凹凸紋路的濾板與濾框交替排列組裝而構(gòu)成。 濾板和濾框多做成正方形 ，角上均開(kāi)有小孔，組合后即構(gòu)成供濾漿和洗滌水流通的孔道。濾框的兩側(cè)覆以濾布，圍成容納濾漿及濾餅的空間。,板框壓濾機(jī),實(shí)驗(yàn)用板框壓濾機(jī),工業(yè)用板框壓濾機(jī),啤酒過(guò)濾,應(yīng)用：大規(guī)模生物分離的主要過(guò)濾設(shè)備，用于較難分離的低黏度發(fā)酵液 優(yōu)點(diǎn)：、大規(guī)模，、自動(dòng)化、操作簡(jiǎn)單，、濾布裝卸容易、易保養(yǎng)維護(hù)。 缺點(diǎn)：、占地大，單位體積利用率低，、周期性中斷進(jìn)料、濾布利用率低，、壓力低，僅應(yīng)用于低黏度發(fā)酵。,轉(zhuǎn)筒真空過(guò)濾器,預(yù)涂層真空轉(zhuǎn)鼓過(guò)濾機(jī)一般用于含粘性雜質(zhì)物料的連續(xù)過(guò)濾，其優(yōu)點(diǎn)是雜質(zhì)分離徹底、過(guò)濾速度快、勞動(dòng)強(qiáng)度低和工作區(qū)環(huán)境好，其缺點(diǎn)是需消耗硅藻土助濾劑。 用戶因根據(jù)物料狀況、生產(chǎn)規(guī)模及產(chǎn)品檔次等諸多因素來(lái)綜合考慮是采用預(yù)涂層真空轉(zhuǎn)鼓過(guò)濾機(jī)還是板框壓濾機(jī)。淀粉糖行業(yè)一般將其用于糖化液過(guò)濾以除去其中的不溶性蛋白。,轉(zhuǎn)筒真空過(guò)濾器,連續(xù)水平真空帶式過(guò)濾機(jī)是一種自動(dòng)化程度高的新型過(guò)濾設(shè)備，該機(jī)以過(guò)濾布或?yàn)V網(wǎng)為介質(zhì)，使料漿水平布置于過(guò)濾介質(zhì)之上，充分利用料漿重力和真空吸力實(shí)現(xiàn)固液分離。連續(xù)水平真空帶式過(guò)濾機(jī)可適用于多種濃度條件下的物料，過(guò)濾效率高，因而被諸多工業(yè)部門(mén)優(yōu)先采用。,帶式真空過(guò)濾器,如何選擇過(guò)濾器？,過(guò)濾媒介,過(guò)濾器類(lèi)型,其它要求,1、濾液的澄清度 2、顆粒大小的分布 3、發(fā)酵液的黏度 4、固體顆粒的濃度 5、濾餅的干燥度 6、濾餅的洗滌 7、生產(chǎn)能力,離心分離技術(shù),借助離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小和不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù) 細(xì)胞的收集、細(xì)胞碎片和沉淀的分離等常用離心分離 超速離心技術(shù)已成為分離、純化、鑒別和各種生物大分子的重要手段之一,與哪些因素有關(guān)？,顆粒的沉降速度與其自身質(zhì)量、大小和密度相關(guān)。 介質(zhì)分子也會(huì)影響沉降速度，尤其針對(duì)小顆粒和作用力強(qiáng)的物質(zhì)。,離心時(shí)受力情況,固定角度,水平,重力同離心力相比可以忽略,離心加速度： Stocks Force(粘滯力)： 離心沉降速度： 分離因子定義Fr：離心力/重力加速度(g)的比值： 意義：衡量離心設(shè)備的離心程度的重要技術(shù)參數(shù)，用于離心機(jī)的分類(lèi),離心分離原理,從Stokes公式 可看出沉降速度與影響因素的關(guān)系： (1) 密度差（S- l)越大，離心沉降速度越快; (2) 在密度差（S- l)存在下, 固體顆粒尺寸越大, 越容易離心; (3) 液體黏度l越大，越不容易離心。 (4) 離心力(r2)的大小對(duì)固液分離很有影響，細(xì)胞懸浮液或細(xì)胞勻漿中的顆粒尺寸都不大，與液相的密度差也不大，而且液體黏度常常較大，所以要通過(guò)增大離心力來(lái)提高分離效率。 由于離心機(jī)半徑 (r) 過(guò)大會(huì)造成不平衡和振動(dòng)，一般高速離心機(jī)都采用增加轉(zhuǎn)速來(lái)增大分離能力。,影響沉降的因素,沉降系數(shù),沉降系數(shù)為顆粒在單位離心力作用下的沉降速度。 物理意義是顆粒在離心力作用下，從靜止?fàn)顟B(tài)到達(dá)極限速度所經(jīng)過(guò)的時(shí)間。,相對(duì)離心力,相對(duì)離心力是指在離心力場(chǎng)中，作用于顆粒的離心力相當(dāng)于地球引力的倍數(shù)。,RCF=1.118*10-5R(rpm)2,沉降時(shí)間,指在某一介質(zhì)中使一種球形顆粒從液體的彎月面沉降到離心管底部所需要的離心時(shí)間。 離心時(shí)間由實(shí)驗(yàn)要求和分離物質(zhì)的特性決定。,離心機(jī)的分類(lèi),按速度和離心力： 低速離心機(jī) 最大轉(zhuǎn)速6000rpm(r/min)，相對(duì)離心力(RCF)104g以下，用于細(xì)胞、菌體和培養(yǎng)基殘?jiān)确蛛x； 高速（冷凍）離心機(jī) 11042.5104rpm，相對(duì)離心力104105g，用于細(xì)胞碎片、較大細(xì)胞器、大分子沉淀物等分離； 超速離心機(jī) 轉(zhuǎn)速2.58104rpm，相對(duì)離心力5105g；用于DNA、RNA蛋白質(zhì)、細(xì)胞器、病毒分離純化；檢測(cè)純度；沉降系數(shù)和相對(duì)分子量測(cè)定等。,三種不同類(lèi)型的離心機(jī)的比較,分離形式,平衡允許誤差,應(yīng)用,離心分離法,差速離心： 差速離心是指采用不同的離心速度和離心時(shí)間，使不同沉降速度的顆粒分批分離的方法。,速度區(qū)帶離心 密度梯度離心是樣品在密度梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心，使沉降系數(shù)比較接近的物質(zhì)分離的一種區(qū)帶分離方法。 梯度介質(zhì)：為了使沉降系數(shù)比較接近的顆粒得以分離，必須配制好適宜的密度梯度系統(tǒng)。密度梯度系統(tǒng)是在溶劑中加入一定的溶質(zhì)制成的。這種溶質(zhì)稱(chēng)為梯度介質(zhì)。 常用的梯度介質(zhì)有蔗糖、甘油等。使用最多的是蔗糖密度梯度系統(tǒng)，其適用范圍是：蔗糖濃度560%，密度范圍1.021.30 g/cm3。,不連續(xù)密度梯度制備：移液管由濃到??；注射器由稀到濃。 連續(xù)密度梯度制備：控制各節(jié)點(diǎn)流速的混合制備法。,離心后形成不同大小不同形狀、具有一定沉降系數(shù)差異的顆粒在密度梯度溶液中形成若干條界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶。,等密度梯度離心 當(dāng)欲分離的不同顆粒的密度范圍處于離心介質(zhì)的密度范圍內(nèi)時(shí)，在離心力的作用下，不同浮力密度的顆?；蛳蛳鲁两?，或向上飄浮，只要時(shí)間足夠長(zhǎng)，就可以一直移動(dòng)到與它們各自的浮力密度恰好相等的位置（等密度點(diǎn)），形成區(qū)帶。這種方法稱(chēng)為等密梯度離心，或稱(chēng)為平衡等密度離心。,雙水相萃取技術(shù),雙水相現(xiàn)象是當(dāng)兩種聚合物或一種聚合物與一種鹽溶于同一溶劑時(shí)，由于聚合物之間或聚合物與鹽之間的不相容性，當(dāng)聚合物或無(wú)機(jī)鹽濃度達(dá)到一定值時(shí)，就會(huì)分成不互溶的兩相。 因使用的溶劑是水，因此稱(chēng)為雙水相。在這兩相中水分都占很大比例，活性蛋白或細(xì)胞在這種環(huán)境中不會(huì)失活，但可以不同比例分配于兩相，這就克服了有機(jī)溶劑萃取中蛋白容易失活和強(qiáng)親水性蛋白難溶于有機(jī)溶劑的缺點(diǎn)。,雙水相萃取,雙水相萃取是1896 年Beijerinck 把瓊脂和可溶性淀粉或明膠相混合時(shí)最早發(fā)現(xiàn)的。 1956年，瑞典倫德大學(xué)的Albertsson重新發(fā)現(xiàn)此體系并第一次用來(lái)提取生物物質(zhì)。 1979年，Kula和Kroner等人將雙水相體系用于從細(xì)胞勻漿液中提取酶和蛋白質(zhì)，使胞內(nèi)酶的提取過(guò)程大為改善。此后，對(duì)于雙水相體系的研究和應(yīng)用逐步展開(kāi)并取得很大進(jìn)展。,雙水相萃取,在提純有生理活性的生物物質(zhì)方面，與其他提取方法相比，它具有許多優(yōu)勢(shì)。 現(xiàn)在雙水相萃取已被廣泛用于蛋白質(zhì)、酶、核酸、病毒、細(xì)胞、細(xì)胞器等生物產(chǎn)品的分離和純化，并逐步向工業(yè)化生產(chǎn)邁進(jìn)，展現(xiàn)了在食品工業(yè)、生物學(xué)研究和生物工程方面的巨大應(yīng)用前景。,具有特殊的物理性質(zhì) 分相時(shí)間短 易于連續(xù)操作 雜蛋白和細(xì)胞碎片去除方便 具有生物適應(yīng)性,雙水相萃取的特點(diǎn),基本原理,兩種聚合物溶液混合時(shí)，熵的增加和分子間作用力決定其是否分相。前者與分子數(shù)量有關(guān)，后者與基團(tuán)互作有關(guān)。 大分子溶液中分子間作用力常占主導(dǎo)作用 存在空間排斥力的兩種混合物更容易分相，形成雙水相體系。,聚合物的不相溶性(incompatibility)： 當(dāng)兩種高分子聚合物之間存在相互排斥作用時(shí)，由于相對(duì)分子質(zhì)量較大，分子間的相互排斥作用與混合過(guò)程的熵增加相比占主導(dǎo)地位，一種聚合物分子的周?chē)鷮⒕奂N分子而排斥異種分子，當(dāng)達(dá)到平衡時(shí)，即形成分別富含不同聚合物的兩相。這種含有聚合物分子的溶液發(fā)生分相的現(xiàn)象稱(chēng)為聚合物的不相容性。