《組化抗原抗體》PPT課件.pptVIP

免疫組織化學(xué)技術(shù),(immunohistochemistry technique ) IHCT,醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院檢驗系 陳敏,免疫組織化學(xué)是根據(jù)抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，以細(xì)胞中特異成分為抗原，用標(biāo)記的抗體在組織細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對相應(yīng)抗原及其抗體進(jìn)行定性、定位、定量測定的一種免疫檢測技術(shù)方法。,基本原理： 抗原抗體反應(yīng),標(biāo)記化學(xué)反應(yīng),呈色化學(xué)反應(yīng),概 述,與IHCT相關(guān)的免疫學(xué)基礎(chǔ)： 抗原：能刺激機體引起抗體的產(chǎn)生，并與相應(yīng)抗體發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)抗體原。 抗體：針對某種抗原而產(chǎn)生的，并能識別相應(yīng)抗原，與其發(fā)生特異性結(jié)合,第一節(jié) 抗原 1. 概念 凡能刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答；并能與相應(yīng)的在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)稱為抗原（ Antigen，Ag ）。,刺激機體免疫系統(tǒng),特異性反應(yīng),特異性反應(yīng),抗原（圖示）,上頁,抗原主要具有兩方面的特性，抗原能引起機體產(chǎn)生抗體（和/或致敏淋巴細(xì)胞），稱之為免疫原性； 抗原還與相應(yīng)的抗體（及致敏淋巴細(xì)胞）發(fā)生特異性結(jié)合或反應(yīng)，稱為免疫反應(yīng)性。,Fujian Blood Center,/,2.抗原的化學(xué)結(jié)構(gòu) 一個天然抗原具有二種結(jié)構(gòu)， 一是高分子的載體（免疫原性） 二是抗原決定簇（特異性）,3.抗原的性質(zhì) 異物性、大分子、特異性為抗原的共同性質(zhì)，凡種系越遠(yuǎn)、分子量越大、構(gòu)型越復(fù)雜、抗原決定簇暴露越多，則其抗原性越強，特異性越高。,抗原的免疫原性,（一）異物性,（二）理化特性 1.分子量 2.化學(xué)組成和結(jié)構(gòu) 3.物理性狀,下頁,異物性,返回,概念：指該抗原與自身正常組織成分的差異 程度。,異物性分類 異種物質(zhì),同種異體物質(zhì),自身物質(zhì),完,理化特性 1.抗原的分子大小,分子量越大，免疫原性越強： 1.表面的抗原決定簇多，對淋巴 細(xì)胞的活化作用強。 2.大分子物質(zhì)溶于水中呈膠體狀，化學(xué)結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，不易被機體破壞或排除，體內(nèi)存留時間長。,2.化學(xué)組成和結(jié)構(gòu) 復(fù)雜 蛋白質(zhì)：大分子，免疫原性強。 多糖：細(xì)菌莢膜多糖有免疫原性。 核酸：免疫原性弱 核蛋白：有免疫原性。 類脂：無免疫原性,2.抗原分子的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu),氨基酸殘基的位置和間距與免疫原性關(guān)系,3.物理性狀 *含芳香族氨基酸較多的蛋白質(zhì)，免疫原性強，反之則較弱 *聚合體蛋白質(zhì)分子：免疫原性強 *單體可溶性蛋白質(zhì)分子：免疫原性弱,說明：抗原物質(zhì)化學(xué)成分和結(jié)構(gòu)越復(fù) 雜，其免疫原性就強。,抗原的特異性 1.即專一性能； 2.是免疫應(yīng)答的基本特點； 3.是免疫學(xué)診斷與防治的理論依據(jù)；,免疫反應(yīng)特異性的物質(zhì)基礎(chǔ)-抗原決定簇(antigenic determinant)或表位(epitope)： 是指抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團。,大多數(shù)蛋白質(zhì)抗原可有多個抗原決定簇,但由于空間位阻作用,在同一時間內(nèi)僅有部分抗原決定簇暴露和相應(yīng)的抗體結(jié)合。,抗原結(jié)合價：一個抗原分子上能與相應(yīng)抗體 分子結(jié)合的抗原決定簇總數(shù)。,共同抗原表位與交叉反應(yīng),*共同抗原（common antigen): 兩種不同抗原具有相同或相似的抗原決定簇， 互稱共同抗原。,*交叉反應(yīng)：由共同抗原決定簇刺激機體產(chǎn)生 的抗體可以和兩種共同抗原結(jié)合發(fā)生反應(yīng)。,天然抗原有多個抗原決定簇，故為多價抗原。,半抗原僅有一個抗原決定簇，故為單價抗原。,抗原的類型繁多，分類方法也很多，故抗原的名稱各種各樣。 根據(jù)溶解性抗原有可溶和不溶性兩類。,抗原的種類,返回,第二節(jié) 抗體 1.抗體的概念 抗體（antibody）是機體受抗原刺激后通過體液免疫應(yīng)答，由B淋巴細(xì)胞活化、增殖、分化的漿細(xì)胞合成并分泌的，能與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。,有關(guān)概念,免疫球蛋白:是漿細(xì)胞產(chǎn)生的球蛋白。 、抗體（antibodies, Ab）：是機體免疫細(xì)胞受抗原物質(zhì)刺激后產(chǎn)生的，能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合，并具有多種免疫學(xué)、生物學(xué)活性的球蛋白。 2、免疫球蛋白（immunoglobulins,Ig）：指具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體相似的球蛋白。,抗體是免疫球蛋白，而免疫球蛋白不都具有抗體活性。 抗體是生物學(xué)和功能上的命名， 而Ig是結(jié)構(gòu)和化學(xué)本質(zhì)上的概念。,免疫球蛋白的基本結(jié)構(gòu) (一)重鏈（heavy chain，H） 2條 輕鏈（light chain，L） 2條 (二)可變區(qū)（variable region, V區(qū)） 恒定區(qū)（constant region, C區(qū)） (三)鉸鏈區(qū)（hinge region） (四)結(jié)構(gòu)域,Ig單體的基本結(jié)構(gòu)是由二條相同的輕鏈和二條相同的重鏈組成，各自鏈間（輕重或重重鏈）由二硫鍵（SS）相連接，呈Y字構(gòu)型（圖解）,Ig分子的氨基酸構(gòu)型可分為 可變區(qū)（N-端）和恒定區(qū)（C-端）兩部份。,基本結(jié)構(gòu),基本結(jié)構(gòu),可變區(qū)（variable regions,V區(qū)） 位于免疫球蛋白多肽鏈的N端，占輕鏈的1/2與重鏈的1/4。 該區(qū)的氨基酸組成及排列順序隨抗體特異性不同而發(fā)生變化。 它賦予抗體以特異性。,恒定區(qū)（constant regions,C區(qū)） 位于免疫球蛋白多肽鏈的N端，占輕鏈的1/2與重鏈的3/4。 其氨基酸組成及排列順序都比較恒定。,抗體的基本結(jié)構(gòu) 人類Ig有五類， 即IgG、IgM、IgA、IgD、IgE，是由其分子結(jié)構(gòu)中相應(yīng)的重鏈（H鏈） 、 、 、 、 決定的。 重鏈不同，Ig的類型就不同。,抗體的特性 Ig都是大分子蛋白質(zhì)，既具有免疫原性，又具有能與相應(yīng)抗原結(jié)合的抗體活性。, 免疫原性的類屬特異性是由Ig分子的重鏈和輕鏈恒定區(qū)特定的氨基酸序列所決定。 抗體特異性結(jié)合抗原的活性位點存在于Ig的可變區(qū)。,Ig由B淋巴細(xì)胞衍生的漿細(xì)胞生成，主要以可溶性蛋白的形式存在于體液中。 Ig的主要生物學(xué)功能有：特異性結(jié)合抗原；活化補體；結(jié)合Fc受體等。 一個（IgG）抗體分子具有兩個抗原結(jié)合位點（兩價）。,血清型,同種異型 同一物種不同個體間的Ig分子所具有 (allotype) 特異性不同的抗原決定簇，遺傳標(biāo)志。,Ig具有與Ag特異性結(jié)合的特性，又有免疫原性。,同種型 同一物種所有個體間的Ig分子所共有 (isotype) 的抗原特異性。,獨特型 不同B細(xì)胞產(chǎn)生的Ig分子V區(qū)所具有 (idiotype) 抗原特異性標(biāo)志,免疫球蛋白水解片段 1.木瓜蛋白酶（Papain） IgG Fab段(fragment of antigen- binding,抗原結(jié)合 片段) Fc段（fragment crystalizable,可結(jié)晶片段） 2.胃蛋白酶（Pepsin） IgG F( ab)2 pFc 3.意義：闡明Ig分子生物學(xué)作用； 構(gòu)建基因工程抗體。,酶水解免疫球蛋白示意圖,Fab段(fragment antigen binding),F(ab)2段：大片段，功能同F(xiàn)ab段,木瓜蛋白酶 （papain),胃蛋白酶 (pepsin),Fc段(fragment crystallizable),pFc：小分子多肽碎片，無生物學(xué)活性,抗體的種類 依來源分免疫抗體； 天然抗體；自身抗體。 依反應(yīng)分完全抗體；不完全抗體。 依制備方法分 多克隆抗體； 單克隆抗體； 基因工程抗體。,抗體是免疫組織化學(xué)技術(shù)的最關(guān)鍵試劑與 示蹤工具。 按制備方法分類： 1、多克隆抗體(polyclonal antibody, PcAb) 2、單克隆抗體(monoclonal antibody, McAb) 3、基因工程抗體(genetic engineering antibody)。,1、多克隆抗體：是多個B淋巴細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的抗體混合物。 是將純化后的抗原直接免疫動物后，從動物血中所獲得的免疫血清。 特異性低，會產(chǎn)生抗體的交叉反應(yīng)。,2、單克隆抗體：是一個B淋巴細(xì)胞克隆分泌的針對單一抗原決定簇的抗體。 特異性強、抗體產(chǎn)量高。,McAb and PcAb,3、基因工程抗體又稱重組抗體 是指應(yīng)用NDA重組及蛋白工程技術(shù)對編碼抗體的基因按不同的需要進(jìn)行改造和裝配，經(jīng)導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞后重新表達(dá)的抗體。,抗體的類型,技術(shù)應(yīng)用類型： 1、特異性抗體（一級抗體） 2、抗抗體 （二級抗體） 3、標(biāo)記抗體,抗體的購置及注意事項 1.抗體的購置 目前商品化抗體已有上千種，一種抗體可以有數(shù)家公司生產(chǎn)，其質(zhì)量的好壞也存在很大差異，首先應(yīng)選擇一家好的生產(chǎn)公司，根據(jù)文獻(xiàn)提供的信息，選擇所需試劑的型號。,2.購置抗體的注意事項 (1)種屬：單克隆抗體，多克隆抗體 (2)能否用于石蠟切片 (3)稀釋度 (4)特異性，交叉反應(yīng) (5)用何種組織前處理形式 (6)包裝單位，價格,第三節(jié) 抗原抗體反應(yīng) 抗原與相應(yīng)抗體之間的特異性結(jié)合反應(yīng)。,基本原理,抗原抗體反應(yīng)原理,Ag決定簇和Ab分子超變區(qū)相互 作用(具有互補性與親和性) 分子表面特異的可逆的弱結(jié)合力 在極短距離內(nèi)才能發(fā)生,基本條件： 結(jié)合力 親和性 親水膠體轉(zhuǎn) 化為疏水膠體,抗原和抗體的結(jié)合是互補性的特異性結(jié)合 不形成牢固的共價鍵，通過非共價鍵結(jié)合 這種弱的結(jié)合力涉及幾種分子間的作用力,一、抗原抗體結(jié)合力,一、抗原抗體結(jié)合力,*1靜電引力 *2范德華引力 *3氫鍵結(jié)合力 *4疏水作用力,抗原抗體結(jié)合力示意圖,抗原,抗體,氫鍵結(jié)合力,O N,O N,H H,靜電引力,- -,+ +,范得華力,- +,+ -,+ -,- +,疏水作用力,排斥的水,抗原抗體反應(yīng)的特點,*1.特異性 *2.比例性 *3.可逆性,特異性（specificity）,*概念：某種抗原分子，只能與由它刺激所產(chǎn)生 的抗體結(jié)合而起反應(yīng)的專一性能。,*決定因素：由抗原決定簇和抗體分子超變區(qū)之 間空間結(jié)構(gòu)的互補性決定的。,*交叉反應(yīng)(cross reaction) 兩種不同的抗原 物質(zhì)具有部分相同或類似結(jié)構(gòu)的抗原決定簇， 則可與彼此相應(yīng)的抗體反應(yīng)。,特異性示意圖,*最適比(optimal ratio)或等價點(equivzlence point) 最迅速出現(xiàn)沉淀時的抗原抗體的濃度 比或量比。,比例性（proportionality）,等價帶(zone of equivalence)抗原與抗體分子比例合適的范圍。,帶現(xiàn)象：Ag與Ab比例不適而不出現(xiàn)可見反應(yīng)。 * 前帶(prezone) 抗體過量時。 * 后帶(postzone) 抗原過量時。,比例性示意圖,抗體過量,比例合適,抗原的量,抗原過量,免疫復(fù)合物沉淀的量,前帶,等價帶,后帶,可逆性（reversibility),概念：是指抗原與抗體結(jié)合成復(fù)合物后，在 一定條件下可解離為游離抗原與抗體的特性。,后抗原抗體仍保持原有特性。 解離條件：低pH、高濃度鹽等。 常用于解離抗原抗體復(fù)合物的物質(zhì)有： 3mol/L硫氰化鉀、pH2.4 0.1mol/L甘氨酸、 7mol/L尿素等。,抗原抗體反應(yīng)影響因素,一、反應(yīng)物自身因素 *抗原：1.理化特性 2.Ag決定簇數(shù)量 3.Ag決定簇種類 *抗體：1.來源 2.特異性與親和力 3.濃度,二、環(huán)境條件： *電解質(zhì)：0.85%NaCl *酸堿度：pH69 *溫度：1540,受體( receptor) 受體在細(xì)胞生物學(xué)中是一個很泛的概念,意指任何能夠同激素、神經(jīng)遞質(zhì)、藥物或細(xì)胞內(nèi)的信號分子結(jié)合并能引起細(xì)胞功能變化的生物大分子,存在于細(xì)胞膜、胞漿或細(xì)胞核內(nèi)。 不同的受體有特異的結(jié)構(gòu)和構(gòu)型。,受體與配體結(jié)合的特異性是受體的最基本特點，保證了信號傳導(dǎo)的正確性。 配體和受體的結(jié)合是一種分子識別過程，它依靠氫鍵、離子鍵與范德華力的作用使兩者結(jié)合，配體和受體分子空間結(jié)構(gòu)的互補性是特異性結(jié)合的主要因素。,考查題：,根據(jù)課題寫出應(yīng)用免疫組化技術(shù)部分實驗計劃（2000字）。,具體內(nèi)容包括：1-5部分 1、題目：應(yīng)突出實驗?zāi)康暮蛯ο螅?0字）。 2、前言：簡要介紹研究的背景資料，提出需要解決的問題，說明實