專題二動物細胞工程.ppt

動物細胞工程,動物細胞工程常用的技術手段：,動物細胞培養(yǎng)、 動物細胞核移植、 動物細胞融合、 單克隆抗體 動物細胞培養(yǎng)技術是其他動物細胞工程技術的基礎。,提問：,植物細胞工程常用的技術手段有哪些？,植物組織培養(yǎng), 植物體細胞雜交,燒傷病人圖片,異體皮膚移植圖片,思考與探究： 如何用細胞培養(yǎng)技術，為燒傷病人植皮？,取該患者的皮膚進行細胞培養(yǎng),獲得足量的細胞后再移植,一、動物細胞培養(yǎng),動物細胞培養(yǎng)就是從動物機體內(nèi)取出相關的組織，將它分散成單個細胞，然后，放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些細胞生長和增殖。,(一)、選材：,動物胚胎或幼齡動物的組織、器官，它們細胞增殖能力強，分裂旺盛，分化程度低，容易培養(yǎng)。,在進行動物細胞培養(yǎng)時，用胰蛋白酶分散細胞，說明細胞間的物質(zhì)主要是蛋白質(zhì)。動物細胞培養(yǎng)適宜的PH為7.27.4，此環(huán)境下胃蛋白酶（2.0）沒有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性較高。,（二）.分散成單個細胞,1、為什么細胞培養(yǎng)要分散成單個細胞培養(yǎng)？,細胞所需的營養(yǎng)容易供應，代謝廢物容易排除；,2、動物細胞生長特性：,細胞貼壁：,懸液中分散的細胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細胞貼壁。,要求：,培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿的內(nèi)表面光滑、無毒、易于貼附。,細胞的接觸抑制：,當貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時，細胞就會停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為細胞的接觸抑制。,（三）動物細胞培養(yǎng)過程：,動物胚胎或幼齡動物的組織、器官,細胞懸浮液,胰蛋白酶,10代細胞,原代培養(yǎng),傳代培養(yǎng),無限傳代,單個細胞,加培養(yǎng)液,動物組織細胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質(zhì)，將細胞網(wǎng)絡起來形成具有一定彈性和韌性的組織和器官。,（分解彈性纖維）,動物細胞的培養(yǎng)過程,幼齡動物,取動物器官 和組織,剪碎組織,胰蛋白酶處理,細胞培養(yǎng),單個細胞,1有關概念:,原代培養(yǎng)：從機體取出后立即培養(yǎng)的細胞為原代細胞。培養(yǎng)的第1代細胞與傳10代以內(nèi)的細胞稱為原代細胞培養(yǎng)。,傳代培養(yǎng)：將原代細胞從培養(yǎng)瓶中取出，配制成細胞懸浮液，分裝到兩個或兩個以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。,細胞株：原代細胞一般傳至10代左右細胞生長停滯，大部分細胞衰老死亡，少數(shù)細胞存活到4050代，這種傳代細胞為細胞株。,細胞系：細胞株傳代至50代后又出現(xiàn)細胞生長停滯狀態(tài)，只有部分細胞由于遺傳物質(zhì)的改變，使其在培養(yǎng)條件下可以無限制傳代，這種傳代細胞為細胞系。,細胞株和細胞系的區(qū)別： 細胞系的遺傳物質(zhì)改變，具有癌細胞的特點，失去接觸抑制，容易傳代培養(yǎng)。,如何界定原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)？,遺傳物質(zhì)改變,體外細胞生長增殖過程,原代培養(yǎng)期（10代細胞以內(nèi)） 傳代培養(yǎng)期（10代細胞以后） 細胞株：（1050代細胞） 細胞系：（50代細胞以后，細胞發(fā)生了癌變）,2、動物細胞培養(yǎng)條件：,(1) 無菌、無毒的環(huán)境 （添加一定量的抗生素，定期更換培養(yǎng)液）,(2) 營養(yǎng) （葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素、動物血清等。）,化學分類,微生物分類,物理分類,a.培養(yǎng)基的類型,天然培養(yǎng)基,合成培養(yǎng)基,固體培養(yǎng)基,液體培養(yǎng)基,選擇培養(yǎng)基,鑒別培養(yǎng)基,b、為什么對動物細胞進行培養(yǎng)時通常要添加血清？,血清中含有蛋白質(zhì)、氨基酸、葡萄糖、激素等，其中蛋白質(zhì)主要為白蛋白和球蛋白。其中有些氨基酸動物本身不能合成，必須由培養(yǎng)液提供。血清激素有胰島素、生長激素等及多種生長因子（如表皮生長因子、成纖維細胞生長因子、類胰島素生長因子等）血清還含有多種未知的促細胞生長因子、促帖附因子及其他活性物質(zhì)，能促進細胞的生長、增殖和貼附。因此，細胞培養(yǎng)時，要保證細胞能夠順利生長和增殖，一般需添加10%20%的血清。,動物細胞培養(yǎng)條件：,(1)無菌、無毒的環(huán)境 （添加一定量的抗生素，定期更換培養(yǎng)液）,(2) 營養(yǎng) （葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素、動物血清等。）,(3) 溫度和PH 36.5+（-）0.5度, 7.2-7.4,(4) 氣體環(huán)境： O2和CO2（95%空氣和5% CO2 ）,c、動物細胞培養(yǎng)液的主要成分是什么？較植物組培培養(yǎng)基有何獨特之處？,主要成分：葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素和動物血清等。,獨特之處有：1、液體培養(yǎng)基（動物體細胞大都生活在液體的環(huán)境） 2、成分中有動物血清等,d、動物細胞培養(yǎng)能否像綠色植物組織培養(yǎng)那樣最終培養(yǎng)成新個體？,不能，動物細胞培養(yǎng)只能使細胞數(shù)目增多，不能發(fā)育成新的動物個體,e、胰蛋白酶真的不會把細胞消化掉嗎？為什么？,胰蛋白酶除了可以消化細胞間的蛋白外，長時間的作用也會消化細胞膜蛋白，對細胞有損傷作用，因此必須控制好胰蛋白酶的消化時間。,細胞的全能性,細胞株、細胞系,植物體,培養(yǎng)結(jié)果,獲得細胞或細胞產(chǎn)物,快速繁殖、培育無病毒植株等,培養(yǎng)目的,葡萄糖、動物血清,蔗糖、植物激素,培養(yǎng)基特有成分,液體培養(yǎng)基,固體培養(yǎng)基,培養(yǎng)基性質(zhì),細胞增殖,原理,動物細胞培養(yǎng),植物組織培養(yǎng),比較項目,3、植物細胞和動物細胞培養(yǎng)的比較,（四）動物細胞培養(yǎng)應用,大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)生物制品（病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體）,作為基因工程中的受體細胞,培養(yǎng)的動物細胞可以用于檢測有毒物質(zhì)，判斷某種物質(zhì)的毒性,為治療和預防癌癥及其他疾病提供理論依據(jù),二、動物體細胞核移植技術:,將動物的一個細胞的細胞核，移入一個已經(jīng)去掉細胞核的卵母細胞中，使其重組并發(fā)育成一個新的胚胎，這個新的胚胎最終發(fā)育成動物個體。 用核移植的方法得到的動物稱為克隆動物,核移植,胚胎細胞核移植,體細胞核移植（難度高）,受體細胞：M期的卵母細胞,細胞質(zhì),細胞核,細胞核移植,多莉羊的培育過程,1、過程,供體細胞（供核）,細胞 培養(yǎng),體細胞,卵母細胞（減中期：供質(zhì)）,去核,無核卵母細胞,注入,細胞融合,雜種細胞,構(gòu)建重組胚胎,胚胎移植,代孕母體,新個體(與母體相同的個體),歸納:,1共分成兩大階段:核移植和胚胎移植,2取卵細胞作受體細胞的原因是:它是最大的細胞,易操作,它發(fā)育可直接表達性狀,3嚴格來說新個體有卵母細胞的細胞質(zhì)所以有兩個親本的性狀,胚胎移植技術,試管動物（嬰兒）培養(yǎng)過程,受精卵,應用前景,1、加快家畜遺傳改良進程 2、保護頻危物種 3、器官移植供體 4、利用生物反應器生產(chǎn)生物蛋白,存在問題,成功率低 存在健康問題,許多克隆動物表現(xiàn)出遺傳和生理缺陷，如體 型過大，異常肥胖，發(fā)育困難，臟器缺陷， 免疫失調(diào)等。,克隆動物食品的安全問題,1、在動物細胞培養(yǎng)過程中遺傳物質(zhì)發(fā)生改變的細胞是 -（ ） A細胞系 B細胞株 C原代細胞 D傳代細胞,2、動物細胞工程技術的基礎是 -（ ） A.動物細胞融合 B.單克隆抗體 C.胚胎移植 D.動物細胞培養(yǎng),A,D,3、用于動物細胞培養(yǎng)的組織和細胞大都取自胚胎或出生不久的幼齡動物的器官或組織，其主要原因是這樣的組織細胞 （ ） A.容易產(chǎn)生各種變異 B具有更強的全能性 C.取材十分方便 D分裂增殖的能力強,D,4.動物細胞培養(yǎng)與植物細胞培養(yǎng)的重要區(qū)別在于-（ ） A.培養(yǎng)基不同； B.動物細胞培養(yǎng)不需要在無菌條件下進行； C.動物細胞可以傳代培養(yǎng)，而植物細胞不能； D.動物細胞能夠大量培養(yǎng)，而植物細胞只能培 養(yǎng)成植株。,A,5、在動物細胞培養(yǎng)的有關敘述中，正確的是（ ） A動物細胞培養(yǎng)的目的就是為了獲得大量的細胞分泌蛋白 B動物細胞培養(yǎng)前要用胰蛋白酶處理使細胞分散 C細胞遺傳物質(zhì)的改變發(fā)生于原代培養(yǎng)過程中 D培養(yǎng)至50代后繼續(xù)傳代的細胞是細胞株,B,6、在動物細胞培養(yǎng)中有部分細胞可能在培養(yǎng)條件下無限制地傳代下去，這種傳代細胞稱之為（ ） A原代培養(yǎng) B傳代培養(yǎng) C細胞株 D細胞系,D,7、動物細胞培養(yǎng)的正確過程是（ ） A.原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)細胞株細胞系 B. 原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)細胞系細胞株 C.傳代培養(yǎng)細胞系原代培養(yǎng)細胞株 D. 原代培養(yǎng)細胞系傳代培養(yǎng)細胞株,A,8、下列與動物細胞培養(yǎng)有關的表述中，不正確的是（ ） A培養(yǎng)液通常含有葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素和動物血清 B原代培養(yǎng)的細胞一般傳至10代左右便會出現(xiàn)生長停滯 C動物細胞培養(yǎng)一般能夠傳到4050代，但其遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變 D動物細胞培養(yǎng)可用于檢測有毒物質(zhì)和獲得大量自身健康細胞,C,討論：,1.在體細胞的細胞核移植到受體卵母細胞之前，為什么必須先去掉受體卵母細胞的核？,為使核移植的胚胎或動物的遺傳物質(zhì)全部來自有重要利用價值的動物提供的體細胞，在供體細胞的細胞核移至受體細胞之前，必須將受體細胞的遺傳物質(zhì)去掉或?qū)⑵淦茐摹?培養(yǎng)的動物細胞一般當傳代至1050代左右時，部分細胞核型可能會發(fā)生變化，其細胞遺傳物質(zhì)可能會發(fā)生突變，而10代以內(nèi)的細胞一般能保持正常的二倍體核型。因此，在體細胞核移植中，為了保證供體細胞正常的遺傳基礎，通常采用傳代10代以內(nèi)的細胞。,2.用于核移植的供體細胞一般都選用傳代10代以內(nèi)的細胞，想一想，這是為什么？,3.你認為用上述體細胞核移植方法生產(chǎn)的克隆動物，是對體細胞供體動物進行了100%的復制嗎？為什么？,絕大部分DNA來自于供體細胞核，但其核外還有少量的DNA，即線粒體中的DNA是來自于受體卵母細胞。,此外，即便動物的遺傳基礎完全相同，但動物的一些行為、習性的形成與所處環(huán)境有很大關系，核供體動物生活的環(huán)境與克隆動物所生活的環(huán)境不會完全相同，其形成的行為、習性也不可能和核供體動物完全相同，從這一角度看，克隆動物不會是核供體動物100%的復制。,思考討論,1.動物細胞培養(yǎng)取材時，一般是取胚胎組織或幼齡動物的組織或器官，請解釋原因。,細胞的衰老與動物機體的衰老有著密切的關系，細胞的增殖能力與供體的年齡有關，幼齡動物細胞增殖能力強，有絲分裂旺盛，老齡動物則相反。所以，一般來說幼年動物的組織細胞比老年動物的組織細胞易于培養(yǎng)。同樣，組織細胞的分化程度越低，則增殖能力越強，所以更容易培養(yǎng)。,腫瘤組織或細胞 正常組織或細胞,拓展-動物組織或細胞培養(yǎng)的難易程度,幼體組織或細胞 老齡組織或細胞,分化程度低的組織或細胞 分化程度高的組織或細胞,思考與探究,2.動物細胞培養(yǎng)要經(jīng)過脫分化的過程嗎？為什么？,動物細胞培養(yǎng)不需經(jīng)過脫分化過程。因高度分化的動物細胞發(fā)育潛能變窄，失去了發(fā)育成完整個體的能力，所以，動物細胞也就沒有類似植物組織或細胞培養(yǎng)時的脫分化過程了。要想使培養(yǎng)的動物細胞定向分化，通常采用定向誘導動物干細胞，使其分化成所需要的組織或器官。,3.1997年，美國威斯康星州的一個奶牛場有一頭名叫盧辛達（Lucinda）的奶牛，年產(chǎn)奶量為30.8 t，創(chuàng)造了世界奶牛產(chǎn)奶量最高新紀錄。目前世界各國高產(chǎn)奶牛場奶牛，年平均產(chǎn)奶量一般為十幾噸，而我國奶牛產(chǎn)奶量年平均水平僅為34 t。 （1）能利用體細胞核移植技術克隆高產(chǎn)奶牛盧辛達嗎？請說明理由。,可以。盧辛達的產(chǎn)奶量很高，有高產(chǎn)奶的遺傳基礎，利用盧辛達的體細胞克隆的奶牛其遺傳物質(zhì)基本上全部來自該奶牛，其克隆牛具有高產(chǎn)的遺傳基礎，如果精心培育和飼養(yǎng)，有可能在世界范圍內(nèi)推廣，克隆牛再與高產(chǎn)的公牛自然繁殖，可得到很多高產(chǎn)的后代，從而加快奶牛改良進程。,該克隆牛不能無限制地推廣，其數(shù)量不宜過多，尤其是在小范圍內(nèi)不能無限的繁殖，以避免奶牛群出現(xiàn)近親繁殖而引起種質(zhì)衰退。,（2）如果將克隆高產(chǎn)奶牛盧辛達的任務交給你，你將如何對它進行克??？,從盧辛達耳朵（也可用別的組織、器官，耳朵在活體上容易取）上剪取一小塊組織，在體外培養(yǎng)獲得該組織（如軟骨組織）的細胞。從屠宰場取廢棄的牛卵巢，抽取卵母細胞體外培養(yǎng)成熟。用顯微針去除卵母細胞的核，再將耳細胞注入卵母細胞，用電刺激方法使卵母細胞與體細胞融合，這時供體核就進入了受體卵母細胞，再用電刺激或化學物質(zhì)激活注入了體細胞核的卵母細胞，使其完成減數(shù)分裂和發(fā)育過程。核移植胚胎在體外短時間培養(yǎng)后，挑選正常卵裂的胚胎植入經(jīng)同期發(fā)情處理的受體母牛體內(nèi)。,4.體細胞核移植技術在研究和應用上還存在什么問題？請你查閱資料，了解這方面的前沿動態(tài)。,研究方面：克隆動物基因組重新編程的機制尚不清楚，克隆技術效率低，克隆動物畸形率高、死亡率高、易出現(xiàn)早衰等問題。這些問題尚在研究中。 應用上：生產(chǎn)克隆動物費用昂貴，距大規(guī)模應用還有一定距離。,三、動物細胞融合（細胞雜交） 2個或多個動物細胞結(jié)合形成一個細胞的過程,細胞A,細胞B,雜種細胞,滅活的病毒,物理法 化學法,仙臺病毒 皰疹病毒 新城雞瘟病毒,離心振動電激,聚乙二醇,用滅活的病毒誘導動物細胞融合過程,動物細胞的融合與植物細胞之間融合,植物細胞雜交與動物細胞雜交的比較,細胞膜 流動性,種間、屬間、科間甚至動植物之間細胞融合都已獲得成功,四、單克隆抗體,由單個B淋巴細胞經(jīng)過無性繁殖（克隆），形成基因型相同的細胞群，這一細胞群所產(chǎn)生的化學性質(zhì)單一、特異性強的抗體稱為單克隆抗體。 特點： 特異性強、靈敏度高,如何大量生產(chǎn)單克隆抗體？,利用淋巴細胞產(chǎn)生抗體的功能 利用腫瘤細胞無限增殖的特性 利用細胞融合的技術將兩種細胞融合獲得具有淋巴細胞和腫瘤細胞特性的雜交瘤細胞 利用動物細胞培養(yǎng)技術大量培養(yǎng)雜交瘤細胞,細胞融合、篩選,足夠數(shù)量的、能產(chǎn)生特定抗體的細胞群,單克隆抗體,本過程利用了哪些原理？ 為什么選用小鼠骨髓瘤細胞與B細胞融合？,免疫原理，細胞融合原理和動物細胞培養(yǎng)原理,這樣融合成的雜交瘤細胞，繼承了雙親細胞的遺傳物質(zhì)，不僅具有B細胞分泌抗體的能力，而且還有無限增殖的本領，因而可以獲得大量單克隆抗體,單克隆抗體制備過程,單克隆抗體的應用,與常規(guī)抗體相比，單克隆